Олигодезоксирибонуклеотид в качестве универсального праймера для определения первичной структуры днк по методу сенгера

(55 С 07 Н 2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ЕТ НИЕ Изобретение относится к новому хими"-б (6 6 Т 6 С ческому соединению, конкретно к олигодезоксирибонуклеотиду формулы СТТ С 6 С Т)-3 АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биоорганической химии им. М,М.Шемякина(56) ОеОаогй МЛ ., 6 ат М, 6 оеет Р, ет а, Варс зумЬезз о 1 о 9 опцсеотбез Ч. ЕЮсепт ЯуптЬезз о 1 рер 1 адесабеохугЬопцсеотЫез Ьу ап щргочеб зоб рпазе рбозрпотгезсег гоОТе. - Йвс. АСЫ Вез., 1981, ч. 9, р. 1691-1706.Яапцег Р., йсЫеп 3., Соцзоп А,В. ОНА ЯеЦОепсп 9 М 1 Ь спаи Иггппатп 9 пЫЬ 1 огз. - Ргос. ЙаО. Асад. Яс, ОЯА, 1977, ч. 74, р. 5463-5467.(54) ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИД В КАЧЕСТВЕ УНИВЕРСАЛЬНОГО ПРАЙМЕРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК ПО МЕТОДУ СЕНГЕРА (57) Изобретение касается нуклеотидов, в частности олигодезоксирибонуклеотида формулы Ьь-б(6 6 Т 6 С 6 6 6 С С Т СТ Т С 6 С Т)-3 в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Цель иэобретения - создание нового праймера, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить определение первичной структуры ДНК по методу Сенгера. Синтез нового нуклеотида ведут на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляемого блока ВЭЖХ "Атех" и 6-ходовых кранов фосфитным методом, В качестве носителя берут Силохром С 80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц 100 - 200 мкм, диаметр пор 400 - 600 А), в качестве мономерных компонентов используют 5 -0 и й-эамещенные 3-(М,й-диизопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов, Для защиты 5-0 берут диметокситритильную группу, для блокирования экзоциклических аминогрупп цитидина и аденоэина - бенэоильную группу, На носитель сажают первое звено, а последовательность операций при присоединении каждого мономерного звена ведут известным путем с последующим снятием защитных групп известными приемами и определением структуры секвенированием по методу Максама-Гилбер"а. Новый нуклеотид комплементарен (+)-цепи фагов М 13 вр. Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области полилинкера. Разрешающая способность обычного геля с применениемданного праймера выше, чем с применением известного, и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с использованием известного праймера. Это позволяет вести чтение с одного простого геля на клон на 100130 нуклеотидов больше и упрощает бпределение первичной структуры ДН К по методу Сенгера эа счет исключения применения специальных методов. 1 ил., 2 табл, 1700004которое может быть использовано для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера,Целью изобретения является получение нового олигодезоксирибонуклеотида, позволяющего увеличить разрешающую способность структурных гелей и упростить способ определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера,Новый олигодезоксирибонуклеотид комплементарен (+)-цепи фагов М 13 ар, Сайт отжига праймера расположен на расстоянии 120 нуклеотидов от области пол илинкера (п рэймер - 120).На чертеже приведена структурная формула.П р и м е р 1. Синтез олигодезоксирибонуклеотида формулы (1),Синтез олигодезоксирибонуклеотида проводят на трехколоночном полуавтоматическом синтезаторе, сконструированном на основе управляющего блока ВЭЖХ "А 1 ех" и шестиходовых кранов фосфитным методом, В синтез берут 15 - 20 мг носителя с посадкой первого звена, В качестве мономерных компонентов используют 5-0 и Н-замещенные 3 -(Й,К-диизопропиламид)метилфосфиты нуклеозидов. В качестве 5 -0-защитной группы применяют диметокситритильную группу. Для блокирования экзоциклических аминогрупп гетероциклических оснований цитидина и аденозина используют бензольную группу, для гуанозина - изобутирильную группу. В качестве твердофазного носителя применяют Силохром С 80, содержащий аминопропильную группу (размер частиц 100 - 200 мкм, диаметр пор 400 - 600 А). Последовательность операций при присоединении , каждого мономерного звена следующая: промывка - ацетонитрил (2 мл, 0,5 мин); детритилирование - 0,2 М трифтороуксусная кислота в дихлорэтане (2 мл, 0,7 мин); промывка - ацетонитрил (3 мл, 0,8 мин); конденсация - 0,1 М раствор мономера/0,5 М раствор тетразола в ацетонитриле (1/1, ч/ч; 0,15 мл, 3 мин), добавление нуклеотидного компонента и тетразола проводят вручную с помощью шприца; купирование - М-метилимидазол/пиридин/уксусный ангидрид/дихлорэтан (1/1/1/1, ч/ч, 0,5 мл, 0,5 мин); окисление - 1 о -ный раствор йода в смеси уксусной кислоты с пиридином (1/9, ч/ч, 0,7 мл, 0,5 мин). После окончания синтеза проводят удаление защитных групп. Сначала удаляется диметокситритильная группа обработкой 0,2 М раствором трифтороуксусной кислоты в