Способ получения 11 -оксистероидов

Своз Советских Соцналнстнчесюа РеспубликОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ЙА%81 У(51) М. Кл. С 07 д 5/00 //А 61 К 31/57 Вэудерсщннцб каннтнт ВССР яв делэм нзобретеннй н отхрытнй(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11-ОКСИСТЕРОИДОВ К где 1 ф -гидтероирменедва- ф 7 с" преученстеро"И 1Изобретение относится к усовер- шенствованному способу получения 113 -оксистероидов общей формулыДн,он 1=0 простая или двойная связ ьХ - водород, метил;7 - метилен, этилен,являющихся ценными лекарственнымивеществами,Известен способ полученияроксилированных 17 с-гидроксисдов прегнанового ряда путем Фетативного гидроксилирования пррительно этерифицированных в 1положении 11-дезоксистероидовгнанового ряда, после чего полные 111 Ь -гидрокси о-ацилоксииды омыляют 11,Недостатками способа является многостадийность и необходимость проведения гидролиза 11 -гидроксий-ацилоксистероидов, при котором образуется больщое количество побочных продуктов, с чем связана необходимость дорогостоящей очистки конечных , продуктов.Цель изобретения - упрощение процесса. Поставленная тем, что в спос систероидов сбщ ферментативного 11"дезоксистеро туры пресез Сц ментативному гид гают 11-дезоксицель достигается обе получения 11 Р -окй Формулы 11 ) путем гидроксилирования дов с помощью куль" чцага цпа 1 а ферроксилированию подвертероид общей формулы Нг - ОЗ г 0 Г35 3 9406где : - Х иГ имеют указанные зна-чения;Й - С, -С, алкил 1Й 1- С. -С алкил,с последующим выделением целевых 5продуктов.Предлагаемый способ обеспечиваетпроведение процесса в одну стадию,вместо трех по известному способу,что упрощает процесс. Кроме того, вспособ обеспечивает возможность получения 11-гидрокси- Ь 14-стероидов общей формулы (1 ) с высоким выходом.Следует также отметить, что дляосуществления предлагаемого способанеобязательно в качестве исходныхсоединений применять чистые продукты11-дезоксистероиды общей формулы ,если их, например, получают как сырой продукт по следующему методу.Из раствора 1 г (4 ммоль ) тозилата пиридиния и 10 г ( 28 ммоль ) 17 с.21-дигидроксистероида в 80 мл диметилформамида и 700 мл бензола дляудаления следов воды при температуребани 110-130 С (глицериновая баня)отгоняют 300 мл бензола при применении водоотделителя. Затем в течениенепродолжительного времени охлаждают, добавляют 24 мл (110- 140 ммоль)триалкилового эфира ортокарбоновойкислоты и 1,5 ч отгоняют остаточныйбензол. После добавления 5,2 г пиридина реакционный продукт в высокомвакууме концентрируют далее до сухого остатка.Реакция протекает количественно.Остающийся после концентрирования17 оС 21-(1-алкокси-алкилидендиокси)-стероид имеет сначала масляную консистенцию, однако чаще быстро крис 4 Яталлизуется. Степень чистоты для последующего микробиологического гидроксилирования является совершенно достаточной, если прилипшие ккристаллизату остатки применяемыхреактивов не мешают Ферментативномукатализу. Аналогично получают П -гомостероиды общей формулы .П р и м е р 1. а . 8 г тозилата пиридиния и 80 г 17, 21-дигидрокси-прегнен,20-диона в 560 млдиметилформамида растворяют и разбавляют с 3;5 л бензола, После этого отгоняют 1,5 л бензола при температуре бани 120 С через водоот- моделитель. 