Способ получения белков с мол. м. 32000-34000, подавляющих свертывание крови

(71) Берингер Инналь ГмбХ (1)Е)(56) Нао 3,1ша Ргосеп Ега1 пя, .1.опс 1 оп е1980, р. 62-64. л, Р 36гельгейм Интернацио ер Мария Ройтелингс 8.8)ес а 1. МесЬсс 1 опасдоп,се: Асас 1 ешд с 1 я оГ Р 1 ая/Ес 1,3,М,СцгРгеяя,И в час УДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯГКНТ СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЧ БЕЛКОВ СМОЛ.М. 32000-34000, ПОДАВЛЯИ 1 цИХ СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской биотехнологии, Цель изобретения - повышение качества целевого продукта засчет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании.Для этого внутреннюю оболочку аортили васкуляризованную ткань гомогенизируют.в растворе 100 ммоль/л хлористого натрия, 50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана,рН 7,5 (ТВБ), содержащем этилендиаминтетраацетат натрия,ингибитор трипсина из соевых бобов и бензамидин,ретение относится к медицине,ости к медицинской биотехноломожет быть использовано для поГомогенат центриАугируют 60 мин при 100000 Р. Из надосадочной жидкости целевой продукт осаждают высаливанием сульаатом аммония, После центриАугирования при 10000 - 12000 д полученный осадок растворяют в малом объеме ТВЯ, диализуют против ТВБ, содержащего бензамидин. Диализованную Аракцию подвергают очистке с помощью хроматограйии на гидроксиапатите, диализу, ионообменной хроматограАии на сеАацеле с диэтиламиноэтиловыми группами, повторному диализу, Полученнуюакцию концентрируют с помощью ультр Аильтрационной мембраны Р 11-10, Дальнейшую очистку проводят либо хро- сФ матограАией на сеАадексе Сс последующим диализом, либо с помощью гель-Аильтрации на суперозе,ионообменной хроматограАии на анионите Моно Ц и повторной гель-Аильтрации на суперозес последующим диализом, Б Изобретение позволяет добиться получения целевого продукта более высокого качества, который в отличие от получаемого в способе-прототипе антитромбина, не вызывает инактивации Фактора свертывания крови Ха и тром- бина и поэтому не приводит к склонности к кровотечениям при его использовании, Целевым продуктом являются белки с мол,мас, 32000 и 34000 и значениями изоэлектрической точки при рН 4,4-4,6,Ъ учения белков с мол,м. 32000-34000,одавляющих свертывание крови.3 51247Целью изобретения является ловьшение качества целевого продукта засчет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании,На чертеже изображен профиль гель 5Аильтрации на сефадексе С, используемой на заключительной стадии очистки целевого продукта в примере 1.Способ осуществляют следующим образом.Внутреннюю оболочку (интиму) аортили васкуляризованную ткань гомогенизируют в растворе 100 ммоль/л ИаС 1,50 ммоль/л трис-НС 1, рН 7,5 (ТВЯ), со держащем этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), ингибитор трипсина нз соевых бобов и бензамидин, Гомогенатцентрифугируют в течение 60 мин при100000 р, Из надосадочной жидкостицелевой продукт осаждают с помощьювысаливания сульфатом аммония. ПослецентриАугирования при 10000-12000 яполученный осадок растворяют в маломобъеме ТВБ, диализуют против ТВБ,содержащего бензамидин, ДиализованнуюАракцию подвергают очистке с помощьюхроматбграфии на гидроксиапатите,диализа, ионообменной хроматограАии на сеАацеле с диэтиламиноэтиловыми группами (ДЕЛЕ - сефацеле), повторного диализа. Полученную фракцию,содержащую ЧАС-белки (чазсц 1 ат аптсоади 1 апс - противосвертывающее средство сосудистого происхождения),концентрируют с помощью ультраАильтрационной мембраны Лш 1 соп РМ,Дальнейшую очистку проводят либо хроматограАией на сефадексе Сс последующимдиализом, либо с помощью гель-Аильтра 40ции на суперозе, ионообменной хроматограАии на анионите Моно Я и повторной гель-фильтрации на