Способ получения препарата вируса марбург

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК АЗ 180 12,А 61 РЕТЕНИ К ПАТЕН ПАРАТА ВИ. %13водственное обь огия, Сущность ный материал фицированных но его осветляугированием и аллэстных белточного Сном матер п,ф-лы, 3 т ние(56) Фадеева Л,Л., ХалА.Ю. и др. Консервацгрупп для целей длитесб. Методы исследовобщей и медицинскойс,66-73,М,Р,Кеу, К.РоузсосЬещса ргочгцз: ечбепсе акогзюгапз апб йег ге)ат,),беп, ч)го, 1988, ч. ецкая Э,В., Селезнева ия вирусов различных льного хранения. - В ания в молекулярной, вирусологии. М, 1987, Сох,.Н.ЕОтт. рет)ез ОХ МагЬигц аггее бзспст ч)газ опзЬ)р со ЕЬо)а ч газ 69, р,1957 - 1967,Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано при консервации вирусных препаратов методом лиофилизации для последующего хранения.Целью изобретения является снижение потерь инфекционной активности препарата при лиофилизации и хранении при положительных температурах, а также увеличение сроков хранения препарата.Указанная цель достигается тем, что жидкий вирусный материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок, предварительно его осветляют низкоскоростным центрифугированием и перед внесением защитной среды дополнительно очищают от балластных белков до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающего 1,00.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПР РУСА МАРБУРГ(57) Использование: вирусол изобретения: жидкий вирус получают из плазмы крови ин морских свинок, предваритель ют низкоскоростным центриф дополнительно очищают от б ков гель-фильтрацией до оста жания общего белка в очищен не превышающего 1,00. 1 з, 3 Далее вводят в жидкий вирусный материал защитную среду с последующей его лиофи-. лизацией. Причем дополнительную очистку жидкого вирусного материала осуществляют гель-хроматографией.Новыми, отличительными от прототипа, являются следующие признаки способа, Жидкий вирусный материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок и перед внесением защитной среды дополнительно очищают от балластных белков до остаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающем 1,0. Причем дополнительную очистку жидкого вирусного материала осуществляют гель-хроматографией,Сравнение заявляемого спо б естными аналогами показало, и 180801210 1 Ц 20 25 35 40 43 30 тельные от прототипа признаки проявляютновое, неизвестное ранее свойство, а именно: дополнительная очистка гель-хроматографией вируса Марбург, содержащегося вплазме крови морской свинки, от балластных белков приводит к существенному повышению термоустойчивости при храненииего в виде лиофилиэованных, содержащихзащитную среду препаратов, Неочевидность указанного свойства новых признаковспособа можно обосновать тем, что до настоящего времени считалось использование плазмы крови инфицированныхживотных неэффективным, поскольку препараты, полученные на ее основе, обладаютнизкой термоустойчивостью при лиофилизации и хранении. В изобретении экспериментально показано, что при дополнительнойочистке гель-хроматографией инфицированной плазмы крови животных от балластныхбелков получают повышение термостабильности препарата, вследствие чего снижают ся потери его инфекционной активностипри лиофилизации и хранении при положительных температурах.На фиг.1 приведена динамика инактивации вируса Марбург в составе различныхпрепаратов при 20"С (где 1, 2, 3, 4, 5 -номера примеров приготовлений препарата); на фиг,2 - то же, при температуре 37 С;на фиг,3 изображена гель-хроматограммапроцесса очистки вируса Марбург на макропористых стеклах (где 1 - пик, соответствующий выходу основного количества вируса;2 - пик, соответствующий выходу балластного белка; Ч - обьем очищенного вирусногоматериала, используемый для приготовления препарата).Способ реализуется следующим образом,В работе использован вирус Марбург,полученный в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР. В качестве исходного материала берут плазму кровиинфицированных морских свинок с титром7,5 - 8,5 ц БОЕ/мл, Методы выделения виру са Марбург выбирают из условия сохраненияинфекционной активности при обеспечениинеобходимой степени очистки, Содержаниеобщего белка в очищенном материале определяют по методу Лоури в модификации.