8 горячий реакционный раствор медленно приливают 192 мл триэтилового эфира орта-уксусной кис 50 4лоты и затем 1 ч отгоняют бензол идругие легколетучие реакционныекомпоненты, добавляют 96 мл пиридина и при температуре бани 60 С в глубоком вакууме сгущают полностью досухого остатка в течение 2 ч. Получающийся сначала масляный остатокбыстро кристаллизуется.Получают 113 г 17 с. -21-(1-этокси-этилидендиокси)-4-прегнен,20-диона в форме желтых кристаллов ст.пл, 89-90 С,б), 2-литровая колба Эрленмейеракоторая содержит 500 мл стерилизованного 30 мин при 120 С в автоклаве питательный раствор из .3 глюкозы, .: согп зСеер 1, йаМО, 0,2,К НРОСЛО 1 К 1 НРОд О; М 950 д 7 НдО0,05, Ге 50 7 Н О 0,002 и КС 1 0,05,засевают лиофильной культурой Сд 1 чиа га цпа а НКК. (2380) и 60 чпри 30 С передвигают в ротационномовстряхивателе. Эта культура выращивания (250 мл)служит для прививки20-литрового ферментатора, которыйзагружен с 15 л стерилизованной при121 оС и 1,1 ати питательной средысостоящей из 2 глюкозы и 2/ согпзеер.Далее при добавлении силикона 5 Нв качестве антивспенивателя при 29 Си 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин)и перемешивании смесь герметизируют 24 ч. Затем 1,5 л этой культурыпри стерильных условиях отбирают иею заполняют 20-литровый основнойферментатор, который содержит 14 млранее стерилизованной питательнойсреды из 3 Согп з 1 еер и 0,7 Ф глюкозы, при рН 6,5.После Фазы выроста (12 ч) приусловиях предварительной ферментациипри стерильных условиях добавляют7,5 г сырого 17 с, 2 1-(1-этокси-этилдендиокси)-4-прегнен,20-диона, содержащего 6,43 г чистого. вещества,растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют. Ходферментации контролируют путем отбора проб, которые анализируют с помощью тонкослойной хроматографии после экстрагирования метилизобутилкетоном. Через 38 ч контакта превращение субстрата заканчивают.Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют.метилизобутилкетоном, экстракты объединяюти концентрируют во вращающемся ис5 9406 парителе, затем при 50 С бани в вакууме сгущают в ротационном испарителе до сухого остатка. Остаток растворяют в теплом метаноле, отфильтро" вывают от остающегося нерастворимого силиконового масла и опять упаривают до сухого остатка, Остающийся остаток (9,4 г) растворяют в 40 мл этилового эфира уксусной кислоты при нагревании сначала при комнатной 1 О температуре, затем кристаллизуют при глубоком охлаждении, Выкристаллизовавшийся продукт отсасывает, промывают небольшим количеством уксусного эфира и сушат 5 ч при 60 С в вакуум ном сушильном шкафу. Получают 4,18 г гидрокортизона (11 Ъ 1 17 с 1 21-тригидрокси-прегнен,20-дион) с т,пл, 212-214 С. Маточник кристалолизата нагревают с активированным 20 углем, фильтруют и концентрируют до обьема 15 мл, При охлаждении и стоянии в течение ночи при комнатной температуре выкристаллизовывают дальнейшие 0,7 г гидрокортизона с т.пл, 208- 25ОоСОбщий выход 87113 от теоретического.П р и м е р 2. а). 7 г тозилатапиридиния и 70 г 17 с 1 21-дигидрок- зо си-.4-прегнен,20-диона растворяютв 560 мл диметилформамида и разбавля- юТ с 4,9 л бензола. При температуре бани 130 ОС отгоняют 2,1 л бензола через водоотделитель и после коротЭ 5кого охлаждения добавляют 168 мл триэтилового эфира ортомасляной кислоты. При 130 оС в течение 1,5 ч отгоняют остаточный бензол, Раствор смешивают с 84 мл пиридина и затем упаривают в ротационном испарителе в глубоком вакууме до сухого остаткааПолучают 103,8 г 17 А 1 21-(1-этокси"бутилендиокси)-4-прегнен201 45 -диона в виде масла,б) . При условиях примера 1 7,5 г сырого 17 с 1,1 -21-(1-этоксибутилидендиокси)-4-прегнен,20-диона, который содержит 6,3 г чистого вещества, ферментируют 48 ч с культурой50 Сцгчц 1 аг 1 а .