Способ получения лейкоцитарных интерферонов человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 15 Е ИЗОБРЕТЕ ОПИСА 78; 25620 10. 11. 80; Ко, щ) ель ЯупЬепзп ихСЬ Ььшап чангу. Наар. 316-320. АРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СС АМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ИОТНРЫТ(72) Девид Фан Нормен Геи Сидней Пестка (ПБ)(56) ЗЬре 1 аао Я. еС а 1Е. соН оЕ а ро 1 урергИе1 ейоеу 1 е ьпгегГетоп ас 1те, ч. 284 МатсЬ, 1980,(5 А) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОИИТАРНЬЕИНТЕРФЕРОНОВ ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к технологии рекомбинантных ДНК, т.е. к способам, использующимся в рекомбинантнойДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. Штамм бактерий ЕасЬегсЬа со 1 трансформируютрекомбинантами из группы рЬе 1 Р А 25,рЬе 1 Р В игр 7, рЬе 1 Р С Тгр 35,рЬе 1 Р Р игр 11, рЬе 1 Р РР игр 1,рЬе 1 Р 1 игр 1 и рЬе 1 Ригр 1, далеекультивируют трансформанты, выделяюти очищают лейкоцитарный интерферон.171. Плазмиду рЬе 1 Г И подвергаютгидролизу в присутствии Нае 11 иКБ аТ с выделением 816 в,р. фрагмента, простирающегося от сигнального5пептида аминокислоты 10 до 3 некодирующего участка,2, Фрагмент денатурируют и подвергают синтезу с фрагментом КленоваЛНК полимеразы 1 с использованиемсинтетического дезоксирибо-олигонук леотидного праймера 5 -АТСТСТААТСТСТСТ;3. Полученный в результате продуктрасщепляют с помощью БАП За и выделяют 452 в.р. фрагмента, представляющего собой аминокислоты 1-150,4. В результате расщепления Ье 1 Р Нс помощью БАБ За и РяГ.1 и вьделенияполученного в результате 500 в.р,, фрагмента получают ген, кодирующийаминокислоты от 150 до конца кодирующей последовательности.5. Фрагменты, вьделенные на стадиях (3) и (4), лигируют с образованиемфрагмента 251 166тпег суя аяр я 6 орАТС ТСТ + . САТ ТСА -- РвГ, 1БАБ Закодирующего 166 аминокислоты Ье 1 Р-Н.б, рЬе 1 Р А игр 25 расщепляют спомощью ХЬа 1, лигируют тупые концыс помощью ДНК полимеразы 1 и продуктреакции расщепляют с помощью Ря 1 1Полученный в результате большой фраг 35мент может быть выделен и лигированс продуктом со стадии (5) с образованием экспрессионной плазмиды, способной после трансформации Е.со 13.Кштамма 294 или другого бактериального хозяина экспрессировать зрелый Ье 1 Р Н.% -фазную Чарок 4 А рекомбинатнуюбиблиотеку человеческого генома подвергают скринингу на лейкоцитарныеинтерфероновые гены. РадиоактивныйЬе 1 Г-зонд, полученный из сДНК клонаЬе 1 Г А, используют для скрининга500000 колоний. Несть Ье 1 Р геномныхклонов получают в результате такогоскрининга. В результате последующегоскрининга и очистки колоний один изтаких клонов, % Н Ье 1 Р 2, выбираютдля дальнейшего анализа,С использованием указанного способа могут применяться и другие зонды с тем, чтобы успешно провести выделение дополнительных Ье 1 Р клоновиз человеческого генома. Они, в 19 18свою очередь могут использоватьсядля получения дополнительных лейкоцитарных интерфероновых протеиновсогласно изобретению.1, 2000 в.р, Есо К 1 фрагментклона Ъ Н Ье 1 Г 2 клонируют в рВЕ 325.на сайте нахождения Есо Н Т, Полученную в результате плазмиду Ье 1 Г 1расщепляют с помощью Есо Н 1 и выделяют 2000 в,р. фрагмента. Деоксиолигонуклеотидный о ААТТСТССАС (конвертор Есо К 1 - Ря 1: 1) лигируют до2000 в.р. Есо В. 1 фрагмента и полученный в результате продукт расщепляют гпомощью Ряг 1 с образованием 2000 в.рфрагмента, содержащего Ряй 1-концы.Этот продукт расщепляют с помощьюБАП 96 и 1100 в.р. фрагмент вьделяют.2. Плазмиду рЬе 1 Г С игр 35 расщеп.ляют с помощью Ряг 1 и ХЬ а 1. Вьде"пяют крупный фрагмент о3. Небольшой ХЬ а 1 - Ряс 1 фрагмент из рЬеТР С игр 35 расщепляют спомощью ХЪ аТ и БАБ 96. Выделяют.40 в,р, ХЬ а 1 - БАП 96 фрагмента.4. Фрагменты, вьделенные на стадиях (1), (2) и (3), лигируют с образованием экспрессионной плазмидырЬе 1 Р 1 сгр 1. Ье 1 Р Л.1, Плазмида рЬеТР Ю содержит 3,8Ндпй 111 фрагмента человеческой геномной ДНК, которая включает Ье 1 Р Лгенную последовательность, и выделяют 700 в.р. Эйе 1 - ЕБа 1 фрагмент,2, Плазмиду рЬе 1 Г В игр 7 расщепляют с помощью НЫЛ 111 и Псле 1 ивыделяют 350,в.р. Ндпй 111-Рйе 1фрагмент.3., Плазмиду рВ К 322 расщепляют спомощью Ряг Т, затупляют концы врезультате инкубирования в присутствии ДНК полимеразы 1 (кленовскийфрагмент), затем расщепляют с помощь-НЫЛ 111 и выделяют крупный(ъ 3600 в,р.) фрагмент,Фрагменты, вьделенные на стадиях (1) (2) и (3), лигируют с образованием .экспрессионной плазмидырЬе 1 Р Л игр 1.,Очистка интерферона,1. Замороженные клеточные гранулысодержащие экспрессированный лейкоцитарный интерферон, раздробляют вручную или с использованием соответствующего оборудования для уменьшенияразмера частиц, Частично оттаявшиеклетки суспендируют в 4 об .буфера А,содержащего 0,1 И трис (рН 7,5-8,0),ВНННЛИ Заказ, 3796/58 . Тираж 520 Подписное Произв.