Штамм бактерий bacillus амylоliquеfасiеns-продуцент амилазы bacillus liснеnifоrмis

(19 5) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АТЕНТУ РИ И ВАС 1 Ш 35 ПРОДУЦЕНТ а- Н ЕИ 1 ГОВМ 13 ы термоцЬт 1 з, со- -амилазы ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут генетики и селекции промышленных микроорганизмов(73) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут генетики и селекции промышленных микроорганизмов(54) ШТАММ БАКТЕАМУ О 1 С 10 ЕРАС 1 ЕИЯАМИЛ Ы ВАСО ОЯС Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологической промышленности и представляет собой штамм Вас 11 цз ащуо 1 ццеГас 1 епз агпу-, содержащий рекомбинантную плаэмиду, кодирующую синтез термостабильной а -амилаэы ВасНцз 11 сЬепаоггл 1 з, - продуцент термостабильной а-амилаэы.а -Амилаза - фермент, разлагающий амилозную компонен"у крахмала, используется в пищевой промышленности для разжижения крахмал-содержащего сырья с целью получения глюкозо-фруктозных сиропов. Другое важное применение а-амилазы - .текстильная прбмышленность, где ее(57) Использование: биотехнология, генетическая инженерия, микробиологическая промышленность, Сущность изобретения: плазмиду рВАТАМ 2, несущую ген термостабильной а -амилазы В,11 сЬепИоггпз, вводят в штамм В.апу 1 о 11 сце 1 ас 1 епз ВКПМ В, которь 1 й лишен собственной мезофильной а -амилазы. Полученный штамм-продуцент ВКПМ Впри культивации на промышленных средах выделяет значительные количества термостабильной а-амилазы, Поскольку кодирующая фермент плаэмида рВАТАМ 2 стабильно поддерживается в В.аау 1 о 11 сце 1 асепз, нет необходимости добавлять в среду антибиотик. Заявляемый продуцент секретирует в среду а-амилазу в количестве 250-280 ед. ГОСТмл. Фермент по качеству не уступает препарату тер- Щ мостабильной а-эмилазы фирмы "319 па" с температурным оптимумом 90 С. 2 табл.Р используют для расшлихтовки тканеи. Эти процессы протекают при весьма высоких температурах (до 105 С), что обуславливает необходимость повышения стабильности фермента при высоких температурах. Лучшими продуцентами бактериальных разжижающих а -амилаз являются в настоящее время штаммы Вас 11 цз этуосцеГас 1 епз или штаммы ВасШцз зцЬ 111 з, содержащие фрагмент ДНК, кодирующий а-амилазу из ВасШцз атуоцце 1 асепз. Однако, термоинактивация этой а -амилаэь 1 происходит уже при температуре 70 С,Известны штаммы-и родуцентстабильной а-амилазы ВасШцз здержащие плаэмиду с геном аВасГИиз сйепПоггп 13. Однако использование таких штаммов в промышленности затрудняется относительно низкой продуктивностью, Штамм В.аву 1 оИцие 1 асепз агпу-Ят-(рВАТАМ 2) (В) выбран в качестве прототипа. Этот штамм производит а-амилазу с необходимыми свойствами, но обладает недостаточной продуктивностью секретируемой термостабильной а-амилазы. Именно поэтому, повышение продукции термостабильной а -амилазы представляет собой важную задачу,- Цель изобретения - повышение уровня продукции секретируемой термостабильной а-амилазы ВасИиз с 1 епйоггп 1 з.Поставленная цель достигается созданием нового штамма Вас из агпуоИцие 1 асепз аву-(рВАТАМ 2) - продуцентатермостабильной а -амилазы, имеющего регистрационный номер ВКПМ Вво Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и секретирующего 220- 250 ед. активности фермента на 1 мл культуральной жидкости, Активность а-амилазы определяют, как описано в методике Госстандарта ГОСТ 20264. 4-74.