Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита а

СООЗ СОВЕТСНИХСОЦИДЛИСТИЧЕСНИКРЕСПУБЛИК 09) 1 И) СС 1) 5 С И 15/00, А 6 ИЯ ИЗОБР ЕТЕЛЬСТ КОДЙ- БСТАНируса ектор что,их В Р и о ой ктур иру ж и одирующии 7 а.к ДНК, кос 11 рук 1;ф Об ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ А ВТОРСНОМУ(.71) Институт биоорганической химии им. М.М, Шемякина, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов.АМН СССР, Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярнойбиологии и Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов(54)(57) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯААТТСАСАСТТАСТАСТСААСААААТСТ СТСТ СААТСАТСАСТТСТТТ С или фрагмент длиной 4296 п,о содеращий фрагмент длиной 3372 п.о., одирующий все структурные и некото ые. неструктурные белки ВГА, и фрагент длиной 924 п.о., кодирующий ирусную апротеазу, способную расщепять синтезируемый вирусным геномом непрерывный полипептид на отдельные елки, а в качестве экспрессирующео вектора используют плазмиду рцэр 2РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНКРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДНЫХ СУЦИЙ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А, включаювстраивание фрагмента генома.гепатита А в экспрессирующийотличающийся тем,с целью получения полипептидньсубстанций, способных вызыватзование антител при введенииорганизм животных, в качествемента генома вируса гепатитапользуют Фрагмен ". длиной 389кодирующий фрагмент белка ПР 1по 129 а.к., или фрагмент дли3372 п.о., кодирующий все стрные белки, начиная с 38 а.к.11 Р 4, и неструктурные белки ВГфрагмент длиной 1243 п.о., коющий полипептидную цепь, содефрагменты белков ПРЗ со 10 п233 а.к. и НР 1 с 1 по 271 а.кфрагмент длиной 144 п.,о кфрагмент белка Р 1 с 4 по 5или синтетический фрагментдируюший фрагмент белка ПРпо 25 а.к., имеющий следующуютуру:АСАТССАСАССТАССТАТТССС САТССТСТАССТСТССАТССАТААССТАС,291, обеспечивающую синтез полипептидов, содержащих полную р -галактозидазу, слитую с белками ВГА, в бактериальных клетках, или плазмидур 1 Б 292, обеспечивающую синтез полипептидов, содержащих полную р-галактозидазу, слитую с белками ВГА,в дактериальных клетках, или плазмиду р 1 РИ"Гц 1, обеспечивающую синтезполипептидов, содержащих полньп т-и146985 б терферон человека, слитый с белкамиВГА, в бактериальцых клетках, илиплавкиду рвР 1 Ш, встраиваемую в вектороеповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в животных клетках,нли плазмиду рБРББ, встраиваемуюи вирус осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в ораганизмахживотных. Целью изобретения является получение полипептидных субстанций, способнык вызывать образование антител при введении их в организм животных. СТСТСААТСАТСАСТТСТТТТАСАТССТСТАССТСТССАТССАТААССССТАС,1а в качестве экспрессирующих векто- слитые с р-галактоэидазой фрагменров используют любой экспрессирую 35ты белков ВГА или плазмиды р 1 РН-Гц щий вектор, обеспечивающий синтез и р 1 ГМ-Хи 2, состоящие из большего требуемых вирусных белков в Е. соК 1-Рз 1 Фрагмента плазмиды рВК бактериальных или животных клет, гена зрелого у-интерферона ках в частности плазмиды рЖ человека, находящегося под контролемУ291 и рБК 292, которые обеспечива-гр-промотора Е. со 11, в котором терют синтез полипептидных субстанций минирующий кодон убран с помощью в бактерияльных клетках, например, зндонуклеазы рестрикации Н 1 пй 1 и зав штаммах " со 11 К 12, Полипептид- менен синтетическими Фрагментами ДНК, ные субстанции представляют собой д имеющими следующую структуру:АСТ САС АТС СТС ТТТ САА ССТ ССА АСА ССА ТСС САС АСТ ССА СТС ТАС САС ААА СТТ ССА ССТ ТСТ ССТ АСС СТС ТСАСТ САС АТС СТС ТТТ САА ССТ ССА АСА ССА ТСС САА САТ СТС СА СТС ТАС САС ААА СТТ ССА ССТ ТСТ ССТ АСС СТТ СТА СП р и м е р 1, 5 мкг плазмиды Требуемый фрагмент элюируют феноль- рЮК 291 расщепляют в стандартных ус-" ной экстракцией после электрофореловиях эндонуклеазой рестрикции за в низкоплавкой агарозе. ПолученРэс 1. Реакционная смесь содержит ный фрагмент лигируют с Рэг; Фраг" 10 мМ трис-НС 1, 10 мМ,М 8 С 1, 10 МИ 55 ментом длиной 389 п.о., выделенным 2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмидной из плазмиды рНАБ 22. Лигазной смесью ДНК и 5 е,а. Фермента. Инкубацию осу- трансформируют компонентные клетки ществляют при 37 С в течение 1 ч. штамма Е, со 11 ВМН 71-18. Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано для получениягенно-инженерной вакцины против ге"патита А.5 В качестве генома вируса гепатита А (ВГА ) используют фрагмент длиной 429 б п,о., содержащий25фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные,и некоторые неструктурные белки ВГА,и фрагмент длиной 924 п.о., кодирующий вирусную протеаэу, способную расщеплять синтеэируемый вируснымААТТСАСАСТТАСТАСТСААСААААТСТАССА геномом непрерывный полипептнд наотдельные белки,или фрагмент длиной 3372 п.о.,кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА;или фрагмент длиной 1243 п.окодирующий полипептидную цепь, содержащую фрагменты белков БРЗ со110 по 233 а.к. и ЦР 1 с 1 по271 а.к.;или Фрагмент длиной 389 п.о.,кодирующий фрагмент белка БР с 4по 129 а.к.;или фрагмент. длиной 144 и.о.,кодирующий фрагмент белка 1 Р 1 с 4по 57 а.к,;или синтетический фрагмент ДНК,кодирующий фрагмент белка БР 1 с 1по 25 а.к., имеющий следующую структуру:САТССАСАССТАССТАТТССС5 146Клоны, содержащие плазмиды с нуж ной ориентацией фрагмента, наращива-,ют в ЬВ-среде с ампициллином и 1 РТО,синтезируемый гибридный белок, содержащий полную р-галактозидазуи фрагмент белка УР ВГА (с 4 по129 а,к.), выделяют из бактериальных клеток и используют для иммуни"зации морских свинок и кроликовЧерез несколько недель после завершения курса иммунизации сывороткуморских свинок и кроликов тестируютна содержание антител, способныхсвязываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами,В результате иммунизации у однойиз трех морских свинок и у одногоиз трех кроликов в сыворотке былиобнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА.П р и м е р 2, 5 мкг плазмидырай 292 расщепляют в стандартныхусловиях эндонуклеазой рестрикцииРз. Реакционная смесь содержит10 мМ трис-НС 1, 10 мМ МяС 1, 10 мМ2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмиднойДНК и 5 е.а. Фермента. Инкубацию осуществляют при 37 С в течение 1 ч,Требуемый фрагмент элюируют фенольной экстракцией после электрофорезав низкоплавкой агарозе, Полученныйфрагмент лигируит с Рз фрагментомдлиной 3372 п.о выделенным из плазмиды рНАП 23 (ДАН СССР, 1985, т, 285,1014) в реакционной смеси, содержащей 0,1 мкг векторной ДНК, 0,1 мкгДНК-вставки в вьшеприведенном буферев присутствии гАТР (О, мМ), Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. со 1 д ВМН 71-18в клонах, содержащих плазмиду совстроенным фрагментом, определяюториентацию последнего с помощью эндонуклеазы рестрикции ВашН 1.Клоны, содержащие плазмиды с нуж"ной ориентацией фрагмента, наращивают в 1.В-среде с ампициллином и 1 РТС,синтезируемык гибридный белок, содержащий полную А-галактозидазу,все структурные (начиная с 38 а.к.белка 1 Р 4) и часть неструктурныхбелков ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют для иммунизации морских свинок.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворот ку морских свинок тестируют на со 985 б 50 55 5 О 15 20 25 30 35 40 45 держание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами,В результате иммунизации у однойиз четырех свинок в сыворотке былиобнаружены антитела, способные связываться с нативным ВГА.П р и м е р 3. 5 мкг плазмидыр 1 РМ"йц расщепляют в стандартныхусловиях эндонуклеаэной рестрикцииРзс 1, как описано в примере 1. Полученный фрагмент лнгируют с Рзйфрагментом длиной 389 п.о., выделен-.ным из плазмцды рНАП 22, Лигазнойсмесью трансформируют компетентныеклетки штамма Е,. со 11. НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеазрестрикции Вя 111 и ВашН 1.Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в среде Мс тетрациклином и бета-индолилакриловой кислотой, Синтезируемый гибридный .белок, содержащийполный гамма-интерферон человека ифрагмент белка БР 1 ВГА (с 4 по129 а.к.), выделяют из бактериальныхклеток и используют для иммунизации -морских свинок и кроликов.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сывороткуморских свинок и кроликов тестируютна содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антитела"ми,Многие из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела, способные связываться с натив-.ным вирусом.П р и м е р 4. 