-полигр, пр-тие г, Ужгород, ул. Проектная, 4 10% (вес/об) сахарозы, 0,2 И ИаС 1, 5 мИ ЕДТЛ, 0,1 мИ РИБГ и 10-100 мИ ИяС 1, Такую суспекзию выдерживают при температуре приблизительно 4 С,Полученную суспекзию пропускают через гомогекизатор, работающий по,.давлением 6000 Фунт/дюйм, после чего снова пропускают через указакное устройство, но при давлении :0 1000 фунт/дюйм . Эффлюент из гомогенизатора от двух проходов охлаждают в бане со льдом.2. Иедленно добавляют полиэтиленимин к гомогенной среде до концент рации около 0,35% и полученной системе дают выстаиваться в течение 30 мин, Твердые вещества удаляют центрифугированием или фильтрацией, Температуру на этой стадии контролируют или проводят ее достаточно быстро, в результате чего верхний слой (фильтрат) поддерживается при температуре менее 10 С. Верхний слой (фильтрат) концентрируют ультрафильтрацией при близительно до 1/10 начального объема. Иелкие частицы или туманность в удержанной фазе можно удалить на соответствующем фильтре, например на микропористой мембране. ЗО3. Осветлгнный раствор загружают непосредственно в колонку с моноклональным антителом со скоростью подачи 5-8 см/ч (например, 25-40 мл/ч в колонку с диаметром 2,6 см). После загрузки колонку промывают приблизительно 10 об 25 мИ трис-НС 1 рН7,5-8 р 5, включающего ИаС 1 (0,5 И) и такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х(0,2%) или его эквивалент. После промывки колонку споласкивают приблизительно 10 об раствора, содержащего 0,15 И ИаС 1 и йоверхностно-активное вещество, такое как Тритон Х(0,1%) или его эквивалент. Колонку элюируют0,2 И раствором уксусной кислоты, содержащим такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х(0,1%)или его эквивалент. Фракцию, дающую протеиновый пик из колонки с моноклональкым антителом (согласно УФ- спектроскопическому или другому ана 19 20лизу),. объединяют к рН системы устанавливают рав,"ым гркблизителько4,5 с помощью 0,1 1 раствора НаОНили 1,0,1 трис-основаниями4, Объединенный иктерфероковыйпик загружают ка катиокообменккк,такой как Ватман СИ 52 целлюлоза илиего з",ви -алеь т, который уравновешивают подхоцчщ:,и буфером ,таким какацетат аммония, рН 4,5 (50 мИ). После загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером до того момента,пока УФ-спектр дает ровный прямойпри анализе элюекта, в результате чего небольшое количество эффлюентазлюируется с колонки. Затем колонкуэлюируют 25 мИ ацетата аммония иО, 12 И хлористого натрия или их комбинацией, которая оптимизирует регенерацию интерферона и приводит к образованию лиофилизироваккого осадкана фильтре,Формула изобретения Способ получения лейкоцитарных ин"терферонов человека с частичной последовательностью Суз-А 1 а-игр-С 1 ц-Ча 1-Ча 1-Агр-А 1 а-С 1 п1 е-Иег-Аг 8--Бег-, предусматривающей трансформацию бактерий Е.со 11 штамм 294АТСС 31446 плазмидами, выбранными изгруппы р 1 е 1 Р А 25, р 1,е 1 Р В игр 7,р 1.е 1 Р С Ггр 35, р 1,еТР П Ггр 11,рЕеТГ Р ггр Т, р 1,е 1 Р Т игр 1, рЬе 1 РЛ ггр 1, культивирование полученныхтрансформаторов с последующим экстрагированием и очисткой полученных полипептидов,Приоритет по признакам:01.07.80 при частичной последовательности Суз-А 1 а-игр-С 1 ц-Ча 1-1 а 1-Агр-А 1 а-С 1 ц-Пе-Иег-Аге-Бег-.,р 1.еТР А 25, рЕеТРВ ггр 7, ЕзсЬег 1 сЬа со 11 АТСС 31446:08.09.,80. при рЕеТР С гр 35,р 1.е 1 Р 0 .гр 11, рЕе 1 Р Р ггр 1.10,11.80 при РЕе 1 Р 1 ггр Т,р 1,еТР 3гр 1,21.04,81 при зкстрагировакии иочистке полученных полипептидов.Изобретение относится к областитехнологии рекомбинактных ДНК, т,ек способам, использующимся в рекомбинактнсй ДНК- технологии, и к процук 1там полученным этими способами.П р и м е р Используют два микроорганизма: Гсо 1. х 177 б и Г,со 1.Кштамм 296 (конец А,сЬ 1 , ЬзгЪзщ ) 10мРНК лейкопитарного интерфероначеловека (ЕеТГ) получают из лейкопитсл человека, взятых у. больных хронической миелогенкой лейкемией. Таковь.Ми являются линия клеток Обозначенная К 0-1, полученных от пациентовс .острой миелогенной лейкемией,У КСклеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона МРНКс помощью вирусов Сендай или Ньюкастла, Клетки собирают 5 ч спустя после индуцирования и РНК приготовляютпс методике с применением гуанидинтиоцианат-гуакидингидрохлорида,Для получения 12 Б фракций поли (А)мРНК используют олигодеокситимидинс Т.-целлюлозную хроматографию и сахарсзное градиентное ультрацектрифу ггоование.5 мкг МРНК используют для полу- ЗОчения,двойной цепочки кДНК по цепочечной методике., Указанные кДНК фракцйо.иръют по размерам с помощью электрофореза на 6%-ном полиакриламидном геле и 230 кг материала с размерами в интервале от 500 до 1500 в,п,выделяют электроэлюированием. 100 кгэтсй кДНК присоединяют к деоксицитидиновым остаткам (йс) и реденатурируют с ч 70 нг плазмид рН К 322, кото- ,10рые были соединень 1 с десксигуанозиновыми (сС) остатками по (Рзг. 1) сайтуи используют для трансформации Е.со 11.х 1776. Получают устойчивые к тетрациклину, чувствительные к ампициллину,15траксформанты. Синтезируют четыренабора дезоксиолигонуклеотидных зондов для каждой последовательности,содержащие три (Т-ТА, В, С, Г) илиодин (ТА, В, С Г) олигонуклеотид50каждая.