суперозе с последующим диализом,Целевым продуктом являются белкис мол,м. 32000-34000, подавляющиесвертывание крови, но отличающиеся посвойствам от получаемого в способепрототипе белкового антикоагулянтаантитромбина,П р и м е р 1, В течение 30 минпосле забоя у крупного рогатого скота берут аорты. Кровь крупного рогатого скота собирают с добавлением цитрата натрия трехзамещенного до конечной концентрации 0,38 вес.7. и центрифугируют в течение 10 мин при комнатной температуре 2000 р, Полученную плазму, содержащую небольшое ко 3 4личество тромбоцитов, центрифугируютв течение 15 мин при 10000 р, Такимобразом получают плазму, свободнуюот тромбоцитов (РГР), которую используют для определения противосвертывающей активности Аракций,Непосредственно после сбора аортыживотных тщательно промывают ТВБ, Интиму отделяют от аорты и гомогенизируют в гомогенизаторе типа Баун ИХ 32,в ТВЯ с 2 ммоль/л ЭДТА (ТВЯЕ), который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и 1,57 г/л бензамидина,Гомогенат из 8 аорт, который содержит 207 (вес,/объем) твердого вещества, центриАугируют в течение 60 минпри 100000 р,1В надосадочную жидкость добавляют порошок сульАата аммония до 307 от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 мин при 12000 В получаемую при этом надосадочную жидкость добавляют порошок сульАата аммония до 907. от насыщающей концентрации, перемешивают в течение 30 мин и центриАугируют в течение 20 мин при 12000 Р. Полученный осадок растворяют в малом объеме ТВБ и подвергают диализу против ТВБ, содержащего 1,57 г/л бензамидина. Диализованную Аракцию подают на колонку (1 х х 20 см) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена ТВЯ, Колонку промывают ТВБ в количестве, соответствующем 4 объемам колонки. ЧАС-белки элюируют из колонки 200 мл натрийфосАатного буйера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 ммоль/л, Фракции,содержащие ЧЛС-белки, объединяют и подвергают диализу против 50 ммоль/л ИаС 1, 20 ммоль/л трис/НС 1, рН 7,5 (трис-трис/оксиметил/-аминометан).Такой же буАер применяют также для уравновешивания колонки (Зх 5 см), содержащей ДЕЛЕ-сеАацель. В этой колонке диализат подвергают хроматограАии,Колонку промывают применяемым для уравновешивания буАером, который берут в количестве, соответствующем 4 объемам колонки, Затем ЧАС-белки элюируют из колонки с использованием 200 мл раствора МаС 1 , 20 ммоль/л трис/НС 1, рН 7,5 с линейным градиентом ИаС 1 50-300 ммоль/л, Фракции, содержащие ЧАС-белки. собирают, диализуют про1 э 12473 40 5тив 500 ммоль/л ИаС 1, 20 ммоль/лтрис/НС 1, рН 7,5 затем концентрируютс помощью ультрафильтрационной мембраны Аппсоп РМ, Концентрат объемом,2 мл подают на колонку (Зх 80 см) с се 5факдесом С, которая была уравновешена 500 ммоль/л ИаС 1 и 20 ммоль/лтрис/НС 1, рН 7,5, Элюат собирают фракциями пс 2 мл, активные фракции, содержащие ЧАС-белки с мол,мас,32000и 34000, диализуют против содержащего 10 об,% глицерина ТВБ и хранятопри -70 С. Все стадии очистки провоодят при 0-4 С.15Определение противосвертывающейактивности содержащих ЧАС-белки фракций проводят следующим образом,В кювете из силиконизированногостекла перемешивают (900 об/мин)20175 мкл испытуемой фракции (или175 мкл ТВЯ в качестве контроля)вместе с 50 мкл РРР и 25 мкл разбавленного бычьего тромбопластина (БТР),После инкубации в течение 3 мин при37 С вызывают коагуляцию путем добавления 250 мкл буфера, который содержит 80 ммоль/л МаС 1, 20 ммоль/л СаС 1и 10 ммоль/л трис/НС 1, рН 7,5, Образование фибрина регистрируют оптически,Время свертывания контрольной пробысоставляет 65 с, Это испытание применяют во время очистки для исследования различных фракций на наличиеЧАС-активности, Для определения выхода ЧАС-белков во время очистки опре 35деляют единицу ЧАС-активности, как такое количество ЧАС-белков, которое удлиняет время свертывания при вышеуКааэанном испытании до 100 с.