5 мкг плазмидыр 1 РМ-Юи рНАП 22 расщепляют в стандарт"ных условиях эндонуклеазой рестрикции Вя 11 и затем Рз 1, как описанов примере 1, Полученный больший фрагмент лигируют с Вя 11 - (ЛРцц 11)Рзг.фрагментом длиной 1243 п.о., вьделенным из плазмиды рНА 123. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е,.со 1 НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции ЕсоВ. и Ваш 1,Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращиваютв среде Мс, тетрациклином и р -индЬ- дилакриловой кислотой, синтезируемый гибридный белок, содержащий полный 7 ф-интерферон человека и фрагменты белков ОРЗ (со 11 О по 23,а.к.) и УР5 (спо 271 а.к.) ВГА, выделяют из бактериальных клеток и используют дпя иммунизации морских свинок и кро:ликов10Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют иа содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурент,ной реакции с человеческими антитела,мифБольшинство иммунизированных морс,ких свинок и кроликов содержали антителаа .в достаточно высоких концентра циях, способные связываться с нативным вирусом.П р и м е р 5. 5 мкг плазмиды рРИ-Ец 2 расщепляют в стандартных условиях зндонуклеазной рестрикции Рай, как описано в примере 1. Полученньи фрагмент лнгируют с Рз 1 фрагментов длиной 3372 п.о выделенньщ из плазмиды рНАП 23. Лигаэной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. со 1 х НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью зндонуклеаз рестрикции Вя 111 н ЕсоК 1.Клоны, содержащие плазмиды (р 1 РИГц 2-рНАП 23) с фрагментом в нужной ориентации, наращивают в среде Мс тетрациклином и р-индолилакрило"- вой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный у-интер" ферон человека и все структурные (начиная с 38 а.к. ОР 4) и часть неструк-: турных белков ВГА, выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тести-, руют на содержание антител, способ50 ных связываться с нативиым ВГА в конкурентной реакции с человеческими ангителами.Большинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали анги 55 тела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с натив-, иым вирусом. П р и м е р 6. 5 мкг плазмиды р 1 РИ-Гц расщепляют в стандартных условиях эндонуклеаэой рестрикции Рва, как описано в примере 1, Полу" ченный фрагмент лигируют с Рв- ВашН 1 фрагментом длиной 44 п.о., кодирующим фрагмент блока УР с 4 по 57 а.к., выделенным из плазмиды РНА 122, и синтетическим адаптором, имеющим следующую структуру:САТ ССА СТТ ТАА СТС СА СТ САА АТТ С Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. со 1 х НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции ЕсоЮ и Ваш 1.Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в среде Ис. тетрациклином и . риндолилакриловой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный у -интерферон человека и фрагмент 1 Р белка ВГА (с 4 по 57 а.к.) выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свинок и кроликов.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.Большинство иммунизированных морс" ких свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с нативным вирусом.П р и м е р 7. 5 мкг плазмиды р 1 РЮ-Гц 1 расщепляют в стандартных условиях зндонуклеазой рестрикции Рзй 1; как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с синтетическим фрагментом ДНК, кодирующим фрагмент белка Р с 11 по 25 а.к. и адапторным фрагментом, имеющим следующую структуру:С ССТ ТСС С АС СТС ССТ АСС СТТ АА Клоны, содержащие фрагменты внужной ориентации, наращивают всреде Мс тетрациклином и р-индолилакриловой кислотой. Синтезируемый-интерферон человека и фрагмент бел 5ка 13 Р ВГА с 11 по 25 а.к., выделяют из бактериальных клеток, используют для иммунизации морских свиноки кроликов.Через несколько недель после за" 1 Овершения курса иммунизации сывороткуморских свинок и кроликов тестируютна содержание антител, способныхсвязываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.Некоторые из иммунизированныхморских свинок и кроликов содержалиантитела в достаточно высоких концентрациях, способные связываться с 20нативным вирусом,П р и м е р 8, 5 мкг плазмидырБРБИ расщепляют в стандартных условиях эндонуклеазой рестрикции ВашН 1,как описано впримере 1, Полученный 25фрагмент лигируют с Рзг фрагментомдлиной 3372 п.