мРНК получают из 12 Б РНК, КС нндуцироваккых вирусом Сендай либоцеликом поли (А) МРНК из неиндуци 2рованных леикоцитов. Р-меченные5кДК готовят известным способом. Немечекный продукт выделяют с помощьюгельфильтрации на к(болонке, заполнен"ной 10 мл Сефадекс С, обработан" ной 0,31 аОН в течение 30 мин приб70 С для разрушения РНК, нейтрализуют НС 1 и осуществляют гибридизацию,Для идентификации клонов РЬ 1 - р 1 30используют быстрый процесс изолирования нлазмиды по Бирнбойму,При этом получают 1 мкг плазмидыДНК из каждых 500 индивидуальныхтрансформантов Есо 11. Кштамма294, Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на китроцеллюлознь.ефильтры в трех экземплярах, следуяметодике Кафатоса с сотр, см. выГше).Три группы нитооцеллюлсзныхфильтров, содержащих 500 образцовплазмид, гибридизируют со стимулированной кДП, заложенной с Т группой носителей информации (праймеров); Т, заложенной стимулированной кДНК, нестимулированной кДНКприготовленной с использов;киемобеих групп носителей информации.Клоны считают положительными, если оки гибридизируют сильнее одикили оба зонда стимулированной кД 1 К,чем полностью нестимулированный зонд.Было отобрано 30 положительных клонов (рЬ 1-рЕ 30) из 500 для дальнейшего анализа,Трансформанты Е,со 11. х 1776 скринируют по методике гибридизации колоний, используя в качестве зонда371-меченную стимулированную МРНК,Немеченную МРНК из кестимулированныхклеток смешивают с зондом при соотношении 200:1 для конкуренции с нестимулированной мРНК, имеющейся взР-меченком препарате. Гибридизациямеченой МРНК будет происходить предпочтительно в колониях, содержащихстимулированные последовательности.Получают три класса трансформактов:.з2-3% колоний, гибридизованных Р"мРНК очень сильно;. 10% гибридизовак.ных значительно меньше, чем 1-й класс;остальное, не дающее определимыйсигнал гибридизации.,Исследуют поло;.;ительные колонии(классы 1 и 2) на наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который зависит от гибридизации интерфероновоймРНК кснкретно в плазмиду ДНК, Первоначально выращивают индивидуально60 сильно положительньх колоний(класс 1) в 100 мл среды 119, дополненной тетрацикли сом (200 мкг/мл), диаминопимелнновой кислотой(100 мкг/мл), тимидином (20 мкг/мл),и Й-биотином (1 мкг/мл),Среда И 9 содержит 6 г/л Ма 2 НР 04,3 г/л КН 2 Р 04 0,5 г ИаС 1 и 1 г/л МН С 1.После автоклавирования прибавляют1 мл стерильного 1 И МяБ 04 и 10 млстерильного 0,01 М СаСЗ . Собирают10 культур и изолируют плазмиду ДНКиз шести пулов, как описано Клевелломс сотр, В 1 осЬеппзгу 9, 4428-440(1970), 10 мкг каждого пула плазмидыДНК расщепляют Нпй 111 денатурируюти ковалентно связывают с ДБМ (диазобензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридизуют 1 мкг очищенной мРНК из стимулированных кле.ток. Негибридизованную мРНК удаляютпромывкой. Специфически гибридизованную мРНК элюируют и транслируют в социты личинок Хепорцз. По этой пробевсе б пулов были отрицательными.5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пулиз 9 колоний делают из 59 слабо положительных колоний (класс 2). Готовятплазмиды из пулов и исследуют, какописано вьппе. Среды б тестированныхпулов был тестирован один (к 10), гибридизованныйв интерферонную мРНКпри условии значительно выше исходных уровней каждого времени. Для того, чтобы определить специфическийинтерферонный кДНК-клон готовят плазмиды ДНК из 9 колоний пула К 10 и исследуют индивидуально. Две из девятиплазмид (%101 и Р 104) связывают ин,терферонную мРНК существенно лучше,чем при указанных исходных уровнях,Из плазмиды й 104 выделяют одинВе 1 11 рестрикционный фрагмент, со 32держащий 260 в.р., меченный Р сиспользованием процедуры, описаннойТейлором с сотри используют в качестве зонда для независимого скрининга 400 Е.со 1 д 294 трансформантов спомощью процедуры скрининга колонийДП З 2 Ц,Идентифицируют 9 колоний (р 1. 31"рЬ 39), которые гибридизуют до различной степени с этим зондом.Кроме того, используют меченный260 в.р. фрагмент для независимогоскрининга 4000 Е.со 1 294 трансформантов таким же образом. Индентифицируют 50 колоний, которые гибридизуют до различной степени с этим зондом. Одна содержит Ье 1 Р 0"фрагмент,одна - Ье 1 Г Н-фрагмент и одна - фрагмент, обозначенньп Ье 1 Г Н 1, оченьпохожий на Ье 1 Г Н. Полученные гибридные плазмиды обозначают рЬЕ 1 Р Н ит.п.Готовят плазмиду ДНК из всех 39потенциальных Ье 1 Г кДНК клонов и проводят повторный скрининг с тем же260 в.р, ДНК зондом, используя процедуру гибридизации Кафатоса с сотр.(см. вьппе). Три плазмиды (рЬ 4, р 1, 31,рЬ 34) дают очень сильные признаки(рЬ 13, рЬ 30, рЬ 32, рЬ 36) гибри дизованы умеренно и три (рЬ 6, рЬ 8,фЬ 14) слабо гибридизованы зондом.Также скринируют 39 потенциальных Ье 1 Р кДНК рекомбинантных плазмидзг.