Штамм продуцент Вас 111 из агпу 1 оИцие 1 асепз апу- (рВАТАМ 2) (В) получают путем введения рекомбинайтной плазмиды рВАТАМ 2, которая кодирует синтез термостабильной а-амилазы В.ИсЬепОогт 1 з, в протопласты бесплазмидного штамма ВасИиз ату 1 оИциеГас 1 епз ату-(В) известным методом трансформации (ЕЕМС МсгоЬо 1.естегз, 1988, ч,48, 101 - 105),Выбор штамма Вас 1 из алчуоИциеХас 1 епз аглу-ВКПМ (В) обусловлен тем, что этот штамм имеет мутацию в гене мезофильной а-амилазы на хромосоме и, соответственно, не сек,ретирует собственной активной а-амилаэы. Штамм может продуцировать только термостабильную аамилазу В.ИсйепНоггл 1 з, кодируемую введенной в штамм плазмидой рВАТАМ 2,Морфологические признаки.Клетки прямые, палочковидные, размером 2,5 - 4,0 х 0,5 - 0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0 - 1,2 х 0,6 - 0,7 мкм,Культуральные признаки.Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, матовые, желтова- то-серые, край неровный, лопастной, При росте в жидких средах; мясопептонном бульоне,В-бульоне без аэрации образуютсухую пленку без помутнения среды, а при аэрации интенсивную муть.Физиолого-биохимические признаки.Клетки растутпри 20 - 45 С при оптимуме рН 6,8-7,5,В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: О-глюкозу, О-фруктозу, лактозу, Не усваивают ацетат, галактозу,10 В качестве источника азота используюттона, аминокислот.15 как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пепЖелатину разжижают, Индол не образуют. Уреазную активность не обнаруживает. П р и м е р 1, Конструирование штаммапродуцента ВасИ 1 из агпуоИциеГас 1 епз агпу(рВАТАМ 2), (ВКПМ),20 Для трансформации В.агпу 1 оИциеГас 1 епз агпу- плазмидой рВАТАМ 2 используют метод,описанный ЧеЬгпаапрега (РЕМЗ М 1 сЬгоЫоЛ ессегз, 1988, ч.49, 101). Трансформация, протопластов клеток 25 В.агпуоИциеГас 1 епз апу (В) проводят следующим образом: 1 мл суспензии ночной культуры В.агпу 1 оИциеГас 1 епз аву вносят в 9 мл питательного бульона РС и выращивают до титра 10 кл/мл. Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин,20 С),30 дважды промывают специальной средой ЗММР (ЧеЬщаапрега, ЕЕМЯ М 1 сгоЫо 1, ецегз, ч.49,101), а затем ресуспендируют в среде ЯММР, содержащей 100 мг/мл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 42 С. Образовавшиеся протопласты промывают средой ЯММР с добавлением 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина и используют для трансформации Плазмидную ДНК рВАТАМ 2 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при ОС с протопластами клеток В.агпу 1 оИцие 1 ас 1 епз аау и 22 -ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленном на буфере ЯММР. Последесятикратного разве 35 40 дения средой ЗММР с 0,1 ф -ным альбуми 45 ды рВАТАМ 2 в штамме Вас 1 из агпуоИцие 1 асепз ату (рВАТАМ 2) (ВКПМ В) проводят следующим образом: ном трансформированные протопласты высаживают центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 20 С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30 С и 50 высевают на агаризованную среду ОМЗ сэритромици нам (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производят через 48 ч роста при 37 С. Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину 10 мкг/мл и гидролизирующие 55 амилопектиназур (0.150 ) или крахмал (0,11 -),Анализ генетических маркеров плазми1. Устойчивость к эритромицину клеток В.