о., выделенным из плазмиды рНАП 23, с синтетическим фрагментом ДНК следующей структуры:30САТССТ АТС АСС АСТ ССАСА ТАС ТСС ТС Лпгазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. со 11 ДН ив клонах, содержащих плазмиду совстроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего.В ДНК плазмид, содержаших фрагмен- .ты в нужной ориентации, определяютструктуру сочленения методом Максама-Гилберта.ДНК плазмиды рБР-НА 1-Р с подтвержденным сиквенсом сочленением,кодирующую синтез полипептида, содержащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка 1 Р 4) .и некоторые не- структурные белки ВГА, используют.для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии С 11, зараженныхвирусом осповакцины штамма ЛИВП.Урожай вируса после трансформациивысевают на эмбриональные фибробласты крысы перевиваемой линииВАТ 2 Ы-фенотипа. В присутствии бромдезоксиуридина клонируют рекомбинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последова"тельности ВГА (ЛИВП"рБРШ-НА 11-Р),наращивают иа клетках ВАТ 2 .на среде Эп 1 Ьессо в ИЕМ с Я сывороткиноворожденных телят. Синтезируемый.белок ВГА в виде клеточных лизатовиспользуют для Иммунизации морскихсвинок и кроликов.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сывороткуморских свинок и кроликов тестируютна содержание антител, способныхсвязываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.Большинство иммунизированных морс-ких свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентрациях, способные ИЬязываться с нативным вирусом,П р и м е р 9. 5 мкг плазмидырБРЛ 1-НАП-Р, содержащей фрагментгенома ВГА длиной 3372 п.о., расщепляют частично Рзй 1, как описано впримере 1. Полученную линейную формуплаэмиды лигируют с Рай фрагментом924 по., выделенным из плазмидырНАП 5-ргог, кодирующим вирусную протеазу.Лигазной смесью трансформируюткомпонентные клетки Е, со 1 д ДН 1 и вклонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определяют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Ваш Н 1, РоцП, Надай 6,В ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определяют структуру сочленений методом Максама-Гилберта. ДНК плазмиды рБРЛ 1-НАП-Р-ргойеа с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содержащего все структурные (начиная с 38 а.к. белка ОР 4) и некоторые неструктурные белки ВГА, используют для трансформации клеток почек зеленой мартышки линии СП 1, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛНВП. Урожай вируса после трансформации высевают на эмбриональные фибробласты крысы перевиваемой линии ВАТ 2 г 1-фенотипа. В присутствии бромдезоксиуридипа клонируют ракомбинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины, содержащие в ДНК последовательности ВГА, (ЛИВП-рБРЛ 1-НА 11-П- ргоСеа), наращивают на клетках ВАТ 2 иа среде Рц 1 Ьессо з МЕМ с 5 Х сыворотки новорожденных телят. Син12 1469856 На боку кролика выбривают поверхность 5 см"и скарифицируют. На этуповерхность наносят 0,1-0,2 мл вируса. На 3-4 день возникает специфическая воспалительная реакция. К 20дню поверхность кожи очищается. Че-рез 3-4 недели после заражения отбирают сыворотку. Ее титр против осповакцины составляет 1:640, 1;1280. твэируеиый белок ВГА в виде клеточ-, ных лиэатов используют для иммунизации морских свинок и кроликов.Через несколько недель после завершения курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных связываться с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими 10антителами.Болыпинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали ан титела в достаточно высоких концент,Рациях, способные связываться с натив 15 ным вирусом.П р и м е р 10, Все операции про,делывают, как в примере 8 но вместо иммунизации кроликов клеточным лиэатом осуществляют ик вакцинацию 20 ,очищенным рекомбинантным вирусом осповакцины с титром 510 Э частиц/мл Сыворотка также содержит антителапротив ВГА. Таким образом, изобретение позволяет получать генно-инженерные продукты, которые могут быть использованы как субстанции, потенциально . пригодные для приготовления генно- инженерных вакцин, поскольку они вызывают образование у животных антител, связывающих вирус гепатита А. Составитель ТЗабоойкина Редактор Л. Павлова Техред. М.Ходанич " Корректор С. ШевкунЗаказ 3335Тираж 531 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-изцательский комбинат "Патент", г,ужгород, Ул. Гагарина,301