с использованием Р-меченных синте тических ундекамеров (индивидуальныеТпервичные пулы праймеров информации или индивидуальные Тпраймерыинформации) непосредственно в качестве гибридизующих зондов. Условия 2 Б гибридизации выбирают таким образом,что для определимых сигналов гибридизации должны требоваться точно спаренные основания. Следовательно,плазмида ДНК из 3 клонов была приго" 30 товлена по стандартной процедуреочищения лизата (Клевелл с сотр.,см. вьпне) и очищена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А,Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейными обработкой Есо81, денатурируют в щелочи и наносятна 2 отдельных нитроцеллюлозных фильтра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос ссотр см. выше). Фосфорилируют инди видуальные синтетические деоксиолигонуклеотидные праймеры информации ипулы праймеров информации с помощью( 22 р) АТР, (2500 Кю/ммоль) объепиняют в 30 мкл 50 мИ трис-НС 1, 10 мМИрС 12, 15 мИ /3-меркаптоэтанола, Добавляют 2 ед, Т 4 полинуклеотидкиназыс О 72и после 30 мин при 37 С, Р-меченные 5 О праймеры информации очищают хроматогЬафией в колонках с 10 мл Сефадекс6-50, Гибридизации осуществляют сиспользованием 10 срм пула праймебров ТС или 3 10 срм пула прайме ра ТС при 15 С в течение 14 ч вбх ЯБС (1 хЯЯС = 0,15 И ИаС 1, 0,015 Млимоннокислого натрия, рН 7,2, 10 храствор Денхардта (0,27. бычьего сывороточного альбумина, 0,22 поливи 5 4нилпиролидона, 0,2 Ж фиколла). Фильтры промывают 5 мин (3 раза) при 0 Сбх ББС, сушат и облучают на рентгеновской пленке.При этом плазмида ДНК из клона104 дает значительную гибридизациюс пулом праймеров информации ТС ипраймеров информации ТС, но не да, ет определимой гибридизации с други, ми ундекамерами. Несколько из 39 по, тенциальных ЬеЕГ плазмид (рЬ 2,4,13,17,20,30,31,34) также гибридизуют собоими этими зондами. Рэ Е-усвоениерЬ 31 показывает размер кДНК-вставки,который должен составлять примерно1000 в.р,Найдено,.что первый АТС-трансли, рующий начальный кодон состоит из, тельности и затем 188 кодонов.послеТСА концевого триплета, имеется 3423нетранслируемых нуклеотидов у 3 кон, ца, следующих на поли-(А)-последовательностью Путативный сигнальныйпептид (по-видимому, включенный всекрецию готового ЬеЕГ. из лейкоцитов)имеет длину из 23 аминокислот. 165; аминокислот, составляющих готовыйЬеЕР, имеют рассчитанный молекулярный вес 19390, ЬеЕГ, закодированный, ,рЬ 31 обозначают ЬеЕР А, БАБ ЗА рес, трикционный эндонуклеазный участокрасположен между кодонами 1 и ЗАРА.Два синтетических деоксиолигонуклеотида включают АТС-транслирующий начальный кодон, реконструируют кодонаминокислоты 1 (цистеин) и создаютЕсо ГЕ липкий конец. Эти олигомерыбыли связаны в 34 в.р. БАБ За-А аЕЕфрагмент р 1, 31, Полученный в результате 45 в.р, продукт лигируют в двадополнительных фрагмента ДНК для конструирования 86,5 в.р. синтетического(натурального гибридного гена, Который кодирует ЬЕР А и который связывается Есо ЕЕ и Рз Е .(рестрикционными участками). Такой ген включают врВ В 322 между Есо КЕ и Рэ Е участками для получения плазмиды РНЕР АЕКонструкция триптофанового контрольного элемента, содержашегоЕ.со 1 игр промотор, оператор и игрлидер рибосомсвязывающего участка,но не содержащего АТС-последовательности для инициирования трансляции,Плаэмида рСМЕ несет триптофачовыйоперон Е.со 1 я, содержащий делециюЬЬ Е 1413, и экспрессирует протеин,14319включающий первые б аминокислотрлидера и приблизительно последнийтретий гр Е полипептид (позже упоминаемый в сочетании как ЬЕ ), атакже гр 0 полипептид в его целости, все под контролем системы "грпромотор-оператор, Плазмиду (20 мкг)обрабатывают рестрикционным ферментом РЧЦ 11, который расщепляет плазмкду на пять участков. Генные фрагменты затем комбинируют с линкерамиЕсо ЕЕ, состоящими из самокомплиментарного олигонуклеотида с последова 1 б тельностью рСАТСААТТСАТС, обеспечивая Есо К Е-участок расщепления дляпоследующего клонирования в плазмиду,содержащую Есо К Е-участок. Обрабать; -вают 20 мкг ДНК-фрагментов, полученных из рСИЕ, 10 ед. Т 4 ДНК-лигазы вприсутствии 200 пкмоль 5 -фосфорилированного синтетического олигонуклеотида рСАТСААТТСАТС и в 20 мклТ 4 ДНК-лигазного буфера (20 мИ трис, 25 рН 7,6, 0,5 мМ АТФ, 10 мИ МрС 1 , 5 мИдитиотрейтола)при 4 С в течение ночи.Затем раствор нагревают 10 мин при70 С до прекращения лигации. Связкиотщепляют перевариванием Есо К Е и 30 фрагменты, теперь с концами Есо К Е,отделяют, используя электрофорез на5 Е-ном полиакриламидном геле (ПАГЭ),и при наиболее широких фрагментах,выделенных из геля первым пятном с 3 б этидиумбромидом, локализуя Фрагменты ультрафиолетовым светом, и вырезают из геля интересующие участки,Помещают каждый гелевый Фрагментс 300 мкл 0,1 х ТБЕ в диализаторныйбачок и подвергают электрофорезу при100 В в течение часа в 0,1 хТБЕ-буфере(ТБЕ-буфер содержит: 10,8 г трис-основания, 5,5 г борной кислоты,0,09 г Ма - ЭДАТУК в 1 л воды), Вод.4 Б ный раствор собирают из диализатор.