цпаСа. После переработки смеси и кристаллизации освобожденного от силикона остатка экстрагирования из этилового эфира уксусной кислоты в общем получают 4,3 г гидрокортизона с т,пл. 210-213 С.П р и м е р 3. а) 5,3 г тозилата пиридиния и 53,0 г 17.,21-дигидрокси 50 6-бс-метил-прегнен-диона растворяет в 370 мл диметилформамида иразбавляют с 2,5 л бензола. Послеэтого отгоняют при температуре бани 130 С через водоотделитель 1 лбензола. В горячий реакционный раст.вор медленно добавляют 127 мл этилового эфира ортоуксусной кислоты изатем отгоняют 1 ч бензол и другиелегколетучие компоненты реакции.Теперь добавляют 63 мл пиридина исгущают при температуре бани 60 ССв глубоком вакууме 2 ч полностью досухого остатка, Остаются 66,8 г масляного 17 сС 1 21-(1-этокси-этилидендиокси)-Ы-метил-прегнен-диона.Пробу масляного остатка интенсивно перемешивают с дистиллированнойводой, причем масло медленно переходит в кристаллическое состояние.Т.пл, 75/92-95 Сб), При условиях примера 1 в течение 51 ч с культурой Сцгчц 1 аг 1 а1.цпайа ферментируют 6 г сырого 17 ,21"(1-этокси-этилидендиокси)-6 с.-метил-прегнен,20-диона, которыйсодержит 4,8 г чистого вещества,После переработки смеси и кристаллизации остатка экстракции из диизопропилового эфира получают 3,4 г6 Ы-метил-гидрокортизона с т.пл. 217219 ОС,П р и м е р 4. а). 4 г тозилатапиридиния и 40 г 17 с 1 21-дигидрокси,4-прегнадиен,20-диона растворяют в 280 мл диметилформамида исмешивают с 2 л бензола. После этогопри температуре Гани 120 С через водоотделитель отгоняют 600 мл бензолаВ горячий реакционный раствор медленно приливают 96 мл триэтиловогоэфира ортоуксусной кислоты и послеэтого отгоняют остаточный бензол идругие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 48 мл пириди"на и при температуре бани 60 О в течение 2 ч полностью до сухого остатка отгоняют в высоком вакууме,Получают 58 г 17 с 1, 21-(2-этокси-этилидендиокси)-1,4-прегнадиен,20-диона в виде желтого кристаллизата.Пробу кристаллизуют после обработки активированным углем изэфира с 11 ацетона и получают чистый продукт с т,пл. 153- 154 С.б) 2-литровая колба Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного в течение 30 мин при 120 оС9406в автоклаве питательного раствора на 3 глюкозы, : Согп зйеер 1; МаМО 0,2; КН 1 РО 0,1; Н 2 НРОА 0,2; Мц 50 с 7 НО 0,05; Ге 504 7 НО 0,002 и КС 1 0,05 прививают с лиофильной культурой Сцгчцаг 1 а цпаСа (МВЮ.2380) и 60 ч при 30 ОС встряхивают на ротационном встряхивателе, Эта выращенная культура служит для прививки 20-литрового форферментатора, 1 о который загружен с 15 л стерилизованной при 121 С и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 2 глюкозы и 24 Согп 5 Сеер при рН 6,5, При добавлении силикона 5 Н в качестве ан тивспенивателя герметизируют при 29 оС и 0,7 ати при аэрировании воздухом (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) 24 ч. Затем при сте" рильных условиях отнимают 1,5 л этой культуры при стерильных условиях и с ними прививают в 20-литровый основной Ферментатор, который заполнен 14 л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 3 Согп зйеер и 0,7 глюкозы, при рН 5,5.