дихлорэтане непосредственно в реакционной колонке. Затем полимер обрабатывают смесью тиофе 5 -б(6 Т А А А А С 0 А С 0 О С С А 6 Т)-3 (2) 40проводят в растворе общим объемом 5 мкл, содзержащем 2 - 3 пМ праймера, 3 пМ(а- Р-АТР (уд, активность 3000Ки/мМ), 50 мМ трис-НС (рН 8,3), 35 мМ МдС 2 и 0,1 - 1 ед, активности полинуклеотидкиназы (37 С, 30 ми н.), После добавления 7 мкл (2 мкг) фага М 13 гпр 10 с клонированным фрагментом - интерферона быка и 1 мкл буфера; 50 мМ трис-НС 50 (р,3), 35 мМ МЯС 2, проводят отжиг при55 С 15 мин. Фаг с отожженным праймером разносят в микротитровальную плашку (по 3 мкл) в лунки с обозначениями "О", "А", "Т", "С". Затем в каждую лунку добавляют по 2 мкл соответствующих смесей бКТРйбйТР (табл. 1) и 1 мкл (1 ед.акт.) фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е и инкубируют при 37 С 15 мин, После добавления 1 мкл раствора со (2,5 мМ каждого) инкубируют при 37 С 15 мин. Затем добавляют по 3 мкл буфера 10 15 20 25 30 35 нол/триэтиламин/диоксан (1/1/3, ч/ч) для удаления О-метильных защитных групп. Снятие олигодезоксирибонуклеотида с полимера и удаление М-ацильных защитных групп проводят обработкой раствором аммиака (8 - 30 о ) при 60 С в течение 12 ч. Носитель удаляют фильтрованием после охлаждения до 0 С. Фильтрат упаривают в вакуумном испарителе, растворяют в 200 мл воды. Очистку полностью деблокированного олигодезоксирибонуклеотида проводят в 20 о -ном денатурирующем полиакриламидном геле с 7 М мочевиной в стеклянных пластинах (20-20 см). Электрофорез ведут при напряжении 600 В, В качестве электродного буфера используют 0,05 М трис-борат (рН 8,2), 1 мМ ЭДТА, После окончания электрофореза гель помещают на флуоресцентную пластину РМо .Ч, зону,содержащую олигонуклеотид, идентифицируют под источником УФ-излучения. Элюцию олигодезоксирибонуклеотида из вырезанной зоны полиакриламидного геляпрозодят в 200 мкл 12% ного раствора пархлората натрия при 37 С в течение 12 ч. Олигодезоксирибонуклеотид осаждают 9 объемами ацетона и растворяют в воде до концентрации 0,5 о.ед/мл, Структуру синтезированного олигонуклеотида подтверждают секвенированием по методу Максама-Гилберта.П р и м е р 2. Использование олигсдезоксирибонуклеотида формулы (1) в качестве праймера.Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидов формулы (1) и известного формулы1700004 Таблица 1 блица 2 для нанесения (деионизованный формамид, бромфеноловый голубой, ксиленцианол), прогревают при 80 С 30 мин и 2-3 мкл каждой реакционной смеси разделяют в денатурирующем полиакриламидном геле, Продукты реакции по Сенгеру с использованием олигодеэоксирибонуклеотида формулы (1) разделяют в обычном полиакриламидном геле, с использованием олигодезоксирибонуклеотида формулы (2) - в обычном и градиентном полиакриламидном гелях. Применяют гели толщиной 0,4 мм. Состав обйчного денатурирующего полиакриламидного геля; акриламид 5 (19:1, акриламид;бис-акриламид), мочевина 50=,ь, Трис 130 мМ,борная кислота 40 мМ, ЭДТА 2,8 мМ, рН 8,8.Состав градиентного денатурирующего геля. акриламид 5 О (19:1, акриламид:бисакриламид), мочевина 50 О, градиент буфера (1;2,5); от верхней части геля - 65 мМ Трис, 20 мМ борной кислоты, 1,4 мМ ЭДТА (рН 8,8) к нижней части геля - 325 мМ Трис, 100 мМ борной кислоты, 7 мМ ЭДТА, 10 О сахарозы (рН 8,8),Сравнительные характеристики результатов электрофореза приведены в табл, 2,Злектрофорез проводят при постоянном токе 30 мА с использованием металлической пластины для термастатирования.Как видно иэ табл, 2, разрешающая спо собность обычного геля с применениемпраймера (1) значительно превышает разрешающую способность геля с применением праймера (2) и сравнима с разрешающей способностью градиентного геля с исполь зованием праймера (2).Таким образом, использование изобретения позволяет увеличить разрешающую способность структурных гелей, что позволяет чтение с одного простого геля на клон 15 на 100-130 нуклеотидов больше и упроститьспособ определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера за счет исключения применения специальных методов,20 Формула изобретения Олигодеэоксирибонуклеотид формулы 5 -б (6 О Т 0 С 0 0 6 С С Т С Т Т С 0 С Т)-3 25 в качестве универсального праймера для определения первичной структуры ДНК по методу Сенгера,1700004 Н 1 пс 11 Бпв Асс 1 Бз 11 Хпа 1 ХЬа 1 Яа 11 ЯрЫ ДАТОАТТАСЯААТТСЯАЯСТСЯОТАСССЯЯООАТССТСТАЯАЯТСЯАССТЯСАОЯСАТЯСААЯСТТ Есой 1 Крп 1 ВавИ 1 РяС 1 Н 1 пс 1111ТЯАССЯЖАЯСААААТЯ - 5. ( -20)ОЖАСТОЯССОТ СОТ ТТТ АСААСЯТСОТЯАСТООЯААААССССТ 68 СОТТАСССААСТТААТСЯСС ТСЯСТТСТССЯЯЩОТОО -. б (-120)ТТОСАОСАСАТСССССТТТСЯССАЯСТООСОТААТАЯСОААЯА 88 СССЯСАССОАТСЯСССТТССС Составитель Г.КонноваТехред М.Моргентал Корректор Н, Король Редактор И.Шмакова Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 4441 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5