В данном примере получены следующие результаты,1.,Надосадочная жидкость после первого осаждения сульфатом аммония (30%от насыщения): 630 мг белка,19500 ед, ЧАС-активности, удельнаяактивность : 31,0 ед/мг;выход 100%;степень очистки 1,0.2. Осадок после второго осаждениясульфатом аммония (90% от насыщения),470 мг белка;19000 ед. ЧАС-активности;удельная активность 40,4 ед/мгстепень очистки 1,3,553, Фракция после хроматографиина гидроксиапатите:206 мг белка;17300 уд. ЧАС-активности,6удельная активность 84,0 ед/мг;выход 89%,степень очистки 2,7,4, Фракция после хроматографии наДЕАЕ-сефацеле: 35,8 мг белка;13900 ед, ЧАС-активности,удельная активность 388 ед/мг,Выход 71%;степень очистки 12,5,5. Фракция после хроматографиина Сефадексе С;0,45 мг белка;666 ед, ЧАС-активности;удельная активность 1480 ед/мг;вход 3,4%степень очистки 47,7,Количество белка определялосьпо методу 1.оту и сотр. (1951),П р и м е р 2, Через 15 минпосле родов собирают человеческие пуповины, Артерии сразу же промываютледяным буфером ТВБ, после чего гомогенизируют в гомогенизаторе типаБраун ИХ 32, в ТВЯЕ, который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсинаиэ соевых бобов и 1,57 г/л бензамидинаГомогенат, который содержит 10%(вес/объем) твердого вещества, центрифугируют в течение 60 мин при100000 д, В надосадочную жидкостьдобавляют порошок сульфата аммониядо 30% от насыщающей концентрации,перемешивают в течение 30 мин и затем центрифугируют в течение 20 минпри 100000Полученный осадок растворяют вмалом объеме ТВБ и подвергают диалиэупротив ТВЯ, содержащего 1,57 г/лбензимидина.Диализованную фракцию подают на колонку (1 х 20 см) с гидроксиапатитом, которая была уравновешена ТВЯ.Колонку промывают ТВБ в количестве,соответствующем 4 объемам колонки.ЧАС-белки элюируют из колонки 200 млнатрийфосфатного буфера (рН 7,5)с линейным градиентом 0-500 ммоль/л.Фракции, содержащие ЧАС-белки, объединяют и подвергают диализу против50 ммоль/л ИаС 1, 20 ммоль/л трис/НС 1,рн 7,5.Такой же буфер применяют для уравновешивания колонки (Зх 5 см),содержащей ДЕАЕ-сефацель. В этой колонкедиализат подвергают хроматографии,Колонку промывают применяемым дляуравновешивания буфером, который берут в количестве, соответствующем 4объемам колонки. Затем ЧАС-белкиэлюируют из колонки с использованием200 мл раствора ИаС 1 н 20 ммоль/лтрис/НС 1, рН 7,5, с линейным градиентом ИаС 1 50-300 ммоль/л, Фракции9содержащие белки-ЧАС, собирают, диализуют против 500 ммоль/л ИаС 1,20 ммоль/л трис/НС 1, рН 7,5 и затемконцентрируют с помощью ультрафильтрационной мембраны Аппсоп РМ,1(онцентрат объемом 2,мл подают наколонку (Зх 80 см) с сеЬадексом С,которая была уравновешена 500 ммоль/лИаС 1 и 20 ммоль/л трис/НС 1, рН 7,5.Эгпоат собирают Фракциями по 2 мл, 15активные Аракции, содержащие ЧАС-белки с мол,мас, 32000 и 34000, диализуют против содержащего 10 об,глицерина ТЬБ и хранят при -70 С,Все стадии очистки проводят при 0-4 С,20П р и м е р 3, Получаемую непосредственно после родов человеческую плаценту охлаждают до 4 С и освобождаютот крови. Удаляют мембранный материал и гомогенизируют в буфере ТВБ срН 7,4, который содержит 157 мг/млингибитора трипсина из соевых бобов,1,6 г/л бензамидина и 1 ммоль/лЭЛТА, Гомогенат, который содержит20% (вес,/объем) твердого вещества,центриАугируют н течение 60 мин при100000 р, В надоев,"очную жидкостьдобавляют порошок су;.:ьЬата аммониядо ЗОБ от насыщающей концентрации,перемешивают в течение 30 мин и за 35тем центрифугируют в течение 20 минпри 10000 ;,Полученный осадок растворяют н малом объеме ТВБ и подвергают диализу против ТВБ,содержащего 1,57 г/л бензамидина, Диализованную Фракцию подают