ного бачка, экстрагируют фенолом,экстрагируют хлороформом, делают0,2 М раствор хлористого натрия иизвлекают ДНК в воце после осаждения этанолом, содержащий ген игрпромотор-оператор с липкими концамиЕсо ЕЕ идентифицируют по указаннойниже процедуре, которая вызь,ваетвставление Фрагментов в чувствительную к тетрациклину плазмиду, которая ЗВпри вставлении промотор-операторастановится устойчивой к тетрациклину.Плазмида рВРНЕ экспрессирует ампициллиновую устойчивость и содермощью ПАГЭ н нзолнру,от после электроэлюирования, Этот ДНК-фрагмент изрН Б 32 (0,2 мкг;) связывают в условиях, подобных указанным выше, с ЕсоК 1-Тар 1-фрагментом триптофанавого оперона ( 0,01 мкг), происходящего из рВ КН игр, В ; пособе легирования фраг.ента из рП Б 32 к фрагменту Есо К 1 - Тая 1, как опксано выше, выст упающий вперед Тао 1 конец связан с выступающим вперед концом Х Ьа 1, хотя он не совершенно спарен основанию Уатсона-Крика-АСС ТСТ -АССТСТ - Часть этой лигационной реакционной смеси трансформируют в клетки Е.со 1 д 294, проводят термообработку и поме щают на пластины ЬВ, содержащие ампициллин, Отбирают 24 колонии, выращивают в 3 мл ЬВ (Луриа-Вертани) среды и изолируют плазмиду, Найдено, что 6 из них имеют ХЬа 1-участок,регенерированный с помощью Е.со 11, катализированной ДНК повторным спариванием и репликациейТСТАСА -- ТСТАСА -АССТСТ - АСАТСТНайдено, что эти плазмиды расщепляются как Есо К 1, так и Нра 1 и дают ожидаемые рестрикционные фрагменты, Одну плазмиду, обозначенную рТгр 14 , используют для экспрессии гетерологических полипептидов,Плазиида рНСН 107 содержит ген человеческогс гормона роста (ЧГР), составленный из 23 аминокислотных кодонов, полученных из синтетических ДНК-фрагментов, и 163 аминокислотных кодонов, полученных из комплементарной ДНК, полученной с помощью обратной транскрипции информационной РНК ЧГР. Этот .ген, хотя в нем отсутствуют кодоны рге последовательности ЧГР, содержит АТС-транслирующий начальный кодаи. Этот ген изолируют из 10 мкг рНСН 107 после обработки Есо К 1 с последующей обработкой Е,со 1 ДНК полимеразой Кленоза фрагмента и Й ТТР и Й АТР. как указано вышее. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом плазмиду обрабатывают Ваш Н 1.Фрагмент, содержащий ген ЧГР, изолируют с помощью ПАГЭ с последующим электроэлюированием, Полученный в результате ДНК-фрагмент также содержит 14 4319жит ген устойчивости к тетрациклину,Следовательно, плазмида чувствительна к тетрациклину. Плазмиду делаютустойчивой к тетрациклину путем введения системы промотор-оператор вучасток ЕсоК 1,рВВН 1 расщепляют ЕсоК 1 и удаляютфермент экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом и собирают в воде после осаждения этанолои. Полученную в результате молекулу ДНК в отдельных реакционных смесяхобъединяют с каждым из трех фрагментов ДНК, полученных вышее, и лигируют 1 Бс ТДНК-лигазой, как описано выше,Используют ДНК, находящуюся в реакционной смеси, Для трансформации Е.со 1 т.Кштамма 294 по стандартной методике и бактерии помещают на ЬВ 20(Ьига-Веггапг)-пластины, содержащие20 мкг/л ампициллина и 5 мкг/л тетрациклина. Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, изолируютплазмиду ДНК и доказывают наличие же Бдаемого фрагмента с помощью рестрикционного ферментного анализа. Полученную плазмиду обозначают рВ КН ггр.Продукт расщепления с помощьюЕсо К 1 и Вам Н 1 вирусного генома ЗОгепатита В получают традиционным способом и клонируют в Есо К 1 и ВашН 1 участки плазмиды р С Н 6 для образования плазмиды рН Б 32. Затемрасщепляют плазмиду рН 8 32 с помощью ЗХ Ьа 1, экстрагируют фенолом, хлороформом, осажцают этанолом и обрабатывают 1 мкл Е.со 11 ДНК полимеразой1 К 1 епоч фрагмент (Боерингер-Ман"нхейм) в 30 мкл полимеразного буфера(50 мИ фосфата калия рН 7,4 мМ МяС 11 мМ -меркаптоэтанола), содержащего0,1 мИ Й ТТР и 0,1 мМ, Й СТР, в течение 30 мин при 0 С, затем 2 ч при37 С. Такая обработка приводит к заполнению 2 из 4 нуклеотидов, комплементарных к выступающему вперед 5концу Х Ьа 1 участка расщепления,5 СТАСА 5 .СТАСА3 Т 3 ТСТ БОДва нуклеотида, ЙС и ЙТ, были включены и дали конец с двумя выступающими вперед 5 нуклеотидами. Такойлинейный остаток плазмиды рН Б 32(после экстракции фенолом и хлороформом и сбора в воде после осажденияэтанолом) расщепляют Есо К 1, отделяют широкий плазмидный фрагмент отменьшего Есо Р 1-КЬа 1-фрагмента с по 9 443первые 350 куклеотидов устойчивогок тетрациклину структурального гена,но в нем отсутствует тетрациклиноваясистема промотор-оператор, так чтопри последовательном клонировании в5экспрессионную плазмиду плазмиды,содержащие вставку, могут быть обнаружены по восстановлению устойчивостик тетрациклину. Так как Есо В 1 конецО,Фрагмента был заполнен в процедуреполимеразой 1 Кленова, фрагментимеет один тупой и один лигкий конец, обеспечивающий четкую ориентацию при последующем включении в экспрессивную плазмиду.Затем готовят экспрессивную плазмиду рТгр 14 для получейия Фрагмента,,ченные липкие концы заполняют.