Способ получения биомассы

Союз Советскик СоциалистическиРеспублик К П Т 1 Дополнительный атенту -(32) тет Государст ииыи коССР изобрете крытий(31) о лелаи публиковано 071280.Бюллетень М ата опубликования описания 0712,ИностранцыКацухиса Осуги, Даизо Такеючи, Масахиро Хамада и Тамоцу Ка (Япония) 72) Авторы изобретени Иностранная Фирмаха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония)(71) Заявите 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ 2уют. штамм МееЬу 1 овоп Р 3193, при этом кул ут при температуре с РН бу 3-7.этом концентрация ме ьной среде составляе испол ГЕ КМ" ние в 37 СПр питат 4 об. атиед вироваы 35 нола в .до ации среия увели 60 л/анизмовкоростью0 л минОл/мин0 л/мин о 20 ас- аи рода ОПЭК вируют жащей в метанол, днего в ает обходии темпе- очтитель Изобретение относится к техйике выращивания микроорганизмов, используемых для получения биомассы на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода. 5Известен способ получения биомассы путем культивирования микроорганизмов - бактерий рода МеЬу 1 ощопаьна питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, источник азота и необходимые соли в условиях аэрации с последующим выделением биомассы одним из известных способов 111.Недостатком известного способа 15 является то, что испольэуемые в нем микроорганизмы не обеспечивают достаточно эффективного использования метанола и имеют невысокую скорость роста, вследствие чего содержание белка в биомассе невысокое и биом са не может быть использована в к честве пищевой добавки.Цель изобретения - повышение содержания белка в биомассе и возмож ность ее использования в качестве пищевой добавки.Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения биомассы из рода бактерий меейу 1 овопаь 3 фКроме того, скорость аэр ды в процессе культивирован чивают е 40 л/ 20 л/мин до /20 л/минКультивирование микроорг осуществляют с постоянной с аэрации среды, равной 10 л/2 или 20 л/20 л/мин или 40 л/2 или б 0 л/20 л/мин или 80 л/2 или 100 л/20 л/мин.Способ осуществляют след разом.Микроорганизмы - бактери Месбу 1 оаопаа-штамм МееЬу 1 ов ргоЬця ГЕ 11 М "Р Р 3193 культи на питательной среде, содер качестве источника углерода при этом концентрация после питательной среде не нревыш 4 об.Ъ, источник азота и не мые соли в условиях аэрацииКультивирование ведут пр ратуре среды 15-41 оС, преппно 35-37 фС и рН в пределах 5,3-9,1, предпочтительно 6,3-7.Скорость роста бактерий снижается постепенно, если концентрация метанола превышает 4 об., Метанол по мере увеличения размера колонии бактерий, в случае необходимости, добав- ляют в течение всего времени выращивания..4 ВСкорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с 40 л/20 л/мин до 60 л/20 л/мин. Культивирование микроорганизмов осуществляют также с постоянной скоростью аэрации среды, равной 10 л/20 л/мин или 20 л/20 л/мин, или 40 л/20 л/мин, или 60 л/20 л/мин, или 80 л/20 л/мин, или 100 л/20 л/минМаксимальное количество бактериальных клеток получают примерно через 48 ч после начала выращивания.Содержание грубого протеина в бактериальных клетках может быть рав ным, примерно 80Бактериальные клетки имеют высокую питательную ценность, не токсичны и обеспечивают получение источника протеина, добавляемого в корм и пищу.Используемый штамм МейЬу 1 овопая ргоЬць ГЕВМ-РР 3193 имеет следующие характеристики.Морфологические признаки.Форма и размер клеток: 1 или 2 до 3 цепная бацилла с размерами 0,5-0,7 ф 1,0-1,5 мкгл, клетки не обладают полиморфизмом, передвигаются при помощи единственного полярного жгутика, споры отсутствуют результат скрашивания по способу Грэма отрицательный.МорФологические свойства исследуют на клетках, выращенных в синтетической среде неорганических солей при 30 гС в течение 24-48 ч, содержащей, г (ЙН 4) НР 043,5; КНРО 1,5; КНРО 4 1,5;М 9504 7 НО 0,3; СаС 1 2 Н О 0,01; Ге 504 7 Н О 0,01", метанол 2 об., вода 1 л.