Аналог энкефалина, обладающий пролонгированной анальгетической активностью

СОЮЗ СОВЕТСКИХО ЕааеРЕСПУБЛИК С 50 ф А(5 ИЗОБР ТЕНИЯ Н АВТО еапин обладающий.тическ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬНИЙОПИСАНИЕ(71) Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтезаАН Латвийской ССР(56) 1 ВЩЬез Л., ЗшхйЬ Т.И Коз-.йег 1 ьйг Н, ГогйегрП Ь,Н , Иогаап В.А., Иогг 1 в К.Н. "Ыепй 3,Исайдоп ой йыо ге 1 айей репйарерйЫззЕгош йЬе Ьга 1 п дхйЬ ройепй ОрдайеАнопдзй асйч 1 йу" Майцге 1975,258, с 577.2. ВцезсЬег Н,Н., Нд 11 К.С., Коешег О., Сагйгпацх Р., С 1 оззе А.,Нацзег 0 , Р 1 езв 1. "ЕчЫепсе Еогапа 18 евй 1 с асй 1 чЫу ой епкерЬаИп3.п йЬе,шоцве".: Майме 976, 261,с, 4233, КцЬойа И., Нраве О. "ЕйерЬа 11 п апа 1 онв сопйахпхп 8 йЬе оърерй 3.-:йе цмй .ТугАга (куойогрЬж)".Селеш. РЬагш. Вц 11. 1980, 28,У 9с. 2580(54), АНАЛОГ ЭНКЕФАЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЙПРОЛОНГИРОВАНЙЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙАКТИВНОСТЬЮ.57) Аналог энк а формулыН Туг - В Аг 8 - 01 у - РЬе ОН пролонгированной анальгеактивностью, 1048705Изобретение относится к новомубиологически активному соедииениюаналогу энкефалина, обладающему пролонгированной аиальгетической активностью, которое может найти примеиение в медицине,Известны нриродные метионин- и лейцин - энкефалины формулф Н Туг - Иуу-РЬе-Ией Ойи Н Туг - 61 ууРЬе-Ьео ОН, соответственно Щ, 1, 10 ироявляющие мор 4 пщоподобкую активность в опытах на специфических моделях опиатного рецептора и подавляющие стереоспецифическое связыва- . ,ние с рецептором опиатного антагониста налоксоаа в гомогенатах мозга.Однако известные метионин- и лейцин- энкефалины проявляют слабую и кратковременную (5-15 мин) анальгезию при внутрижелудочковом введении 20 в мозг мьпеи 2 и не активны при внутривенном, пероральном и других способах введения.Наиболее близким но химической25 структуре к описываемому соединению является аналог энкефалина - (Р - .Агд) лейцинэнкефалин, проявляющий анальгетическую активность при внутримозговом введении. При внутривенном введении этот аналог анальгезией не обладает З .Цель изобретения в . расширение арсенала средств воздействия на живой организм.Поставленная цель достигается 35 описываемьвч аналогом энкефалина формулы Н-Туг-Р Ага - Иу - РЬе ОН,40 обладающим пролонгированной анальгетической активностью.(Р-Аг 8 ф, дез-Ь ец ) - энкефалинВсинтезирован известными методами пептидной химии в растворе согласно 15 приведенной схеме с использованием в качестве кондеисирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДСС), а также пентафторфениловых эфиров третбутилоксикарбониламннокислот, Гуани диновая функция В-аргинина была защищена нитрогруипой, гидроксил тироэина-бензильным радикалом. Карбоксильную группу глицина защищали этерификацней. Вос-группы в синтезе 55 пептида удаляли 50 Ж-ным раствором трифторуксусной кислоты (ТУА) в хлористом метилене. Нитро- н бенэильную защиты снимали каталитичесггидрогенолизом,Общая схема синтеза приведена начертеже.П р и м е р, Для синтеза (Р-Агр,деэ-Ь ец )-знкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы"Кеапа 1" (Венгрия).,Все аминокислотыкроме Р-аргиннна имеют Ь-конфигурацию, Температуру плавления. веществопределяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточныхсоединений контролируют с помощьюТСХ на пластинках "Зх 1 цйо 1" (ЧССР)в следуиа 1 нх.