по процедуре полимеразой 1 Кленова, применяя д АТР, о ТТР, ЙС ТР и й СТР. После экстракции фенолом и хлороформоми осаждения этанолом полученную в 25результате ДНК обрабатывают Вата Н 1,широкий плазмидный фрагмент с помо, щью ПАГЭ и электроэлюирования, Фрагмент, происходящий из рТгр 14, имеет; один тупой и один липкий конец, позволяющий рекомбинацию с четкой ориентацией с Фрагментом, содержащим ЧГРген, описанный ранее,Фрагмент гена ЧГР и Фрагмент рТгр14 ЬХЬа-Вап Н 1 объединяют и лигируютв условиях, подобных опис.анным выше.Заполненные ХЬа 1 и Есо В. 1 концы,связанные вместе связкой по тупомуконцу для воссоздания участков ХЬа 1и Есо В. 1: заполненный ХЬа 1 заполненный Есо В 1 инициирование геном ЧГР-АСАТС ТТААСАТАС -АСАТСТТААСАТАСХЬа 1 Есо В. 1Такая конструкция также воссоздает ген устойчивости к тетрациклину,Так как плазмида рНСЦ 107 экспрессирует устойчивость к тетрациклину изпромотора, расположенного вьппе гекаЧГР (1 ас-промотор), эту конструкциюобозначают рНСН 207,она позволяет осуществить экспрессию гена устойчивостик тетрациклину под контролем триптофа-.нового промотора-оператора. Лигационную смесьтрансформируют в Е.со 11 294 иотбирают колонии на ЬВ-пластинах, содержащих 5 мкг/л тетрациклина. 19Плазмиду рН СН 207 расщепляют Есо В 1 с помощью ПАГЭ и электроэгпоирования и выделяют Фрагмент, содержащий Ггр промотор, оператор и Ггр ведущий рибосомный связующий участок,но в котором отсутствует АТС-оследовательность для инициирования трансляции. Этот Фрагмент ДНК клонируют и Есо В 1 участок рЬе 1 Г А. Экспрессионные плазмиды, содержащие модифицированный выше сгр регулон (Е,со 1 г Ггр оперон, из которого была изъята истощенная последовательность для контролируемого повьппения уровней экспрессии), вырашивают до заранее определенных уровней в питательной среде, содержащей добавку тринтофан в количестве, достаточном для по давления (репрессии) системы промотор-оператор, затем изымают триптоФан, чтобы дерепрессировать систему и вызвать экспрессию целевого продукта. Для этого 250 мкг плазмиды рЬ 31 расщепляют рзг 1 и изолируют 1000 в.р. вставку гель-электрофорезом на 62-ном полиакриламидном геле,Из геля элюируют примерно 40 мкг вставки и разделяют на три аликвота для дальнейшего расщепления образца 16 мкг этого фрагмента частично расщепляют 40 ед. В 81 11 в течениео45 мин при 37 С и очищают реакционную смесь на 63-ном полиакриламидном геле. Собирают приблизительно 2 мкг целевого 670 в.р. Фрагмента.Другой образец (8 мкг) из 1000 в.р. рзг 1 вставки рестриктируют А ч а 11 и В 1 11, Собирают 1 мкг указанного 150 в,р, фрагмента после гель-электрофореза.Обрабатывают 16 мкг 1000 в.р.часть БАБ За и Аа 11, После электрофореза на 10 -,ном полиакриламидном геле собирают приблизительно 0,25 и.,- (10 пкмоль) 34 в.р. фрагмента.Синтезируют два указанных дезокси(олигонуклеотида 5 - д ААТТСАТСТСТ (Фрагмент 1) и 5 - д-САТСАСАСАТС (Фрагмент 2) по Фосфоротриэфирной процедуре.Фрагмент 2 Фосфорилируют следующим образом.Высушивают 200 мкл (" 40 пкмоль) (р) - АТР (СтйегзЬаш 5000 Кю/ммоль) и повторно суспендируют в 30 мкл 60;тН трис-НС 1 (рН 8), 10 мМ МВС 1 15 М 5-меркаптоэтанола, содержащего 100 пкмоль ЛНК Фрагмента и 2 ед.) Т 4 полннуклеотидной киназы. Послео15 мин при 37 С прибавляют 1 мкл 10 мИ АТР и реакция продолжается еще 15 мин, Затем смесь нагревают прио70 С в течение 15 мин объединяют сЭ100 пкмоль 5 -ОН фрагмента 1 и 10 пкмоль 34 в.р, БААЗ За-А ч аТ 1 фрагмента. Связывание осуществляютов течение 5 ч при 4 С в 50 мкл 20 мИ трис-НСТ (рН 7,5), 10 мИ ИОСТ . 10 мИ дитиотрейтола, 0,5 мИ АТР и 10 ед, Т 4 ДНК лигазы. Смесь подвергают электрофорезу на 67-ном полиакриламидном геле и электроэлюированием собирают 45 в.р. продукт. Объединяют 30 нг (1 пкмоль) 45 в.р. продукта с 0,5 мкг (5 пкмоль) 150 в.р. А ч а 11-Вр 1 2"го фрагмента и 1 мкг (2 пкмоль) 670 в.р. Вя 1 11-Рвг 1-го фрагмента. Лигироваоние осуществляют при 20 С в течение 16 ч, используя 20 ед, Т 4 ДНК лигазы, Лигазу инактивируют, нагревая при 65 С в течение 10 мин, Затем смесь усваивают Есо К 1 и Рвг 1 для удаления полимеров из гена. Смесь очищают . на 67.-ном ПАГЭ. Изолируют около 20 нг, (0,04 пкмоль) 865 в.р. продукта. Половину этого продукта (1 О нг) лигируют в рВК 322 (0,3 мкг) между сайтами Есо К 1 и Рвй Т. Трансформация Е.со 1 294 дала 70 устойчивых к тетрациклину, чувствительных к ампициллину. трансформантов, Плазмиду ДНК, изолированную из 18 из этих трансформантов, расщепляют Есо К Т и Рв 1.16 из 18 плазиид имеют Есо К 1"РвС 1 фрагмент 865 в.р. в длину. Расщепляют 1 мкг одной из них, рЬе 1 Р А 1, Есо К 1 и лигируют в 300 в.р, Есо К 1 фрагмент (0,1 мкг), содержащий Е,соТх Ггр промотор и ведущий рибосомный связывающий сайт, приготовленный, как описано вьппе. Идентифицируют трансформанты, содержащие игр проиотор, используя Р-ггр зонд в сочетании с процедурой скрининга колоний Грюнштейна-Хогнесса. Асимметрично расположенный ХЬаТ сайт в .сгр фрагменте позволяет определить рекомбинанты, в которых игр-промотор ориентирован в направлении Ье 1 Р А гена.Определение активности Ье 1 Р А.Экстракты готовят для 1 Р анализа следующим образом.