Штамм не обладает устойчивостью относительно кислоты.Условия роста.На агаровой пластинке с культурой в синтетической среде неорганических солей бактерии быстро размножаются и образуют ровные, сплошные и выпуклые круглые колонии,Колонии полупрозрачные с блеском сероватого, белого или розового цвета.На скошенном агаре с культурой в синтетической среде неорганических солей рост бактерий наблюдается во всей среде. Колонии имеют нитевидную Форму с блеском сероватого, белого или розового цвета. Смешанной окраски не наблюдается.В чашке с бульонным агаром нет признаков роста или слабый рост. Колония имеет размеры менее 0,5 мм, после вырашивания 48 час при 30 С.Колония имеет ровную, круглую форму, блеск и прозрачность. На буЛьонном скошенном агаре нетпризнаков роста или слабый рост. В последнем случае колония имеет нитевидную Форму и прозрачность. На бульонной жидкости нет никаких признаков роста,На насыщенном желатиновом бульоне .нет никаких признаков роста, и желатина не разжижается,На лакмусовом молоке не наблюдается никаких изменений. Добавление 1метанола не производит никаких изменений.Физиологические свойства.Нитраты восстанавливает. Индол не образует.Сернистый водород не образует,.крахмал не гидролизует, лимонную кислоту не использует. Образование пигмента: образует небольшое количество желтого пигмента, растворимого в воде, в синтетической жидкой среде неорганических солей, Бактериальные клетки серовато-розовые.Использование источников азота. хлорид, сульФат, нитрат аммония, первичный и вторичный ФосФат аммония, мочевина, карбонат аммония и полиМочевину образует. Окисляется,катализ положительный,Условия роста: рН 5,3-9,1, предпочтительно 6.3-7,0.Температура 15-41 С, предпочтительно 35-370 С.Отношение к кислороду - аэроб.Образование газа и кислоты не наблюдается по способу Хью Лейфсова,Пара-оксибензоат не использует.Аммоний не образует. 35 ферментации сахаров (при наблюдении в течение 30 дней раствора пептона с добавлением 1 сахаров: 1.-арабиноэа; Д-ксилозаД-глюкоза, Д-манноза, Д-фруктоэа, Д-галактоза, мальтоза; сукроза, лактоза, треалоза,1.-рамноза, маннит, сорбит, глицерин, р крахмал) не образует.П р и м е р 1. Компоненты растворяют в 1 л ионообменной воды вколичестве, г:й Н 4 ) НР 04 3; КВАДРО. 1,5; К 2 НРО 1,5; М 9504 7 Н О 0,5;Ге 504.7 НО 0,1, получая раствор срН 7,0.Затем по 100 мл этого растворапомещают в несколько колб, емкостью300 мл, а после стерилизации в каждую колбу добавляют 1,6 г метанола, получая среду для выращивания бактерий Месйуовопаь ргоЬцз ЕЕЙМ-Р Р 3193, которые до этого выращивают на среде со скошенным агаром.Процесс ведут при взбалтывании культурц в.течение двух дней при р пептон в неорганических питательных растворах. Используют нитрат, нитрит, метиламин и экстракт дрожжей.30 С, Затем клетки отделяют в сепара торе, промывают ионообменной водой и сушат при 110 С до стабилизации веса, получая 7,2 г сухих клеток на 1 л культуральной жидкости.Выход составляет 45,0 в пересчете на добавленный метанол.П р и м е р 2. 200 мл метанола 1(объем/объем) вводят в ферментер емкостью 30 л, содержащий 20 л раствора при рН 7,0 следующего состава, г: (МН 4) ЦРО 4,0; КН 2 РО 4 1,0; КНРО 4 1,0; И 9504 7 НО 0,511 Ге 504 к 7 Н О 0,1 в 1 л йонообменной воды.Раствор стерилизуют и в эту среду засевают 2 объем/объемД бактерий ИейЬу 1 оопая ргоЬця ГЕКИ-Р Р 3193 которые до этого выращивают н той же среде.Процесс ведут при перемеинании со скоростью 500 об/мин, 35 С и аэрации со скоростьв 30 л/20 л/мин(1,5 объем/объем/мин) в течение 48 ч, при этом скоростью аэрации увеличивают постоянно до 40 л/ /20 л/мин, 2,0 объем/объем/мин/ и далее до 50 л/20 л/мин/ 2,5 объем/объем/мин и до 60 л/20 л/мин (3,0 объем/ /объем,мин.).