После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,5 г 17321-(1- -этокси-этилидендиокси)-1,4-прегнадиен,20-диона, растворенного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход Ферментации контролируют с помощью взятия35 проб, которые экстрагируют с метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии. Через 36 ч контакта заканчивается превращение субстрата, Содержание40 ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, так же, как и отфильтрованный остаток, экстрагируют метилизсбутилкетоном, экстракторы объединяют и концентрируют сначала в ротационном испарителе, затем при 50 оС бани в вакууме в ротационном испарителе и затем при 50 С бани в вакуумев ротационном испарителе до 100 мл и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре.Продукт отсасывают, сушат в ва" кууме и получают 5,7 г преднизолона с т.пл, 229-231 ОС.П р и м е р 5, а). 0,62 г тозилата пиридиния и 6,2 г 2-гомо-веществаРейхштейна 6 растворяют в 43,4 мл диметилформамида и разбавляют в 270 млбензола. Затем при температуре ба 50 8ни 120 С через водоотделитель отгоняют 116 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно добавляют 14,9 мл триметилового эфира ортоуксусной кислоты и затем 1 ч от" гоняют бензол и другие легколетучиекомпоненты реакции. Теперь добавляют 7,5 мл пиридина и сгущают полностьюдо сухого остатка при температуре бани 60 С в высоком вакууме в 2 ч. Масляный остаток кристаллизуют из эфира,Получают 7, 3 г 17 Ы, 21- (1-метоксиэтилидендиокси)-Р-гомо-прегнен,20-диона в форме кристаллов с т.пл, 167-169 оС.б)" в 2-литровую колбу Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованной при 120 оС в автоклаве питательной среды из 3 глюкозы, 3:Согп зСеер 1; МаМО 0,02; КН 2 РОд, 0,2%КНРО О, 11 М 0504 7 НО 0,05; ГеЬОд х 7 НО 0,002 и КС 1 0,05, прививают лиофильную культуру Сцгчц 1 аг 1 а 1.цпаса (Мйй 1. 2380) и 60 ч при 30 С качают в ротационном встряхивателе. Выращенная культура (250 мл ) служит для прививки 20-литрового фер" ментатора, который загружен 15 л стерилизованной при 121 оС и 1,1 ати питательной среды, состоящей из 23 глюкозы и 2 Согп зйеер при рН 6,5. При добавлении силикона 5 Н в качестве антивспенивателя смесь герметизируют при 29 С и 0,7 ати при аэрировании (10 л/мин) и перемешивании (220 об/мин) в течение 24 ч, Затем при стерильных условиях отбирают 1,5 л этой культуры и приливают в 20-литровый основный Ферментатор, который заполнен 14 л стерилизованной, как указано выше, питательной среды из 34 Согп зСеер и 0,7 глюкозы при рН 6,5 После фазы роста (12 ч) при условиях ферментации в стерильных условиях добавляют 7,3 г 17, 21-(1-метокси-этилидендиокси)- -В-гомо"4"прегнен,20-диона, раст" воренного в 100 мл диметилформамида, перемешивают и аэрируют дальше. Ход Ферментации контролируют с помощью отбора проб, которые экстрагируют метилизобутилкетоном и анализируют с помощью тонкослойной хроматогра"фии. Через 48 ч контакта превращение субстрата оканчивается.Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры, а также отфильтрованный остаток экстрагируют940650 102 Ж Согп плеер при рН 6,5. При добавлении силикона 5 Н в качестве антивспенивателя смесь герметизируютпри 29 С и 0,7 ати при аэрировании(10 л/мин) и перемешивании(220 об/мин)в течение 24 ч. Затем 1,5 л этойкультуры отбирают при стерильныхусловиях и ею прививают 20-литровый основной Ферментатор, который10 содержит 14 л стерилизованной, какуказано выше, питательной среды из3 согп ьсеер и 0,74 глюкозы, приРН 55После Фазы выращивания (12 ч) при15 условиях ферментации в стерильныхусловиях добавляют 7,5 г 17 с, 21-(1-метоксиэтилиденокси)-0-гомо,4-прегнадиен,20-диона, перемешивают и аэрируют дальше. Ход фер 20 ментации контролируют путем отборапроб, которые экстрагируют метилизобутилкетоном и анализируют с помощьютонкослойной хроматографии. После52 ч контакта превращение субстрата25 оканчивается. Содержимое ферментатора фильтруют, фильтрат культуры,а также остаток фильтрования экстрагируют метилизобутилкетоном, экстракты объединяют и сначала концентриру 30 ют в циркуляционном испарителе,затем сгущают при 50 оС температурыбани в вакууме в ротационном испарителе до 100 мл и кристаллизуют прикомнатной температуреПродукт отсасывают и сушат в вакууме. Получают6,1 г гомо-преднизолона (11 Р,173., 2-тригидрокси-Ю-гомо,4-прегнадиен,20-дион) с т.пл. 226228 ОС,40 Формула изобретения 50 ро щь 9метипизобутилкетоном, экстрактыобъединяют и сначала концентрируютв циркуляционном испарителе, затемпри 50 оС бани в вакууме сгущают досухого остатка в ротационном испарителе. Остаток растворяют в тепломметаноле, отфильтровывают от остающегося нерастворенным силиконовогомасла и опять упаривают до сухогоостатка. Оставшийся остаток хроматографируют через колонну с силикагелем (градиент 4,5 л метиленхлоридана 0,5 л ацетона - 4 л метиленхлорида на 1 л ацетона) и кристаллизуют из ацетона,Получают 5,7 г О-гомо-гидрокортизона (11 9, 17 с, 21-тригидрокси-О-гомо-прегнен,20-диона) ст.пл, 212-215 С (с разложением).П р и м е р 6, а). 1,5 г тозила"та пиридиния и 15 г 17 с, 21-дигидрокси-В-гомо,4-прегнадиен,20-диона растворяют в 120 мл диметилформамида и разбавляют с 800 мп бен.зола. Затем при температуре бани120 С через водоотделитель отгоняют 250 мл бензола. В горячий реакционный раствор медленно приливают40 мл трйметилового эфира ортоуксусной кислоты и затем отгоняют дальнейший бензол и другие легколетучие компоненты реакции. Теперь добавляют 20 мл пиридина и сгущаютполностью до сухого остатка при температуре бани 60 С в высоком вакууме2 ч. Остаются 18,8 г масло-кристаллического сырого продукта, Пробуперекристаллизовывают после обработки с активированным углем из изопропилового эфира и получают чистый171, 21-(1-метокси-этилиденокси)-2-гомо,4-прегнадиен,20-дион ст,пл, 142-144 оС,б). в 2-литровую колбу Эрленмейера, которая содержит 500 мл стерилизованного в автоклаве при 120 ОСпитательного раствора из 33 глюкозы, Ф: Согп зСеер 1; йайО 0,2;КНРОф 0,1; К 2 НРОд 0,2; МУЬО 7 НО0,05; Ге 50 д 7 Н 20 0,002 и КС 1 0,05прививают лиофильную культуру Сцгчц 1 ага 1.цпаса (ййй 2380) и в те- .чение 60 ч при 30 О С взбалтывают наротационной качалке. Выращенная культура (250 мл) служит для прививки20-литрового форферментатора, который загружен 15 мл стерилизованной при 121 ОС и 1,1 ати питательнойсреды, состоящей из 23 глюкозы и 1. Способ получения 11-оксистероидов общей формулыбнОнС=О простая или двойная связь;водород, метил 11 Г - метилен, этилен, ючающий ферментативное гидроксилиание 1 1-дезоксистероидов с помою культуры врес 1 ез Сцгчц 1 аг 1 аЗаказ 0 Тираж 3 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 илиал ППП Патент , г. Ужгород, ул. Проектная,где --- К и тт имеют указанные зна- ц чения,Р - С-С 4-алкилЯ - С 1-Су 1-алкила Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент фРГ Ю 16 18599,кл.12 о 25/05,опублик,1974(прототип),