системах растворителей;хлороформ-этанол-уксусная кислота,(АсОН), 85 з 105 (А), н-бутанол-пиридин-АсОН-Н О, 15 з 10:3:6 (В), н-бутанол-АсОН-Н О, 4:1:1 (С). Аналог энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы "Иеек" в системах: хлороформ-метанол-АсОН-Н,О, 3020:4;6 (Д),удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Рег 1 схп-Е 1 шег 141 С" (фРГ). Кислотныйгидролиз проводят в запаянных ампулах в 6 и, соляной кислоте при120 С в течение 24 ч, Аминокислотиыйсостав определяют на анализаторе"1 ео 1-3". Для всех соединений данныеэлементного анализа удовлетворитель"но совпадают с вычисленным содержанием С, Н, й,.Этиловый эфир Яфф-трет-бутилоксикарбоиил-Б -нитро-Р-аргинилглици 6на (1). К раствору 6,38 г (20 ммоль) В -трет-бутилоксикарбонкл-Юф-нитро- Р-аргинина и, 3,24 г (24 ммоль). 1- оксибензотриазола в 20 мп диметнлформамида (ДИФА) при охлаждении до -15 С прибавляют 412 г (20 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДСС) в 8 мл ДИФА, перемещивают З,ч при 0 С, затеи добавляют З,О 7 г(22,моль) этилового эфира глнцина гидрохлорида, 3,08 мл (22 ммодь) триэтиламииа и перемешивают 24 ч пуи 20 С. Реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделение слоев). Этилацетатный слой отделякэ и промывают. последовательно 5 Х-ным раствором КНЗО 57-ным раствором ВаНСОводой, насыщенным раствором ЯаС 1, сушат над безводным Юа, 80. Растворитель отгоняют, остаток пеуекристаллизовывают из этилацетата,=-13,5 (с 1 ь ЛИФА) ь К=Оэ 68 (В).Этиловый эфир И-трет-бутилоксикарбонил-бензил-Ь-тирозил-Иг-нитро-аргинилглицина,4,04 г (10 ммоль) дипептида (1)растворяют в 15 мл 507-ного раствора ТРА в дихлорметане и выдерживают30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в ва-,куум-эксикаторе над КОН, Получают4,01 г (96 Х) трифторацетата (11),К =0,48 (В) .2 г (5 ммоль) трифторацетата (11) 15растворяют в 10 мл ДМФА, охлаждаютдо -5 С и при перемешивании добавляоют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиламина в2 мл ДМФА и 2,46 г (5 ммоль) п-нитро, фенилового эфира И-трет-бутилоксиКар-бонил-О-бензил-Ь-тирозина, растворен-.ного в 10 мл ДМФА. Смесь выдерживают1 ч при -5 С, 24 ч при 0 С и ещео о24 ч при комнатной температуре. Затемреакционную массу выливают в 500 млводы со льдом, выделившееся в осадоквещество отфильтровывают. Осадокрастворяют в этилацетате и промывают5 Е-ным раствором КНБ 0,1, водой, 57-нымраствором КНСОЭ, водой, насыщенным 30раствором ЮаС 1 и высушивают над без-,водным Иа, ЯО. Растворитель отгоняют, продукт перекристаллизовываютиз этилацетата. Получают этиловыйэфир . И-трет-бутилоксикарбонилбензил-Ь-тирозил-С-нитро-Э-аргинил- .глицинаВыход; 1,77 (547) трипептида (111),т.пл. 162-164 С, /Ф/ =+11,1 (с 1,ДМФА); К =0,65 (А) . 40Н-трет-бутилоксикарбонил-бензилЬ-тирозил-М -нитро-Р-аргинилглицинб(111) растворяют в 15 мл метанола, 45прибавляют 1 н, раствор НаОН дорН 10-11 и выдерживают .несколькоминут до окончания гидролиза (хроматографический контроль). Отгоняютрастворитель, добавляют воду и подкисляют 1 н НС 1 до рН 3. Выпавшийосадок отфильтровывают и хроматогра-.фируют на колонке с силикагелем всистеме хлороформ-этанол-этилацетат".АсОН-Н, О, 85:5:8:2:0,25, Получают 50,34 г. (547) трипептида (1 Ч),т,пл. 86 С, /ы/д =+5,5 (с 1, ДМФА);К=0,60 (С) . 