В течение процесса выращивания рН поддерживают автоматически на уровне от 6,6 до 7,2 добавлением 14 аммиачной воды. Содержание метанола поддерживают автоматически так, что его потребление составляет от 0,3 до 1,0, а контроль осуществляют при помощи газовой хроматографии.Затем клетки отделяют в центробежном сепараторе, промывают ионообменной водой и сушат при 110 С до ста" билизации веса.Выход сухих бактериальных клеток составляет 25,0 г/л через 28 часов после начала выращивания, 40,7 г/л через 40 часов и 53,8 г/л - через 48 часов.П р и м е р 3. Готовят смесь при следуищем содержании компонентов, г: (МН 4) НР 04 4; (МН,) 250 М 0,8; КНР 04 1, 0; КНР 04 1,0; М 9507 НО 0,7; Мп 5044-6 Н 20 0,01; Сц 50 5 Н 0 0,01; СоС 1 6 Н О 0,01;Ге 501 780 0 11 п 5 7 Н 2 (1 011 СаС 12 2 НО О 011 (МН 4)б МоЪ 24 4 НО 0,01 компоненты растноряют в игйообменной воде, получая 1 л смеси.20 л указанной смеси подают в 30 л ферментер, стерилизуют при 120 оС 15 минут, добавляют 2 /объем/объел( метанола и получают среду для выращивания культуры, в последнюю засевают раствор культуры МесЬу 1 оопаь ргоЬць ГЕЙМ-Р Р 3193, которую пред" варительно выращивают 18 ч н среде того же состава (содержание метанола 1,0 Гобъем/объем 3 и 2,0 1 объем/ /объем 3 . Культуру выращивают 28 ч при 37 оС и перемешивании со скоростью 500 об/мин при скорости аэрации,30 л/20 л/мин 1,5 объем/объем 1 минрН среды поддерживают 6,6-7,2 сдобавлением 1 аммиачной воды. Кон-.центрацию метанола в среде выращивания контролируют при помо 1 и газовойхроматографии. Метанол непрерывнодобавляют микронасосом так, что егоконцентрация остается на уровне0,3-2,0 объем/объемв течениевсего процесса выращивания. Общеедобавляемое количество метанола дозанершения процесса выращивания составляет 1,035 г.Бактериальные клетки выделяют вцентробежном сепараторе при 110 Сдо стабилизации веса, получая 25,6 гсухих клеток на 1 л культуральнойжидкости, что соответствует производительности 49,5 в пересчете надобавленный метанол,Содержание грубого протеина соста 20 вляет 80,3.Скорость роста бактерий определяют при помощи измерения помутненияраствора для выращивания культурыколориметром.25 Максимальная удельная скоростьроста составляет 0,32 ч", а времяобразования 51 мин.П р и м е р 4. Бактерии того жештамма, как в предыдущих примерах,выращивают при помощи циклическогопроцесса при условиях, как и примере 3. Так как концентрация растворен.ного кислорода в растворе для выращи"вания культуры уменьшается с ростомклетокскорость аэрации среды нозрастает до 40 л/20 л/мин (2,0 объем/(2,5 объем/объем/мин) и наконец до60 л/20 л/мин (3,0 объем/объем/мин),последовательно и в момент, когда40 концентрация клеток в растворе достигает 43,6 г/л. Выращивание, какпроцесс периодического действия, переключается на "непрерывное" выращивание при помоци непрерывной пода"4 чи среды, аналогичной той, которуюиспользуют при "периодическому выращивании, в раствор со скоростьв разбавления 0,28 ч. Одновремено изферментера удаляют равное количествокультуральной жидкости, рН среды под.,держинают на уровне 6,6-7,2-добавлением 14 аммиачной воды,концентрацщометанола в процессе ныращиНания под"держивают на уровне от 0,3 до 1,01 объем/объем), а контроль осуществляют при помощи газовой хроматографии.Непрерывный процесс выращиванияпроводят при услониях наиболее высокой продуктивности 3,1 г/л в течениевсего процесса.П р и м е р 5. Бактерии того жештамма, как н примере 3, выращивают при таких же условиях при непрерывном процессе при скорости аэрации, 8 й 3 руппа П биомасожетисточых. ий показывают ении веса жив лении пищи не одвиж" нтрольшерсти и 1, П и аются. их орган рытия не клоненийор 6 30 л/20 л/мин (1,5 объем/объем/мин),Продуктивность составляет до 4,2 г/л. П р и м е р 6. Выращивание проводят, как в примере 3 того же штамма, непрерывно при тех же условиях, при скорости аэрации 40 л/20 л/мин (2,0 объем/объем/мин). Продуктивность составляет 5,6 г/л ч.