Способ определения концентрации ингибиторов биологической активности

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ п 865904(5 )М. Кл,С 12 О 1/26 С 12 М 9/02 Ъоудвретвкииый квинтет СССР в делан изобретений и открьпий(72) Авторы изобретения В.А. Кратасюк, А.М. Кузнецов, А,И. Фиш и И,И, ительзей,. физики им. Л.В. Киренского Сибирско АН СССР сти 71) Заявител(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НГИБИТОРО Из обр ет ени Цель изобретения - увеличение чув. ствительности способа.Поставленная цель достигается т что анализируемую пробу обрабатыв ют реакционной смесью, содержащей дополнительно к люциферазе и ее субстратам НАДНтФМН-оксидоредуктазу и ее субстраты в насыщающих концентрациях, а количество ингибитора определяют по времени достижения максимума биолюминесценции.П р н м е р. Для определения концентрации 2,4-динитрофторбензола в растворе строят калибровочную кривую. Для этого используют препараты люциферазы, содержащий активность НАДИ:ФИН-оксидоредуктазы, полученный из бактерий рода РЬойо Ьасег 1 цш согласно методике, ограничиваясь стадией высаливания сульфатом аммония. Приготавливают раствор, содержащий 0,01 мл препарата люциферазы и НАПН-ФМН-оксидоредуктазы (1,28 мг белка в 1 мл препарата, 0,086 мл 5.10 М раствора относится кпользовано дтрации ингибиктивности (апестицидов,и н может быть и деления концен пре ем,аторовроматичесфунгициявляющихлогическои ест в, веществ дов, канцерогеся компонентами чных вод про ен пс предприя Известенпособ количественного нгибиторов биологической тф тем измерения максимальости свечения при обраруемой пробы реакционной жащей люциферазу и ее и 21,т 5 ствительность этого мето. определе активно ной инт и нсив ализ ботке а смесью, субстраОдна е а максим да недостаточна, так к интенсивность свечения е ентраципаратвительность к маль о зто ингибиторов, а велич чительныхомпонентов ует при нез онцентрацит етра варьолебанияхеакций,-ЭФМН, 0,08 мл 64 1 О М суспензии н-деканаля, полученной озвучиванием при800 кГц в течение 30 с 0,16 мл 10 М2фосфатного буфера рН 6,8 в общемобъеме 1,2 мл. Свечение начинаетсяпри добавлении к этому раствору0,4 мл 4 О М раствора НАДН. Реак-с 1ционная смесь барботируется воздухом. Реакцию проводят в термостатируемой кювете при 20 С, измеряют, время достижения максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси без вещества - 80 с. Ошибка приизмерении йщэ.+ 1,57, При внесенирв реакционню смесь 1 1 О 1, 1 .1 О510 , 10 М 2,4-динитрофторбензола= 97,118,204,240 с соответствахвенно, По этим данным строят калибровочную кривую. При добавлении вреакционьую смесь неизвестного количе тва 2,4-динитрофторбензола измеряют Ф и сравнивают измереннуюфиОхвеличину с калибровочной кривой.Так, если й,с= Й 7 с, концентрация2,4-динитрофторбенэола в раствореравна 2,4 10 М,Аналогичным образом проводят построение калибровочных кривых для определения и бенэохинона и толухинона.На фиг1 изображена динамикаинтенсивности биолюминесценции в реакционной смеси, содержащей люциферазу и ее субстраты (Б), и в. реакционной смеси, содержащей дополнительно НАДН:ФМН-оксидоредуктаэу и еесубстраты ( А) на фиг.2 - изменениединамики интенсивности свечения придействии разных ингибиторов биологической активности,А. 2,4-Динитрофторбензола в кон-бцентрациях 0,5 10 М, 1,25 О М,51 О И, 1,25 1 О Ъ, 2,5 10 М, 4 10 Мкривые 1-7 соответственно). Б, и- Бензохинона в концентрацияхО, 1,25 О М, .1,25 1 О М, 3 10 М,6,2510 М (кривые 1-5 соответственно),В, Толухинона: в концентрацияхО, 1,25 АМ. 1,2510 М, 1,251 О М(кривые 1-4 соответственно).Предложенный способ позволяетувеличить чувствительность иэмерений10 концентраций веществ по сравнениюс известными способами. Предложенныйспособ является экспресс-методом анализа, прост, не требует сложного оборудования и дорогостоящих материалови реактивов, доступен для заводскихлабораторий. Способ может быть использован для определения степени загрязнения водоемов и сточных вод сул фатцеллюлоэных и других предприятий.Формула изобретенияСпособ определения концентрацииингибиторов биологической активности,включающий обработку анализируемой 25пробы реакционнои смесью, содержащейьдлюцифераэу и ее субстраты, о т л и,ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповыШения чувствительности анализа,в реакционную смесь добавляют НАДН: ЗО ФМН-оксидоредуктазу и ее субстратыв насыщенных концентрациях, измеряютвремя достижения максимума биолюминесценции и по его величине определяют концентрацию ингибитора.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Назй 1 пу 1, Ч. В 1 осЬеа 1 э 1 гу,1975, 14, У 19, р.430-4316 (прото 40 тип 7.2. Наэ 11 пдэ 1.11., В 111 еу Ч.Н.,Мазза ). . 81 о 1, СЬет, 1965.240, р.1473-1481.