Способ получения челночного вектора

)4 С 12 И 15/О ЗОБРЕТЕНИ ПИСА Кемоут (ЛР)88.8)упсЬея 1 ячдгояуеаяг.ОГО ВЕКГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(33),ТР (46) 30.04.88. Бюл. Ф 16 (71) Джуридикал фаундейшн Дз Серо-Терапевтик Рисерч Инсти (72) Ацуси Миянохара, Акис Т и Кениси Мацубара (ЗР) (53) 575.224.2;577,2 (048) ( (56) РаЫо Ча 1 епгие 1 а ег.а 1. апй аяяешЫу оГ Ьераг.дг 1 я В.япгГасе апгреп рагг.1 с 1 ея Ы (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛНОЧ ТОРА(57) Изобретение относится к биотехнологии, к генетической инженерии, икасается челночного вектора, которыйсодержит фрагмент ДНК и фрагмент ДНКЕясЬегсЬа со 11 и может воспроизводиться как в Е.со 11, так и в дрожжах.Цель изобретения - создание высококопийного вектора. Для этого фрагментЕсо К 1 размером 8 кв, содержащий полипептидный Р 60 ген, молекулярной массой 60000 дальтон вводится в точкуЕсо КТ плазмиды рВР. 322 Е,со 1 д, в результате чего образуется плазмида,которая служит в качестве исходногопродукта для дальнейшего конструирования вектора рАТ 77.Изобретение относится к биотехнолОгии, а именно к генетической инженерии, и касается челночного вектора,который содержит дрожжевой фрагментДНК и фрагмент ДНК ЕясйегдсЬа со 1промотор кислой фосфатазы и можетвоспроизводиться как в Е,со 11, так ив дрожжах.Целью изобретения является созда рние высококопийного вектора.Для этого фрагмент Есо К 1 размером8 кв, содержащий полипептидный Р 60ген, молекулярной массой 60 000 дальтон вводится в точку Есо К 1 плазмиды 15рВК 322 Е.со 1 г, в результате чего образуется плазмида, которая служит вкачестве исходного продукта для дальнейшего конструирования вектора.рАТ 77, 20Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Фрагмент Есо К 1размером 8 кв, содержащий полипептидный ген Р 60 молекулярной массой 2560000 дальтон, получают из банка генов 8288 С, клонируют в Есо К 1 сайтплазмиды рВК 322 Е.со 1 г,Эту плазмиду переваривают с эндонуклеазой Ба 1 1 и сшивают ДНК-лигазой 30Т , образуя плазмиду рАТ 25, в которой удален из точки Яа 1 1 в фрагментген кислой фосфатазы 5,2 кв. Полученная плазмида рАТ 25 состоит из фрагмента плазмиды рВК 322 (примерно3,7 кв) от точки Есо К 1 до точки.Ва 1 1, который содержит ген стойкостик ампициллину, и фрагмента (примерно2,8. кв) от точки Есо К 1 до точкиЯа 1 1, содержащего дрожжевой ген кислой фосфатазы.В точку Есо К 1 указанной плазмидырАТ 25 вводят фрагмент Есо К 1 (1,4 кв),содержащий ген агя 1- игр 1, которыйвыделяют из плазмиды УК 7 посредством 45Есо К 1, в результате получают плазмиду рАТ 26. Указанный фрагмент агя 1 игр 1 имеет одну точку распознаванияограничительного фермента Ндпс 1 111в гене ггр 1.В точку Ндпс 1 111 указанной плазмиды рАТ 26 вводят Нпд 111 фрагмент,содержащий Ьец 2 и 2 рог, которыйполучают путем обработки плазмидырЯЬЕ 1 посредством Нпд 111 эндонукпеазы, в результате получают челночный вектор рАТ 77. Этот челночныйВектор в штамма БассЬагощусея сегеяхае АН 22 был сдан на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации,Агентство по промьпиленным исследованиям и технологии, Япония, ВиоареяГ Тгеа 1:у и ему присвоено официальное название "РЕКМ ВР".Полученный таким образом рАТ 77 (1 мкг) расщепляют Ба 1 1 эндонуклеазой и затем обрабатывают экзонуклеазой ВАЬ 31 (0,1 О) в растворе (50 мкл) 20 мМ Трис-НС 1 (рН 8,2), 12 мМ, СаС 1 12 мМ МрС 1, 12 М ИаС 1 и 1 мМ ЕДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению. Полученные осажденные продукты обрабатывают эндонуклеазой ХЬо 1 (1 ищ) и ДНК-лигазой Т . В течение 12 ч Е.со 1 х 1776 обрабатывают указанной реакционной смесью таким образом, что происходит трансформация Е,со 11 х 1776 и образуются стойкие к ампициллину трансформанты. Из колоний трансформантов получают плазмиды ДНК, Определяют нуклеотидную последовательность полученных ДНК, и зону гена кислой фосфатазы, удаляемую при обработке ВАЬ 31. Наряду с указанным ДНК отбирают и выделяют плазмиды рЛМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, которые полностью лишены структурного гена фосфатазы.