Пр и и е р 7, Выращивание проводят, как в примере 3, непрерывно, при скорости аэрации 50 л/20 л/мин О (2,5 объем/объем/мин), Продуктивность составляет 7,3 г/л чП р и м е р 8, Выращивание проводят при тех же условиях с использованием того же штамма, как описано 15 в примере 3, непрерывно, при скорос- ти аэрации 60 л/20 л/мин (3,0 объем/ /объем/мин). Продуктивность составляет 8,1 г/л чП р и м е р 9, Непрерывное выра О щивание проводят при скорости аэрации 80 л/20 л/мин (4,0 объем/объем/ /мин) при тех же условиях, с использованием того же штамма, как в примере 3. Продуктивность составляет 9,3 г/л чП р и м е р 10. Непрерывное выращивание проводят при скорости аэра ции 100 л/20 л/мин (5 объем/объем/ /мин) при тех же условиях с использованием того же штамма, как в при- ЗО мере 3. Продуктивность составляет 12,2 г/л.ч. Результаты испыта что различие в увелиных, а также.в потре значительное. Внешне по блеску ности животные групп ной группы не различ Проверка внутрен групп при помощи вск живает каких-либо от мального состоянияП р и м е р 11, Проводят испытание, связанное с кормлением самцов крыс при использовании клеток Ме 1 Ьу 1 оаооаь ргоЬця ГЕКИ-Р Р 3193, выращенных в соответствии с описанными примерами.Испытание проводят на 60 крысах Вистера (возраст 3 недели) с применениегл основного корма, следующего состава,: казеин (без витаминов) 12,0; сахар 5,0; масло соевых бобов 6,0; витамин группы В 0,3; пшеничный крахмал 61,0; порошок целлюлозы 11,5; витамины А и 0 0,2; минеральные вещества 4,0, кроме того Г 1 а 5 еОЗ 0,2 г. После кормления крыс основным кормом в течение 5 дней их разделяют на 3 группы по 20 в каждой. Крысам первой группы продолжают давать непрерывно основной корм и используют в качестве контроля, а две другие группы подвергают испытанию и группе 1 дают в пищу основной корм без 12 витаминного казеина с добавлением 20 сухих бактериальных клеток по изобретению, а группа 11 - основной корм без 16 витаминного казеина с добавлением 10 сухих бактериальных клеток.Крысы трех групп получают корм указанного состава 5 недель. Одновременно фиксируют вес животных и количество потребляемого корма,Данные испытания приведены в таблице. Таким образом, полученна а имеет высокое качество и ыть использована в качеств ика протеина в кормах живо 1, Способ получения биомассы путем культивирования микроорганизмов-бакуерий рода Ме 1 Ьу 1 олопав -Заказ 8892/66 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Носква, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППЛ "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, источник азота и необходимые соли в условиях аэрации с последующим выделением биомассы одним иэ известных способов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью говышения содержания белка в биомассе и возможности ее использования в качестве пищевой добавки, иэ рода бактерий Месбу 1 овопаь используют штамм МесЬу 1 ощопаь ргобць РЕВМ-Р Р 3193, при этом культивирование ведут при температуре среды 35-37 фС и рН 6,3-7.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что концентрация метанола в питательной среде составляет до 4 об.В 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что скорость аэрации среды в процессе культивирования увеличивают с 40 л/20 л/мин до 60 л/20 лфмин,4. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что культивирования микроорганизмов осуществляют с постоянной скоростью аэрации среды равной 10 л/20 л/мин или 20 л/ /20 л/мин или 40 л/20 л/мин или 60 л/20 л/мин или 80 л/20 л/мин или 100 л/20 л/мин. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 15 1. Патент Великобритании Р 1420264, кл. С 6 Р , опублик.1976.