мл культуры выращивают в М -бульоне, содержащем 5 мг/мл тетрациклина до значения А зо около 1,0, Затеи разбавляют 25 мл среды И 9, содержа 4319 12 зают с помощью рвГ 1, выделенноймэлектрофорезом, и метят изотопом Р,Полученную в результате радиактивномеченную ДНК используют в качествезонда для скрининга дополнительныхЕ.со 1 294 трансформантов, полученных по способу, идентичному описанному в части С по методике п вгискрининга колонии, предложенной Грунштейном и Хогнессом (см. вьппе). Колонии, которые в различных количест 4 б вах гибридизировали с зондом, выделяют Плазмиду ДНК из таких колоний идесять гибридизированных колоний,на которые ссылаются вьппе, с помощьюРвг 1 и характеризуют тремя различныии способами. Во-первых, образцы рестракционного эндонуклеазного расщепления с знзимаии Вя 1 1 Т, РП 11и Есо К 1. Такой анализ позволяетклассифицировать по крайней мере во семь различных типов (Ье 1 Р А, Ье 1 Р В,ЬеТР С, 1.еТР П, 1.е 1 Р Е, Ье 1 Р Р,Ье 1 Р С, Ье 1 Р Б), что соответствуетприблизительно положению различныхрестрикционных разрезов относительно 5 10 18 20 2 Б 30 щей 5 мкг/мл тетрациклина. 10 мл образцы собирают центрифугированием,когда Аз достигнет значения 1,0 нгранулированные клетки суспендируютв 1 мл 15 раствора сахарозы, 50 мИтрис-НС 1 (рН 8,0), 50 мИ ЕДТА, Добавляют 1 мг лизозима и через 5 мин инокубации при О С клетки разрушают воздействием ультразвука. Образцы центрифугнруют в течение 10 мин(15000 об/мин) и активность интерферона в верхнем слое определяют сравнением со стандартами ЬеТР с помощьюцитопатического эффекта (СРЕ) ингибирования. Для определения числа ТГмолекул на клетку используют Ье 1 Рудельную активность порядка 4 1 О ед/ягКлон рЬе 1 Р А игр 25, в которомСгр промотор вставляют в желаемойориентации дает высокие уровни ак 8тивности (до 2,5 10 ед/л), Полученный с помощью Е.со 11 Кштамма294/рЬе 1 Г А ггр 25 ведет себя подобноаутентичному человеческому Ье 1 Г, онустойчив к обработке при рН 2 и нейтрализуется античеловеческими лейкоцитарными антителами кроликов. Такойинтерферон имеет кажущийся молекулярный вес приблизительно 20000,Выделение с ДНК дополнительных лейкоцитарных интерферонов, ДНК изЬе 1 Р с ДНК"содержащей плазмиды выре 13 14143известной в настоящее время предварительной последовательности и кодирую-,щей последовательности,Во-вторых, некоторые из ДНК испы 5тывают на гибридизационный выбор дляустановления способности селективноудалять Ье 1 Р и КНК из поли-А, содержащей КСклеточной РНК. Согласноэтому анализу Ье 1 Р А, В, С и Рдают положительные результаты, В-третьих, последние фрагменты внедряютв экспрессионную плазмиду Е.со 1 294трансформируют с плазмидой и Фрагменты экспрессируют. Продукты такогоэкспрессирования представляют собойпре-интерфероны, дают положительныерезультаты при СРЕ анализе на активность интерферона, хотя и обладаютмаргинальной активностью в случае201.е 1 Р Р-фрагмента.В последовательности изолированного Фрагмента, содержащего ген зрелого Ье 1 Р В, первые четырнадцать нуклеотидов гипов А и В были идентичны. 25В соответствии с этим Фрагмент изрЬе 1 Р А 25, несущий дахр промотор-оператор, место присоединения рибосомыи начало Ье 1 Р А(=В) гена, вьделяюти соединяют с остающейся частью Впоследовательности в экспрессионнойплазмиде.Для получения приблизительно950 в.р. БА 11 За к Рзх фрагменту необходимо несколько стадий ввиду наличия одного или более чередующихсяБАБ За рестракционных сайтов1, Вьделены следующие Фрагменты:а)110 в.р. от БА 11 За до Рсо К 1,в)132 в.р, от Есо К 1 до ХЪа, щс)700 в.р. от ХЪа до Рзг2. Фрагменты (1 а и 1 в) лигируют иразрезают с помощью ХЬа и Вя 1 11с тем, чтобы предотвратить самополимеризацию через БА 11 За и ХЬаконцевые терминалы (соответствующий БА 11 За сайт находится внутрисайта Вя 1 11, Вя 1 11 разрезают с тем,чтобы оставить БА 11 За - липкий конец), Выделяют 242 в.р. Фрагмента. 3, Продукт со стадий (2) и (1 с) лигируют и разрезают с помощью Рзх 1 и Вя 1 11 для того, чтобы предотвратить самополимеризацию. Вьщеляют при- В,. близнтельно 950 в.р, Фрагмента от БАБ За до Рзх. Такой фрагмент содержит часть Ье 1 Р В гена, не характерную для 1.е 1 Р А,19 144. Приблизительно 300 в,р. Фрагмента от Нпй 111 до БАБ За, содержащего дахр промотор-оператор, сайтприсоединения рибосомы, АТС начальный сигнал и цистеиновый кодон Ье 1 Р А,выделяют из рЬе 1 Р А 25,5. Приблизительно 3600 в.р, фрагмента Рз 1 1 - Нпд 111 вьделяют изрВ К 322, Такой Фрагмент содержитренликон и кодированный тетрациклин,но не обладает устойчивостью к ампициллину,6, Фрагменты, полученные на стадиях 3,4,5 лигируют и полученную в результате плазмиду трансформируют вЕ,со 11 Кштамм 294.Трансформанты подвергают минискринйнгу и образцы плазмиды расщепляютс помощью Есо К 1. Продукты такой реакции представляют три Фрагмента соследующими характеристиками: Есо К 1 Есо К 1 хр промоторный Фрагмент,внутренний Есо К 1 - Есо К 1 - Есо КЧФрагмент рЬ 4 и протеин-трансляционныйначальный сигнал - Есо К 1 фрагментрЬ 4.