Обозначая А в кодоне АТС, кодирую- щем первую аминокислоту (метиоиин) продукта Р 60 структурного гена фосфатазы как +1, отмечают, что в челночных векторах удалены следующиЕ зоны: вектор . рАМ 81 до +2; вектор рАМ 82 до -33; вектор рАМ 83 до-.50; и вектор рАМ 84 до. Векторы рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84 в ЯассЬагошусея сегедяае АН 22/рАМ 81, АН 22/рАМ 82, АН 22/рАМ 83, и АН 22/ /рАМ 84 соответственно были сданы на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, Вцс 1 ареяг Тгеагу, и им присвоены официальные названия, соответственно "ГЕКМ ВР", нЕЕКМ ВР 13", "РЕКМ ВР" и "РЕКМ ВР".Г р и м е р 2. Получают кровяную плазму, собранную от десяти пациентов (в количестве 700 мл), которые имеют положительную реакцию на НВяА 8 (небольшое отклонение от типа ас 1 г) и на НВеАя, и эту плазму центрифугируют при скорости вращения центрифуги 5000 об/мин в течение 20 мин с цельюудаления нерастворенных веществ. Полученный раствор центрифугируют притемпературе 4 С, при скорости вращения центрифуги 18 000 об/мин в тече 5ние 8 ч, и образующиеся осажденныепродукты снова растворяют в 10 мл буферного раствора (рН 7,5) 10 мИ,Трис-НС 1, О, 1 Г 1 Г 1 аС 1 и 1 М ЕДТА,Этот раствор вводят в верхнюю частьпробирки центрифуги, содержащей ЗОХсахарозы, и центрифугирование осуществляют при 4" С при скорости вращенияцентрифуги 39 000 об/мин в течение4 ч. Полученные осажденные продуктыповторно растворяют в таком же буферном растворе, что указан выше.Для того, чтобы облегчить описан= ную операцию, буферный раствор химически взаимодействует с НВУ ДНК полимеразой при обработке его в смеси (500 мкл) 67 мМ. Трис- НСТ (рН 7,5), 80 мМ МН СТ, 25 мм МИКСТ, 0,5 Г 1 Р 404 фм и (тергитол, выпускаемый фирмой Сигма 25 Ко"), О, 1 Ж 2-меркаптоэтанола, 330 мкл ИСТР (дезоксицитидинтрифосфат), ИСТР (дезоксигуанозинтрифосфат) и с 1 АТР (деоксиаденозинтрифосфат),0,5 мкмГ 32 Э йТТР (дезокситимидинтрифос Р 3Офат) при температуре 37 С в течение 3 ч, и в эту реакционную смесь вводят такой же объем 100 мМ раствора ЕДТА. В результате одноцепочечная ДНК удваивается до двуцепочечной ДНК, образуя35 меченый 132 3 продукт. Этот продукт вводят в пробирку центрифуги (свер- ху), в которой находятся слои 30, 20 и 107.-ного водных растворов сахарозы в указанном порядке, и осуществляют центрифугирование при температуре 4 С при скорости вращения центрифуги 39 000 об/мин в течение 4,5 ч.Для разрушения белков, прочно свяванных с ДНК, полученные осажденные продукты обрабатывают в смеси (200 мкл) 1 мг/мл проназы Е (изготавливается Фирмой Ка 1 сец Каоакц К.К) и 0,27.-ным водным раствором натрийлаурилсульфатао 50 при температуре 37 С в течение 2 ч. Полученную смесь дважды экстрагируют фенолом (200 мкл) и образующийся содержащий ДНК экстракт промывают простым эфиром с целью удаления феноль 55 ного растворителя, в результате чего получают раствор НВЧ ДНК. Образующаяся таким путем ДНК имеет удельную радиоактивность 2,5 х 10 отсч, (мин) мкг и может использоваться для вываривания ограничительнымИ ферментами.,Двухцепочечную кольцевую НВ 7 ДНК,полученную как описано выше, клонируют с использованием ДНК Л -фага Шарон16 А в качестве вектора, и затем сноваклонируют с использованием известнойплазмиды рА СУС 177 в качестве вектора следующим образом.НВЧ ДНК (20 нг) обрабатывают эндонуклеазой ХЬо Т в смеси (20 мкл)10 мИ Трис-НС 1 (рН 7,4), 7 мМ Г 1 дС 1 е,100 М ИаСТ и 7 мМ 2-меркаптоэтанолапри температуре 37 С в течение 2 ч.Полученную смесь экстрагируют фенолом(20 мкл) и затем простым эфиром и кводному слою добавляют двойной объемохлажденного этанола с целью осаждения ДНК. Смесь выдерживают при температуре -70 С в течение 1 ч и затем,центрифугируют при скорости вращенияцентрифуги О 000 об/мин в течение5 мин и осажденную ДНК извлекают.