наколонку (1 х 20 см) с гидроксиапатитом,которая была уравновешена ТВБ, Колонку промывают ТВБ в количестве,соответствующем 4 объемам слоя колонки, 45ЧАС-белки элюируют из колонки 200 млнатрийфосАатного буфера (рН 7,5)с линейным градиентом 0-500 ммоль/л,Фракции, содержащие ЧАС-белки, обьедцпяют и подвергают диализу против50 ммоль/л ИаС 1, 20 ммоль/л трис/НС 1,50рН 7,5,Содержащие ЧАС-белки Фракции подвергают дальнейшей очистке путемразделения на колонке с ДЕАЕ-сефацелем, Колонка была уравновешена5520 ммоль/л трис/НС 1 буфером с50 ммоль/л хлористого натрия, рН 7,4,Связанные ЧАС-белки элюируют тем же буфером с 300 ммоль/л хлористогонатрия, рН 7,4. Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре следующие хроматографические операции:-, гель-Фильтрацию содержащих ЧАС-белки Фракций на колонке ссуперозой(торговый продукт шведской Аирмы Фармация, который представляет собой сшитую агарозу с величинойчастиц 10 мкм), которая была уравновешена буйером 20 ммоль/л бис-трис/НС 1100 ммоль/л хлористого натрия, рН 6,3,и ионообменную хроматограАию элюатана Моно О (торговый продукт шведскойФирмы Фармация, который представляетсобой анионллт шариковой структуры свеличиной частиц 10 мкм), который былуравновешен применяемым на предыдущейстадии буАером, Элюцию осуществляют сиспользованием линейного л"радиентахлористого натрия в 20 ммоль/лбис-трис/НС 1, рН 6,3, ЧАС-белки элюируют при 190 ммоль/л хлористого натрия. Затем содержащие ЧАС-белки фракции подвергают повторной хроматограФии на суперозе, После диализа против буАера ТВБ Фракции, содержащиеЧАС-белки с мол.Фас,32000 и 34000,хранят при -70 СП р и м е р 4. В течение 30 минпосле забоя у крупного рогагого скота берут аорты,Непосредственно после сбора аортыосновательно промывают ТВБ, Интимуотделяют от аорты и гомогенизируют вгомогенизаторе типа Браун МХ 32, вТВБЕ, который содержит 16 мг/мл ингибитора трипсина из соевых бобов и1,57 г/л бензамидина,Гомогенат центрифугируют в течение60 мин при 100000В надосадочную жидкость добавляютпорошок сульфата аммония до ЗОотнасыщающей концентрации перемешиваютв течение 30 мин и центриАугируют втечение 20 мин при 12000 я, Твердоевещество суспендируют в малом объемеТВБ и подвергают диализу против ТВБ,содержащего 1,57 г/л бензамидина.Диализованную Аракцию подают на колонку (1 х 20 см) с гидроксиапатитом,которая была уравновешена ТВБ. Колонку промывают ТВБ в количестве, соответствующем 4 объемам колонки, ЧАСбелки элюируют из колонки 200 мл натрийфосАатного буАера (рН 7,5) с линейным градиентом 0-500 глмоль/л, 1512473 1040 50 7,9+ 1;06,9+0,87,4+1,813,4+2,22,34. 1,27,9 ф 1,84,6+0,41,4+0,2 Азх ТМ Бег С 1 х Рго 01 у А 1 а Ча 1 Мег. 55 Содержащие ЧАС-белки фракции подвергают дальнейшей очистке путем разделения на колонке с ДЕАЕ-сефацелем.Колонка была уравновешена 20 ммоль/лтрис/НС 1 буАером, 50 ммоль/л хлорис 5того натрия, рН 7,4,Связанные ЧАС-белки элюируют сиспользованием 200 ммоль/л трис/НС 1буфера, 300 ммоль/л хлористого натрия,10рН 7,4, Затем последовательно осуществляют при комнатной температуре следующие хроматограАические операции:гель-Аильтрацию содержащих ЧАС-белкиАракций на колонке с суперозой, ко торая была уравновешена буйером20 ммопь/л бис-трис/НС 1, 100 ммоль/лхлористого натрия, рН 6,3, и ионнообменную хроматографию элюата наанионите Моно О, который был уравновешен применяемым на предыдущейстадии буфером. Элюцию осуществляют сиспользованием линейного градиентахлористого натрия в 20 ммоль/лбис-трис/НС 1, рН 6,3, ЧАС-белки элюируют при 190 ммоль/л хлористого1натрия, Затем содержащие ЧАС-белкифракции подвергают повторной хроматографии на суперозе 12, После диализапротив буАера ТВБ Аракции, содержащие ЧАС-белки с мол, мас,32000 и34000 хранят при -70 С, Все стадии9оочистки проводят при 0-4 С.С помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии35додецилсульйата натрия установлено,что получаемая ЧАС-активность представлена двумя белками с мол.мас.32000 и 34000,Изоэлектрофокусирование при рН3,5-9,5 в тонкослойных пластинахполиакриламидного геля показало, чтоЧАС -белки имеют значения изоэлектрической точки при рН 4,4-4,6,Аминокислотныи состав обоих ЧАСбелков, определяемый с помощью кислотного гидролиза, представлен втаблице (Тгр не определялся).6,5+0,6 12,0+2,4 3,7 +0,4 3,7 10,6 6,5+ 1,2 1,4+0,8 5,6+2,0 Ле 1.еи Туг РЬе 1.уз Ндз Агц При хранении в ТВБ, содержащем 10 об.Е глицерина, ЧАБ-активность стабильна по крайней мере в течение 3 мес при -70 С, при ОС - по крайней мере 12 ч, при 37 С - по крайоней мере 30 мин, При 56 С активность исчезает в течение 2 мин,Получаемый в способе-прототипе антитромбинприводит к увеличе" нию склонности к кровотечению, что обусловлено тем, что он связывается с активированными Аакторами свертывания крови, в результате чего имеет место их инактивация. Получаемые же По своей биологической активности ЧАС-белки могут быть охарактеризованы следующим образом:- они тормозят активацию протрайбина с помощью фактора свертываемости крови Ха в присутствии отрицательного заряженных фосАолипидов и ионов Са- они не тормозят биологическую и амидолитическую активность Аакторов Ха и Па,- они тормозят дп чдгго активацию Аактора Х по внутреннему пути с помощью Фактора ЕХа в присутствии отрицательно заряженных Лосфолипидов и и ионов Са;- они тормозят дп чдгго индуцированное стенкой сосуда свертывание крови;- они вытесняют фактор Ха и протрамбин из комплекса с отрицательно заряженной поверхностью Аосфолипидов;- они удлиняют тромбиновое время, определенное модифицированным методом;- они удлиняют активированное, частичное тромбопластиновое время, определенное модиАицированным методом;они удлиняют протромбиновое время;- на их активность не оказывают влияние коллагеназа и/или эластаэа.12 1512473 Формула изобретения г э Ъ :т ппь О,О,ВП ПП 12 П Ца ИП ВО гаоуо ррщцдl Составитель В.ГудошниковТехред Л,Сердюкова Корректор М.Шароши Редактор А,Долинич Заказ 5914/59 . Тираж 643 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 предлагаемым способом ЧАС-белки занимают только каталитическую поверхность факторов свертывания крови безих инактивации, Антитромбининактивирует фактор Ха и тромбин в результате реакции псевдо 1-го порядкас коэффициентом скорости 0,32 мин ,Этот коэффициент у получаемых предлагаемым способом ЧАС-белков равеннулю. Способ получения белков с мол,м, 32000-34000, подавляющих свертывание крови, путем осаждения целевого продукта с последующей очисткой хроматографией, концентрированием и обессоливанием с помощью ультрафильтрации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения качества целевого продукта за счет предотвращения склонности к кровотечениям при его использовании, в качестве сырья используют внутренние оболочки аортили васкуляризованную ткань, предварительно перед осаждением проводятих гомогенизацию в раствореих гомогенизацию в растворе100 ммоль/л хлористого натрия,50 ммоль/л гидрохлорида трис-(оксиметил)-аминометана с рН 7,5, содержащем этилендиаминтетраацетат натрия,ингибитор трипсина из соевых бобов ибензамидин, гомогенат центрифугируютв течение б 0 мин при 100000 я, целевой продукт осаждают высаливаниемсульфатом аммония, а очистку проводятхроматографией на гидроксиапатите,диализом, ионообменной хроматографиейна сефацеле с диатиламиноэтиловымигруппами, повторным диализом, затемпроводят либо хроматографию.на сефадексе С=100 с последующим диализом,.либо гель-фильтрацию на суперозе,ионообменную хроматографию на анионите Моно О и повторную гель-фильтрацию25 на суперозес последующим диализом,1