Согласно СРЕ анализу бактериапьныеэкстракты из клонов, полученных указанным спо;обом, обычно имеют примерно 10 10 ед. интерфероновой активности на литр при А= 1, Одиниз таких клонов, полученных указанным способом, представляет собойЕ.со 1 х 294/рЬе 1 Г Вххр 7,Прямое экспрессирование дополнительных зрелых лейкоцитарных интерферонов (1.е 1 Р С, Р, Р, Н, 1 и Ь).Дополнительные генные фрагментыполной длины, которые содержат другие Ье 1 Р типы, могут быть преобразованы в последовательность и помещены в экспрессионные векторы" дляэкспрессирования, как это имеет мес-"то в случае Ье 1 Р А.Короткая длина синтетической ДНК,обрывающаяся на 3 -конце кодирующейспирали, с трансляционным начальнымсигналомАТС затем лигируют, например, путем лигирования тупого концак полученному в результате сшитомугену для зрелых интерферонов, ген внед.ряют в экспрессионную плазмиду и регулируют с помощью промотора и связанного с ним сайта присоединения рибосомыеСогласно способу, аналогичномуОписанному вьппе, генные Фрагменты,ко.,чрующие Ье 1 Г С и Ье 1 Р Р, соответ) сгствующим образом конфигурируют дляпрямого бактериального экспрессирсвания, Экспрессионная стратегия длятаких дополнительных лейкоцитныхинтерферонов в каждом случае включаВет использование приблизительно300 в.р. фрагмента (Н 1 пд 111-БАЛ За),содержащего игр промотор-оператор,сайт присоединения рибосомы, АТС-начальный сигнал и цистеиновый кодонЬеТР А иэ рЬе 1 Р А 25. К нему присоединяют генные фрагменты из дополнительных интерфероновых генов, копирующих их соответствующие последовательности аминокислот выше исходногоцистенна, присущего всем последовательностям. Каждую полученную в ре-"зультате плаэмиду используют длятрансформации Е.со 1 Кштамм 294.Из рЬе 1 Р С выделяют следующиефрагменты: а) 35 в.р. БАБ ЗА-БА 11 96,в).900 в.р. БАБ 96 - Рзе 1, с) выделяют приблизительно 300 в.р. Фрагмента (Ипо 1 ТТ - БАБ За) из рЬе 1 Р 2 бА 25 аналогично описанному в части 4,д) выделяют приблизительно 3600 в,р,фрагмента согласно части 5.Построение.1. Лигируют (а) и (с). Расщепле"иие проводят с помощью Вр 1 11,Нпд ТТ 1 и выделяют приблизительно335 в.р. продукта,2, Проводят тройное лигирование(1)+(Ь)+(й) и трансформацию Е,со 1 х35с помощью полученной в результатеплазмиды.Соответствующий клон полученныйтаким образом, представляет собойЕ.со 11 Кштамм 294/рЬеТГ С игр 35.,ЬеТР В.Из рЬе 1 Р 0 выделяют: а) 35 в,р,БАБ ЗА - А ч аТТ, в) 150 в.р. А у а 11 ВРТ 11, с) приблизительно 700 в,р,В 1 11 - Рвй ТеИз рТ.еТР А 25 вьщеляют: й)300 в.р. Н 1 М Т 11 - БАБ За,Из рВ К 322 выделяют: е) приблизительно 3600 в.р. Ншй 111 - РэС 1.Построение,1. Лигируют (а)+(Ь), разрезают спомощью В 81 11 и очищают 185 в.р,продукта (1).2. Лигируют (1)+(й), разрезают спомощью Нпд Т 11, ВР 1 11 и очищаютприблизительно 500 в.р. продукта (2).2. Лигируют (2)+(с)+(е) и трансформируют Е.со 1 с помощью полученной в результате ппазмиды. Соответствующий клон пслученный таким способом представляет собой Е.со 11 Кштамма 294/р,еТГ Р игр 11, ЬеТГ Г содержащий Фрагмент может бьггь сшит для прямого экспрессирования через пересборку, уггрощенную полной гомологией аминокислот 1-13 Ье 1 Г В и 1,еТГ Г гор промоутер-содержащий фрагмент (а) с ссстветствующим образом конфигурированными концамн получают иэ ЧГР 207 согласно описанному выше, через Рэ 1: 1 и ХЬа 1-расщепление с последующим выделением приблизительно 1050 в.р, Фрагмента. Второй фрагмент (Ь) получают в виде более крупного из Фрагментов, полученных РэТ 1 и Вя 1 11 расщеплением плаэмиды рНК 1 10.фрагмент (а) содержит приблизительно половину гена, кодирующего устойчивость к ампициллину, Фрагмент (Ъ) - остаток гена и полный ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину. фрагменты (а) и (Ь) объединяют через Т 4 лигаэу и продукт обрабатывают ХЬа 1 и Ве 11 для подавления димеризации с образованием Фрагмента (с), содержащего астр промотор-оператор и гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину.фрагмент (Й), содержащий приблизительно 580 в.р., получают расщеплением рЬе 1 Р Г под воздействием А Уа 11 и Вя 1 11. Он содержит кодоны аминокислот 14-166 Ье 1 Г Р.фрагмент (е) (49 в.р,) получают расщеплением рЬеТГ В под воздействием ХЬа 1 и А у а 11, фрагмент (е) кодирует аминокислоты 1-13 ЬеТР Р; -фрагменты (с), (с 1) и (е) подвергают тройному лнгированию в присутствии ЬТ 4-лигаэы. Когеэионные концы соответствующих фрагментов такие, что композиционная плаэьщца находится в состоянии правильной циркуляции и при этом ген устойчивости к тетрациклину находится под контролем игр промотора-оператора совместно с геном зрелого Ье 1 Р Р, так что бактерии, трансформированные с помощью желаемой плазмиды, могут выбираться из пластин. содержащих тетрациклнн. Клон, полу" ченный таким образом, представляет собой Е.со 1 Кштамм 294/рЬе 1 Р Р игр 1.Полный Ье 1 Г Н-ген может быть конфигурирован для экспрессирования в виде зрелого лейкоцитарного интерферона согласно следующему.