Отделенные таким образом осажденныепродукты растворяют в смеси (5 мкл)10 мГ 1 Трис-НС 1 (рН 7,4), и 1 мМ ЕДТАНВ 7 ДНК с равномолярным количествомДНК 3 -фага Шарон 16 А, полученнымпутем расщепления эндонуклеазой ХЬо 1и с ДНК-лигазой Т 1 смесь 50 мм ТрисНС 1 (рН 7,4), 10 м МяС 1, 10 мИ дитиотреитола, 100 мкг/мл альбуминателячей сыворотки, 0,5 мМ АТР и0,5 мкл Ферментного препарата лигазыТ, полученного фирмой "Такага Ьошедхса 1 з" Т - 5 х 10 ед/млпри температуре 4 С в течение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом ипростым эфиром и затем подвергаютосаждению этанолом таким же образом,как описано выше.Полученные таким образом осажденные продукты растворяют в смеси(10 мкл) 10 мИ Трис-НС 1 (рН 7,4) и1 мМ ЭДТА,Обработанную таким образом ДНК подвергают операции упаковки с образованием й -Фага и затем из него образуют колонии (10 ) на чашках (23 х х 23 см) с 1 -агаром с использованием Е.со 11 ДР 50 ЯцрГ в качестве индикатора. Эти колонии подвергают гибридизации с использованием меченой 32 Р НВ 7 ДНК с тем, чтобы отобрать образующиеся колонии из фага, имеющего НВЧ ДНК, в результате чего отделяют множество желаемых фагов.Из фага, включающего НВЧ ДНК, полученного как указано выше в разделе, приготавляют фаговую ДНК с использованием Е. со 1 ДР 50 - Вир Г в качестве заражаемых бактерий, Полученную таким образом ДНК переваривают ХЬо 1 в тех же условиях, что описаны выше, в течение 2 ч, и полученную реакционную смесь подвергают электрофорезу с 0,753-ным агарозным гелем, в результате чего извлекают НВЧ ДНК (3,2 кв).НВЧ ДНК адсорбируют на ДЕАЕ (диэтиламиноэтилцеллюлоза) бумаге (изготавливаемой фирмой Тоуо КозЬ, Япония)с целью отделения ее от вектора ДНК и затем элюируют 1 М водным раствором, в результате чего получают НВЧ ДНК, имеющую с обоих концов группы ХЬо 1.20Плазмиду рАСУС 177 с единственным сайтом ХЬо 1 в пределах гена стойкости к канамицину переваривают ХЬо 1, и полученный продукт очищают путем экстракции фенолом и обработки простым эфиром и осаждают э ганолом.Полученную таким образом ДНКрАСУС 177, расцепляют ХЬо 1 и смешивают с НВЧ ДНК с концом ХЬо 1, в малярном отношении 1:5, и смесь сшивают , ДНК-лигазой Т в течение 18 ч.ДНК (10 мкл), полученную как описано выше, вводят в жидкость, содер ,жащую Е.со 1 (0,1 мл), которую приготавливают путем обработки бульона выращивания Е.со 1х 1776, смесь тщательно перемешивают и выдерживают прио0 С в течение 25 мин. Зту смесь нано сят на чашку с 1,-агаром, содержащим ампициллин (20 мкг/мл), с-биотин (1 мкг/мл), диаминопимелиновую кислоту (100 мкг/мл) и тимин (20 мкг/мл) и термостатируют в течение ночи. По 4 лученные колонии наносят на чашку с агаром, содержащую канамицин(20 мкг/мл), и отбирают колонии, которые лишь на чашке с агаром, содержащей ампициллин рАСУС 177 содержит50стойкий к ампициллину ген и стойкийк канамицину,ген, но когда вводится НВЧ ДНК в сайт гена ХЬо 1 стойкости к канамицину, то он теряет стойкость к канамицину. В связи с этим отобранные колонии включают. соответственно рекомбинантную ДНК. Из отобранных таким путем колоний приготавливают плазмиду. Полученную плазмиду, т,е. рекомбинатную ДНК рАСУС 177-НВЧ (которую обозначают "рНВЧ") обрабатывают ХЬо 1 при тех же условиях, что описаны выше, в результате чего получают общий фрагмент НВЧ ДНК (3,2 кв). Кроме того, когда эту плазмиду обрабатывают ХЬо 1 и Вав Н 1, то получают фрагмент (примерно 1,3 кв), содержащий ген НВз А 8.НВЧ ДНК, полученную путем обработки плазмиды рНВЧ (рАСУС 177-НВЧ ДНК) посредством ХЬо 1, рекомбинирют с расщепленным ХЬо 1 челночным вектором, рАМ 82, в молярном отношении 5:1 путем термообработки с ДНК-лигазой Т при тех же условиях, что описаны выше. Е.со 1 х 1776 трансформируют данной реакционной смесью и плазмидную ДНК выделяют из стойких к ампициллину трансформантов таким же образом, как описано выше. Полученные таким путем ДНК анализируют различными ограничительными ферментами, такими как ХЬо 1 и НпЫ 111, и в результате определяют ввод НВЧ ДНК в векторы,и их направление.