Определение потерь биологической активности проводят путем титрования вирусного материала по методу БОЕ на культуреклеток "Чего" под полужидким агаровым покрытием. Сравнение различных методов показывает, что использование одного извариантов зонального центрифугирования(осаждение через 30-ный раствор сахарозы), а также сочетание его с гель-хроматографией на макропористых стеклах (МПС), модифицированных поливинилпирролидоном (ПВП), наиболее эффективно (см, табл,1), Более тонкие и сложные методы выделения чистого вируса, такие как использование высокоскоростного центрифугирования в градиенте сахарозы, а также различные сочетания методов осаждения, ультрафильтрации, сорбционной хроматографии и других исследовались, но в дальнейшем не применялись, так как при этом получение чистого вирусного материала сопровождается увеличением трудоемкости, в частности, временных затрат, и, как правило, приводит к существенным потерям его биологической активности.Таким образом, жидкий вирусный материал осветляют низкоскоростным центрифугированием и дополнительно очищают отбалластных белков гель-хроматографией доостаточного содержания общего белка в очищенном материале, не превышающего1,0%. Для стабилизации выделенного вируса используют защитную среду, ранее применявшуюся для культурального вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающую следующие компоненты в концентрации,мг/мл;Мал ьтоза 50 Пептон 80 Желатин 10 Бычий сывороточныйальбумин 20 Тиосульфат натрия2,5 Внесение добавок производят сразу по приготовлению вирусной суспензии, очищенной до необходимой степени, Допускается хранение очищенного вирусного материала до внесения стабилизатора при 0"С(тающий лед) в течейие 1-2 ч, Выдерживание материала при комнатной температуре более 15 - 20 мин, а также его замораживание без стабилизатора не рекомендуется, так как это может вызвать значительное падение биологической активности. Лиофилизацию проводят на установке ЮА(ГДР). Замораживание материала с растворенными в нем защитными добавками проводят в камере лиофилизатора при температуре минус (35 - 40)С, после чего еговыдерживают при этой температуре не менее 2 ч, Высушивание осуществляют в течение 24 ч в вакууме (Р 0,1 мм рт.ст,) при температуре подогрева полок лиофилизатора 40 С. Остаточная влажность материала после высушивания не превышает 2,5.Хранение лиофилизатов осуществляют при20 С не менее 3 мес и при 37 С не менее 14 сут. Так как для ряда полученных вирусныхКаС; 0,001 м ЭДТА; 0,01 м трис-Н С 3 рН 7,5).Соотношение объемов осветленной плазмыи раствора сахарозы 3;1, Центрифугирование проводят на установке 12 - 21 "ВасКвап" (США) втечение 4 ч при 4 С и 18 тыс. 35об/мин, Надосадочную жидкость удаляют,осадок ресуспендируют с помощью гомогенизатора Даунса в фосфатном буферномрастворе с 0,15 м КаС, рН 7,5 вобъеме в5 - 10 раз меньшем, чем исходный объем 40плазмы, В полученный таким образом мате-риал вносят стабилизирующие добавки,растворяют, перемешивают смесь в течение5 - 10 мин, после чего лиофилизируют,При многократном воспроизведенииописанной в данном примере процедурыочистки вируса Марбург было установлено,что ее использование позволяет удалить неменее 99,0/ балластных белков, содержащихся в. исходном объеме плазмы крови 50морской свинки с титром 7,5 - 8,59 БОЕ/мл,Поэтому проведение дополнительного контроля содержания белка в очищенном материале не требуется,П р и м е р 4 (заявляемый способ). Выделяют вйрус центрифугированием с последующим ресуспендированием вгомогенизаторе Даунса в соответствиис примером 3. Полученный вирусныйматериал очищаютна колонке Я 1 х 50 см с препаратов отмечается нелинейный характер инактивации, сравнение заявляемогоспособа с аналогами и прототипом проводят путем сопоставления потерь биологической активности на стадии приготовления ипо истечении контрольных сроков хранения. Определение биотитра вирусного материала до и после высушивания, а также входе хранения проводят по методу БОЕ,П р и м е р 1(прототип). Кровь инфицированных морских свинок с гепарином (250 ед,/мл) центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин, Надосадочную жидкость (плазму) повторно осветляют при 10000 об/мин в течение 5 мин и добавляют стабилизатор. После растворения защитных добавок смесь перемешивают в течение 5 - 10мин, после чего лиофилизируют,П р и м е р 2 (аналог), Из печени инфицированной морской свинки готовят 10 гомогенат, центрифугируют в течение 10мин при 2000 об/мин, надосадочную жидкость собирают и еще раз осветляют при 10000 об/мин в течение 5 мин, после чеговносят стабилизатор и полученную смесь лиофилизируют.