705И-трет-бутилоксикарбонил-бензил-тирозил-И-нитро-О-аргинилглицил-Ь-фенилаланин.3,15 г (5 ммоль) трипептида (1 Ч) растворяют в 10 мл этилайетата, охлаждают до О С и при перемешиванииодобавляют 1,01 г (5,5 ммоль) пентафторфенола и 1,13 г (5,5 ммоль) ЛСС, растворенных в этилацетате. ЧерезЬ 2 ч смесь охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, растворитель отгоняют, маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердения. Получают 3,54 г пентафторфенилового эфира (Ч),(С) .0,73 г (4,45 ммоль) Ь-фенилаланина (Ч 1) растворяют в 6 мл ДМФА и при перемешивании добавляют 0,62 мл (4,45 ммоль) триэтиламина в 2 млДМФА и 3,54 г (4,45 ммоль) пентафторфенилового эфира (У), растворенного в 4 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов, ДМФА отгоняют при 40 С, остаток растворяоют в этилацетате и обрабатывают аналогично соединению (111). Продукт,полученный после отгонки раствори теля, хранят в эксикаторе. Получают И-трет-бутилоксикарбонил-бензил-Ь- тирозил-С-нитро-Р-аргинил-глицил-Ь- фениланин (Ч 11).Выход: 1,43 г (41,53) защищенного тетрапептида (Ч 11), К=0,27 (А, Метис") .Ь-тирозил-Э-аргинил-глицил-Ь- фенилаланин,0,320 г (0,412 ммоль) тетрапептида (Ч 11) растворяют в 6 мл 503-ного раствора ТРА в дихлорметане и выдерживают в течение 30 мин. Растворупаривают, остаток растирают с эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе надКОН. Получают 0,300 г трифторацетата тетрапептида(Ч 111); К=0,61 (Д). К раствору 0,300 г (0,380 ммоль) соединения (Ч 111) в 5 мл метанола добавляют палладиевую чернь, 0,2 млуксусной кислоты и гидрируют 6 чопри 20 С. Катализатор отфильтровы,вают, фильтрат угаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром на фильтре, сушат над КОН в вакууме. Полученный продукт (0,250 г) очищают на КИ-целлюлозе (Ж, фирма ЪЪаешап") в аммоний-ацетатном буфере (градиентное элюирование) . Поглощение раствораизмерялось при 206 и 254 нм ( Бч 1- согд - 111, 1 КВ", Пт.сция), Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют. Получают 1.-тирозил-Р-аргинил-гли- цил-Ь-фенилаланин (1 Х). 5.Выход: О, 135 г (527) тетрапептида энкефалииа (1 Х), /М/ =+46,6 (с 1, 0,2 н АсОН);,1=0,4 (Д); К=0,5 (В), данные аминокислотного анализа удовлетворительны.Биологическая активность (Э-Аг 82, дез-Ь ею)-энкефалина была исследована в ощтах пчшо по методу Беда Н. а а 1. а тазию м(см. 15В работе использованы беспородные мыши-самцы массой 20 г. Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводят при помощи. 1-образной иглы в20 сыйегпа шарипа мозга неанестезированным мышам в количестве 10 мкл. Был исследован диапазон доз: 0,05 - 100,0 мкг/жив. Контрольным животным вводят 0 мкл стерильного Физиологического раствора. Каждая экспериментальная группа состоит из 10 мышей. Анальгетический эффект описываемого соединения оценивают по тесту "Сах 1 - рхпссЬ" при помощи артериального зажима, накладываемого на основание хвос- ЗО та. Определение болевой реакции провсдят через 5, 15, 30, 60, 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения анальгетической реакции, Результаты выражают альтер- З 5 нативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении ЕД (эффективная доза исследуемого вещества, которая вызывает анальгетический эффект у 4 О 503 подопытных животных) используют метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическая активность исследованных соединений приведены в табл. 1, 2 и 3. Как видно из табл. 1, 2 и 3 (Э-Аг 8, дез-Ь еи )-энкефалин обладает выраженной аиальгетичеекой активностью. Максимальный эффект наблю. дается на 5-30 мин после введения. Анальгетическая активность описывае О мого аналога энкефалина значительно превышает активность природных энкеФалинов (1,2) и в 12 раз превышает анальгетическую активность прототипа - (Э-Агя 2)-лейцинэнкефалина (3), 55кже в 4 раза превышает анальгеорфина на молярной основетабл. 