Полученные плазмиды, выражающие ген НВз Ар, включают ген НВз и ген НВс, идущие от гена кислой фосфотазы.Фрагмент гена НВз Ая (3 мкг), полученный путем расщепления плазмиды рНВЧ посредством Вав Н 1, обрабатывают ДНК полимеразой Т, (0,2 Б) в растворе (100 мкл) 67 мМ Трис-НС 1 (рН 8,6), 6,7 мМ МРС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,7 мМ ЕДТА и 16,7 мМ (МН)80, который содержит 200 мМ 1 АТР, 1 СТР, Ы ТТР и ЫСТР, в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить расщепленный Вав Н 1 конец. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции связывания со связующим звеном ХЬо 1 в мо" лярном отношении 1:10 с ДНК-лигазой Т в тех же условиях, что описаны выше. После экстракции фенолом и осаждения этанолом полученную плазмиду обрабатывают ХЬо 1, в результате чего получают фрагмент гена НВз А 8 (примерно 1,3 кв), имеющий по обоим концам ХЬо 1. Полученный фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, который расщепляют посредством ХЬо 3 в молярном отношении 5:1 с использо"ванием ДНК-лигазы Т , и Е.со 1 д х х 1776 трансформируют полученной реакционной смесью.Исходные дрожжи представляют собой Бассйагошусея сегечгядае АН 22 (а,5мт.ф1.ец 2, Ьхя 4, сап 1 ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследова- тельский Ийститут Ферментации, Агентство промышленных исследований и тех нологии, Япония, Вцйареяг ггеагу, где им присвоено официальное название "АТЕЯМ ВР", Эти исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей 2 полипептона, 1% дрожжевого экстракта и 2% глюкозы и смесь термостатируют при температуре 30 Со в течение ночи и после этого клетки извлекают путем центрифугирования. Извлеченные клетки промывают стерили зованной водой (20 мл) и суспензируют в растворе (5 мл) 1,2 м сорбита и 100 мкг/мл эимолиазы - 60 000 (поставляется фирмой БеЖаВа 1 ц КаВуо К.К., Япония), и суспензию выстаивают 25 при 30 С в течение 30 мин и в результате получают сферопласт. Приготовленный таким образом сферопласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза и затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ СаС 1 и 10 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5). Полученную суспензию разделяют на небольшие пробирки объемом 60 мкл. К суспензиидобавляют раствор рекомбинантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивания к нему добавляют 0,1 М СаС 1(3 мкл) до конечной концентрации СаС 110 мМ и смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 5 - 1 О мин. В каждую полученную смесь вводят 1 мл раствора 20 .-ного полиэтиленгликоля 4000, 10 мМ СаС 1 и 10 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5) и смесь отстаивают при комнатной 45 температуре в течение 20 мин. Полученную смесь (каждую по 0,2 мл) вводят в среду (10 мл), содержащую, %: сорбита 22, глюкоза 2, аминокислота 0,7 на основе дрожжевого азота, УРД 2, 20 мкг/мл гистидина и агара 3, который поддерживается при температурео45 С. После осторожного перемешивания смесь наносят на слой с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 М сорбита, которая была получена предварительно и содержит,: аминокислоты 0,7 на основе дрожжевого азота, глюкозы 2, 20 мкг/мл гистидина и агара 2, и оставляют на этом слое. Чашку термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту ко-, лонию термостатируют в минимальной питательной среде ВцгЕЬо 1 с 1 ег с добавлением гистидина (20 мкг/мл), в результате чвго получают трансформированные дрожжи: БассЬагошусея сегедя 1 ае рАН 203.Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды ВцгЮо 1 йег, с введенным гистидином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре 30 С, в результате чего образуется колония, Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательной среде ВцгЮо 1 йег, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и термостатируют при температуре 30 С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугирования, суспендируют в минимальной питательной среде (10 мл), не содержащей Фосфорную кислоту, ,которую приготавливают путем замены КНРО в минимальной питательной среде Вцг 1 сЬо 1 дег хлористым калием, с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентрацией клеток примерно 4 х 10 клеток/мл. После термостатирования при темпераотуре 30 С в течение примерно 24 ч питательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собирая указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ буферного раствора Фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиазы 60000 (поставляется фирмой БеЖараЕц Казус К.К., Япония), и смесь осторожно взбалтывают при температуре 30 С в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт. Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1%-ного тритона Хи 50 мМ фосфатного бу- фера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 1 О мин и полученный поверх 1393317 10ностный слой извлекают как .пизированНый дрожжевой раствор,Этот лизированный раствор подвергают испытанию с НВя антигеном Р 1 А К 1 г. (полученным АЬЬог: США) на активНость к антигену НВя. Результаты испытаний представлены в табл.1.Т а б л и ц а 1 1 ОАктивПлазмида Клон, В Хозяин ностьНВяА 8 (отсчет в 8.Сегеуядае рАН 203 13 008АН 22 (ГЕЕМВР 312)рА 101 11 200 20 2 Эта рАМ 821 320 лонДанный вектор не имеет гена НВЧ или НВя и используется как негативный этаи. 25 Полученный таким образом фрагмент переваривают с челночным вектором рАМ 82 который расщепляется посредством ХЬо 1 в молекулярном отношении 5: 1 с использованием ДНК-лигазы Т 4 . Данную реакционную смесь используют для трансформации Е,со 1, в результате чего получается плазмидная ДНК. В55 полученную плазмиду вводят ген НВсА ниже фосфатазного стимулятора вектора рАМ 82 и эту плазмиду обозначают рНС 301,(Негативный контроль Е 1 А 11 г имеет активность 310 отсч./мин и его позитивный контроль имеет активность 17 500 отсч./мин). ЗОФрагмент гена НВсЛ 8 приготавливают следующим образом.Плазмиду рНВЧ (3 мкг) переваривают с ограничительной эндонуклеазой Кяа 1 обычным образом. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции связывания с линером ХЬо 1 в молярном отношении 1:10 ДНК-лигазой Т. После эк стракции фенолом и осаждения этанолом полученные осадки подвергают перевариванию ХЬо 1, в результате чего образуется фрагмент гена НВс (примерно 0,7 кв), по обоим концам которого 45 имеется концевое расщепление ХЬо 1. Исходные дрожжи представляют собой Яассйагошусея сегечгядае АН 22 (а Ьец 2 Ьдя 4 сап 1" ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательский институт Ферментации, Агентство по промышленным исследованиям и технологии, Япония, ВийареяГ ггеагу, где им присвоено официальное название нЕЕКМ ВР в 3". Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, %: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре 30 С в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугирования.Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставляемой фирмой БеЖадаЬз Ко 8 уо К.К Япония) и суспензию,вьюстаивают при 30 С в течение 30 мин, в результате чего получают сферопласт. Полученный таким путем сферопласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза,а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ СаС 11 и 10 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5), Эту суспензию распределяют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл. К суспензии добавляют раствор рекомбинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивания к раствору добавляют О, 1 М СаС 1(3 мкл) до конечной концентрации СаС 1, равной 10 мМ, и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5 10 мин. Б полученную смесь добавляют в каждом случае 1 мл раствора 20%-ного полиэтиленгликоля 4000 10 мМ СаС 1., и 10 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5), и эту смесь выстаивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин. Полученную смесь (каждая по 0,2 мл) добавляют к среде (10 мл), состоящей из 22% сорбита 2% глюкозы, 0,7% аминокислоты на основе дрожжевого азота 2% УРД, 20 мкг/мл гистидина и 3% агара, которая поддерживается при постооянной температуре 45 С. Послеслабого перемешивания смесь вводят в слой на чашке с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 м сорбита, которая была предварительно приготовлена и состоит из 0,7% аминокислоты на основе дрожжевого азота, 2% глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2% агара и оставляют на этой среде. Данную смесь(отсчет вминутах) Хозяин рНС 301 4 989 Я.