агпу 1 оИцце 1 асепз (В), содержащих плаэмиду рВАТАМ 2, анализируют на среде с содержанием эритромицина 5 - 20 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина.2. Наличие секретируемой термостэбильной а -амилазы в клетках В,агпу 1 оИцце 1 асепз (В), содержащих плазмиду рВАТАМ 2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов наносят микробиологической петлей на чашку Петри с твердым 1 В-агаром, содержащим 0,15% амилопектиназура, в виде точек или полос и инкубируют при 37 С 18 - 24 час. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона гидролизованного амилопектиназура. Клетки исходного штамма - реципиента В.ату 1 оИс 1 цеГасепз (В), не содержащие плазмиды рВАТАМ 2, зон гидролиза амилопектинэзура не образуют, так кэк не содержат собственной секретируемой а-амилазы.Определение активности термостабильной а-амилазы,Активность термостабильной а-амилазы определяют по методике Госстандарта СССР (Методы определения амилолитической активности ГОСТ 20264.4-74).Активность термостабильной а-амилазы в культуральной жидкости определяют во время ферментации определяют по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10 мМ Кэ-К-фосфатном буфере, рН 6,0, содержащем 1 гпМ СаС 12 и 33 мМ КаС 1. Реакционная смесь содержит 10 мл 1%-ного раствора растворимого крахмала, растворенного в 15 мМ йа-К-фосфатном буфере рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 м М ацетатном буфере, рН 6,0, 3 мМ СаС 12, 100 мМ КэС супернатанта культуральной жидкости бактерий иэ ферментации), Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера для разведения фермента, Пробы инкубируют при 30 С 10 мин, Реакцию останавливают добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 Ы раствора НС 1. Иэ полученной смеси отбирают 1 мл и переносят в 10 мл раствора йода, содержащего 0,0025% 1 и 0,025% К 1. Реакционные смеси выдерживают при 20 С 20 мин и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм, Полученные растворы приобретают окраску; контрольный раствор - синий цвет, опытный раствор - фиолетовую окраску различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала, Контрольным раствором при колориметрировании является дистиллиро 01 10 15 20 40 става, г/л: картофельный крахмал, осахаренный а -амилазой - 200, кукурузный экстракт - 18, дрожжевсй экстракт - 2,4, лактоза - 0,6, (МН 4)2 НРО 4 8,4; К 2304 - 3.50 МаС - 0,3; М 9504 х 7 Н.О - 0,15; Сц 504 -0,0039; рН 7,2, штаммы В,авуоИс 1 це 1 ас 1 епзВи В, содержащие стабильно наследуемую плазмиду рВАТАМ 2, выращивают нэ среде без антибиотика, процесс 25 30 35 ванная вода, Количество прогидролизованного крахмала определяют по формуле где 01 - оптическая плотность контрольного раствора, 02 - оптическая плотность опытного раствора, 0,1 - количество субстрата, взятое для испытания в качестве субстрата, г, Если количество прогидролизованного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,06 г, то испытание повторяют, подбирая разведение фермента.Амилолитическую активность (АС), ед/мл, определяют по формуле 5,ЯГ 5 х С - 0.00 67 АС хп, где С - количество гидролизованного крахмала, г:и - величина разведения,За единицу активности амилолитических ферментов (АС) принято такое количество ферментов, которые при строго определенных температуре, рН и времени действия гидролиэуют до декст инов различной молекулярной массы 1 г г астворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.Полученн,й штамм имеет максимальную активность 287 ед/мл ч,:рез 77 ч, что соответствует 5 г/л.П р и м е р ы 2 - 8. Получ,:ние термосгабильной а-амилазы с помощью рекомбинантного штамма Вас 1 Ицз агпу оИг 1 цеГас 1 епз аву (рВАТАМ 2) (ВКПМ В).