1), Более того, описывае Поскольку анальгетическая активность описываемого аналога энкефалина была исследована в диапазонедоз от .0,05 до 100 мкг/животное,то на основании этих данных (см.табл. 3) была вычислена эффективная доза (ЕД ), составившая0,44 нмоль/животное или 0,3 мкг/жи-.вотное,Из данных таблицы видно, что токсические признаки соединения начинают проявляться в дозах, превышающих эффективную в 333 раза .100 мкг/животное), следовательно,индекс ЛД (ЕП 5, ) ину большую чем достаточно безопасдля лекарственного терапевтический составляет вели 333, и является ным интервалом средства,Интервал минимальный и дозой, выз токсичности также достат 2000 ( 100 м вызывающейкий эффект,ые признаки ская широта),. Он составляет жду дозои, альгетичес ывающеи терапев очно вел кг/живот е тичеик. н кчто же является безопасным для. лекарст венного средства.Проведенные исследования показал что описываемый (Э-Аг 82 дез,еп)- энкефалин может найти применение в медицине в качестве анальгетика,пролонгированным действием. мый аналог энкефалина в отличи своего структурного аналога акт,.аен при знутривенном введении (ЕЛ, = =19,0 мг/кг).Характерной особенностью синтезированного аналога является значительная пролонгация анальгетического эффекта. Продолжительность анальгетической реакции при ЕДсоставляет 1,5 ч против 15 мин у энкефалннов или, например, 30 мин у известного аналога энкефалина с длительным действием - (Э-А 1 а)-метионинэнкефалинамида. Описываемое соединекие в дозе 25 мгк/животное вызывало анальгезию 887 в течение 5 ч при интрацистернальном введении, при внутривенном введении дозы 130 мг/кг продолжительность анальгезии превышала 6,5 ч. Токсических явлений при этих дозах не наблюдалось.1048705 8 Таблица 1Анальгетическая активность энкефалина и его аналоговпри интрацистернальном введении мышам (метод йа 11 рзпсЬ). ЕД ммоль/жи- вотное Соединение пп Лейцин-энкефалин 21 223(160-310) 146 (99-2 15) 2 Метионин-энкефалин 21(Э-А 1 д)-метионин-энкефалинамид О, 58 (О, 39-0, 92) 30 0,44(0,15-1,62)1,86(0,5-5,6) 90 . 5-15 6 Морфин 60 1) ЕД - эффективная доза вызывающая реакцию у 50% подопытныхюФживотных. 2) ЕДьо- о3) в работе использовался морфин-гидрохлорид производстваТашкентского ХФЗ. Та блица 2 Анальгетическая активность (Р агя 2, дез-Ееи) энкефалиновпри внутривенном введении мышам (метод йа 11 р 1 псЬ) Доза, мг/кг Время определения анальгетической активности, мин 5 30 60 90 10 0 0О 25 43 Ж 60% 57 Ж; 29% 14% 33 50 0 130 1 ООЖ 1 ООЖ 1 ООЖ 100% 100% анальгезия 100 Ж держалась более 6,5 ч1048705 Таблица 3Анальгетическая активность (О-Аг 8, дез-Ьец) знкеалина приинтрацистернальном введении мышам Анальгезия через 1 мин, 7 Соединение Дозамкг/животное 30 0 0-Ацт - дез Ьецнкефалин 0 8 8 8 40/3 0 40/30 40/ 0 ЗО альгезию) 10 пок ьше ина 5 м мыши из 10 ум осле введен 0 Аг 8 - дез Ьет1048705 Соетазнтель И.КарТеКред Т.Иаточка ск Ко ктор М Леонтюк Редактор Е.ДуаникТиражАД ПодписноеарственВогв комитета СССРзобретений и.открытийва, Ж-ЗЗ; Раушская наб., д. 4/5 38 ИВНИИПИ Госуд по делам 113035, Мос