Сегечяае АН 22 (нЕЕВМВР") рАМ 82 16 913 ВНИИПИ Заказ 1894/58 Тираж 520 Подписное Произв.-полигр, пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают колонии независимых от лейцина дрожжей. Данную колонию термостатируют в мини 5 мальной питательной среде ВцгИо 16 ег, в которую введен гистидин (20 мкг/ /мл), в результате чего получают же- , лаемые трансформированные дрожжи БасЬагощусея сегечгяае рНС 301. 10Каждую колонию трансформированных дрожжей наносят на чашку сагаром минимальной питательной среды Вцг 1 с-, Ьо 1 оег с введенным гистидином (20 мкг/мл), и термостатируют приотемпературе 30 С, в результате чего образуется колония. Полученные клетки отделяют от данной колонии, инокулируют в минимальную питательную среду ВцгЕЬо 16 ег с введенным в нее гистиди ном (20 мкг/мл), и термостатируют при температуре 30 С. По прошествии 24 ч клетки в фазе логарифмического роста собирают и извлекают путем центрифугирования, суспендируют в 25 минимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту (котораяполучается путем вытеснения КНРО в минимальной питательной среде ВцгЮо 1 дег) КС 1, с последующим 30 вводом 20 мкг/мл гистидина при концентрации клеток примерно 4 х 10 кле 6 ток/мл. После термостатирования при температуре 30 С в течение примерно 24 ч питательный бульон выращенной культуры центрифугируют при скорости вращения центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, в результате чегоклетки извлекаются. Отделенные таким образом клетки суспендируют в раство ре (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2),14 .мМ 2- меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиазы000 (поставляемой фирмой Яе 1 Еа 8 а 1 ц Кояуо К.К., Япония) и смесь осторожно взбалтывают при температуре 30 С в течение 30 мин, в результате чего получается сферопласт Этот сферопласт извлекают путем центрифугирования и тщательно суспендируют в Ра 50 створе ( 1 мл) О, 1 Тритона Хи 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), тщательно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращения центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный всплывший слой извлекают как дрожжевой лизированныйраствор.Этот лизированный раствор (20 мкл)подвергают испытанию с НВС антигеномК 1 А 1 С (поставляется фирмой АЬЬо 1;С,США) на активность антигену НВс.Результаты представлены ниже втабл.2.Данный вектор не имеет ни гена НВЧ, ни гена НВя и используется как негативный эталон.(Негативный контроль К 1 А Е имеет активность 17 740 отсч,/мин и позитивный контроль его имеет активность 446 отсч./мин. формула изобретения Способ получения челночного вектора путем объединения фрагмента ДНК ЯассЬагошусея сегечяхае, содержащего агя 1,2 рог и селективный маркерный ген для отбора трансформированных Б.сегечяае с фрагментом ДНК ЕясЬег гсМа со 1, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективный маркерный ген для отбора трансформи-. рованных плазмидой Е.со 1, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью создания высококопийного вектора, в Есо К 1 сайт-плазмиды рВК 322 вводят ген кислой фосфатазы Р 60, вьделенный из банка генов.Б 288 С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеаэой Яа 1 1 и ДНК-лигазой Т и получают плаэмиду рАТ 25, в Яа 1 1 сайт рАТ 25 включают фрагмент агя 1-игр 1, вьделенный из плазмиды УР 7, полученную плазмиду рАТ 26 обрабатывают эндонуклеазой Нпй 111 и вводят фрагмент 1,ец 2 и 2 рог плазмиды рЯЬЕ 1, после чего отбирают вектор рАТ 77.