Накопление термостабильной а-амилазы В.ИсЬеп 11 оггпз в культуральной жидкости штаммов В,атуо 11 с 1 цеГас 1 епз апу(рВАТАМ 2) (ВКПМ В) - заявляемый штамм и (В КП М В) - и рототип изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего соферментации проводят в ферментере Магцб 1 зл М 0-150 с рабочей емкостью 0,75 л при 37 С. Активность фермента измеряют в ходе ферментации по методу, описанному выше, Данные по накоплению термоста1788966 Таблица 1 Накоплейие термостабильной а - амилазы В.ИсЬепОогщз,продуцируемой штаммами В. ащуоИоое 1 асепс ВКПМ Ви В, ащу 1 оИцое 1 ас 1 епз ВКПМ В( штамм прототип ) во время ферментацииилолитической активно 7бильной а-амилазы В,ИсЬеп 1 Гогщ 13 в культуральной жидкости В,ащу 1 о 11 цое 5 ас 1 епэ а щу (рВАТАМ 2) (В КП М В) и В,ащу 1 оИцие 1 асепз ащу- Ягп (рВАТАМ 2) (ВКПМ В) во время ферментации суммируются в табл.1.Предлагаемый в данной заявке рекомбинантный штамм-продуцент термостабилъной а -амилазы в 1,4-1,5 раэ более продуктивен, чем исходный штамм-.прототип (максимальная активность -172 ед/мл),П р и м е р 9, Сравнение свойств а-амилазы, продаваемой фирмой "Я 19 ща", и аамилазы, полученной заявляемым штаммом-продуцентом.Данные по свойствам термостабильной а-амилазы В.ИсЬепОогщ 1 з, секретируемой заявляемым рекомбинатным штаммом-продуце н том В. а щ уо 1 о о еаза с 1 е и э а щу(рВАТАМ 2) (ВКПМ В) и свойства термостабильной а -амилаэы В,ИсЬеп 0 огщ 1 з, . продаваемой фирмой "Я 19 ща" ( а-Ащу 1 азе, Туре Х 11-А, Ьас 1 ег 1 а 1, 1 гощ Вас 1 озГОСТ 20264. 4-74 "Методы определ 11 сЬеп 0 огщ 1 з, Ио А 3403) суммируются втабл,2.Свойства термостабильной а-амилазыВ.ИсЬепИогщ 3 фирмы "Я 19 ща" проверялиськак в данной работе, так и описаны ранее5 (Я.Тощаг 1 с, А.М.К 11 Ьапоч, Зоигпа 1 о 1В 1 оо 91 са СЬещ 1 з 1 гу. ч,263, Ио, 7. р.30923096, 1988). Из анализа данных, представленных в 10 табл.2, ясно, что предлагаемый в данной заявке рекомбинантный штамм-продуцент термостабильной а-амилазы В.1 сЬеп 0 огщз,В.ащу оИсрзе 1 ас 1 епз ащу (рВАТАМ 2) ВКПМ В 5208 секретирует в культуральную жидкость 15 фермент, который по свойствам не уступает аналогичному ферменту фирмы "Я 9 ща", а именно: молекулярная масса, оптимальные рН и температура, изоэлектрическая точка,термостабильность совпадают с таковыми 20 препарата а-амилазы фирмы "Я 9 ща",Формула изобретения Штамм . бактерий Вас 1 цз ащуоИцоеГасепэ ВКПМ Впродуцент а-амилаэы ВасИ 1 оз ИсЬепГогщ з.10 1788966 Таблица 2 а - амилаза В.ПсЬепИогаз фирмы "39 аа" Туре ХП - А а - амилаза В.ПсЬепИоппз из штамма В. аа оП ое 1 асепз ВПоказатель 55 Молекулярная масса, Юа Изозлектрическая точка р7,5 7,5 рН оптимум ферментативной активности7,5 7,5 Температурный оптимум фементативной реакции,С90 90 Термостабильность при 90 Стечение 1 ч, при рН 8, при инкубации фермента без субстрата ( крахмала ) Сохранение 100 актив. Сохранение 1000/, актив,Удельная активность( ед.ГОСТ / мг), при рН 6,0, Т ==30 С 50 54 Составитель В.НародицкаяТехред М,Моргентал Корректор В,Петраш Редактор Заказ 82 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 ферментативная активность термостабильной а - амилазы, измеряемая при 90 С (температурный оптимум ферментативной реакции) возрастает на 60-70 (в диапазоне рН 6-8) по сранению с активностью, измеряемой при 30 С по ГОСТ 20264, 4-74 методике (в том же диапазоне рН).При определении концентрации белка по удельной экстинкции термостабильной а - амилазы величина удельной активности составляет 30 ед. ГОСТ/мг,