П р и м е р 3 (заявляемый способ), Готовят осветленную плазму в соответствии спримером 2. Затем ее наслаивают на 30/ раствор сахароэы на ЯТЕ-буфере (0,1 м 10 15202530 ПМС, модифицированными ПВП, марки СМП - 1 М - 1000, в режиме гель-фильтрации, Уравновешивание и элюцию при этом проводят фосфатным раствором с 0,15 м МаС, рН 7,50, скорость элюции раствора 1 мл/мин, Фракции, содержащие основное количество вируса (первый пик хроматограммы, см. фиг,3), объединяют, а в полученной вирионной взвеси растворяют стабилизирующие добавки, Смесь перемешивают в течение 5 - 10 мин, после чего лиофилизируют, Для данного примера степень очистки вируса от балластных белков на 1,-2 порядка выше, чем для примера 3, Дополнительного контроля содержания белка в очищенном материале не требуется,П р и м е р 5 (заявляемый способ), В исходной осветленной плазме определяют содержание белка по Лаури, Берут конкретный начальный объем плазмы и готовят из него очищенный материал в соответствии с примером 3, Затем к этому материалу добавляют рассчитанное количество исходной осветленной плазмы, чтобы суммарное количество белка в полученном жидком материале составляло 2 - 3 от количества, имевшегося в начальном объеме осветленной плазмы, Вносят стабилизирующие добавки, растворяют, перемешивают смесь в течение 5 - 10 мин, после чего лиофилизируют,Значение титров биологической активности препаратов на стадиях приготовления и при хранении для вышеуказанных примеров приведены в табл,2. В табл.3 приведены суммарные значения потерь инфекционности данных препаратов при высушивании и последующем хранении в течение 14 сут при 37 С и в течение 3 мес при 20 С, Из данных, приведенных на фиг.1, 2, а также в табл.2 и 3, следует, что препараты, приготовленные в соответствии с примерами 3 и 4 (по заявляемому способу) более термоустойчивы, чем в прототипе и аналогах(примеры 1 и 2), Их отличает повышенный по сравнению с исходной плазмой крови титр при меньших, чем для других способов, потерях биологической активности при высушивании и последующем хранении, При этом четко прослеживается закономерность повышения по сравнению с прототипом стабильности лиофилиэированных препаратов при увеличении степени очистки вирусного материала от балластных белков. Этот эффект начинает наблюдаться, когда содержание общего белка в очищенном материале перед внесением стабилизатора не превышает 1,0)ь от количества, имеющегося в исходном объеме плазмы, Однако степень очистки, соответствующаяналичию в жидком вирусном1808012 Табл ица 1 Сравнительная оценка методов выделения и очистки вируса Марбург ст лазмтво ла еса гра и Приводится по результатам не менее трех независимых зк ентов Таблица ачение титров биологическои активности препаратов, на стния х приготовления и хранеиофи ного 9 Б эла по/мл 20 ОС материале 2 - Зо балластных белков от суммарного количества, имевшегося в исходном объеме плазмы, уже не обеспечивает повышенной термоустойчивости препарата вируса Марбург при его хранении при положительных температурах (пример 5), Устойчивость вирусных препаратов, приготовленных в соответствии с заявленным способом, к воздействию положительных температур (20 и 37 С) позволяет широко применять этот способ в вирусологической практике для конверсации вируса Марбург и его последующего хранения без применения низкотемпературного холодильного оборудования, Кроме того, как видно из фиг,1 и 2, препараты, полученные из высококачественного материала (пример 4), имеют в отличие от доугих динамику инэктивации, по характеру близкую к линейной. Данное качество, а также высокая стабильность вирусного материала позволяют использовать этот способ для получения реперных (стандартных) образцов, наличие которых гарантирует качественное проведение экспериментов привирусологических исследованиях,5Формула изобретения1, Способ получения препарата вирусаМарбург. включающий получение вируссодержащего материала, осветление его цен 10 трифугированием с последующей очисткойв градиенте сахарозы, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что жидкий вируссодержащий материал получают из плазмы крови инфицированных морских свинок, дополнительно очищают15 от балластных белков до содержания общегобелка не более 1,0, смешивают с защитной средой и лиофилизируют,2. Способ по п,1, о т л и ч э ю щ и й с ятем, что дополнительную очистку жидкого20 вируссодержащего материала осуществляют гель-хроматографией,10 1808012 Примечание; был наработан на одно ны средние значения т казаны значе ирусного мат я титров, приала. нные к единиц Таблицапарата при лиофилизации и хранении ые о потерях биологической активност Тлт; Вре меняя, мес,иг,1 сходный материэ В таблице приведопределениям.Для лиофилизато исходного обьем е с Продолжение табл, 2 артии животных,ов по трем независимы