Способ конструирования плазмидного вектора рнс314 или рнс312, или рнс624

,8014438 4 с 12 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ 5есети Дь ти 48 К 088 поча 8 оп оЙ, 1 авшЫ ч. 28 8) .1 ео 1 аЬп 8 Ьег РОК. В 5,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Рихтер Гедеон ВедРТ (НБ)(72) Имре Борош, Пал Ви Дьердь Пошли (НП)(56) Бевчега 8 НосЬапгуоп апд сЬагасСегдзагсору ппшЬег шШапС оРо 1 ха шдсгоЬ 1 о 1. 1983,р. 345-352,(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА рНС 314 ИЛИ рНС 312,ИЛИ рНС 624 Ъ (57) Изобретение относится к биотехнологии, генной инзенерии, а более конкретно к способу получения плазмндных векторов. Целью изобретения является конструирование плаэмидных векторов на основе рВК 322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко используемые векторы. Плаэмидные векторы рНС 314, рНС 312 и рНС 624 обладают большим числом копий эа счет то- го, что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутация типа замены С. Т в положении 3074 участ гена.Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, а болееконкретно к способу получения плазмидных векторов.5Цель изобретения - конструирование плазмидных векторов на основерВК 322, которые обладают большимчислом копий на клетку нежели извес.:- ные и широко используемые векторы.Плазмидные векторы рНС 314, рНС 312и рНС 624 обладают большим числомкопий за счет того, что в гене, ответственном эа продуцирование репрессора плазмидной репликации, по"лучена мутация,П р и м е р 1, Плазмидную рНС 1расщепляют рестрикционными эндонуклеазами ЕсоК 1 и Ртц 11, а затем од, нотяжевые концы дополняют субфрагментом Кленова фермента ДНК полимеразы Т в присутствии ЙТР субстратов.У полученных таким образом молекулДНК с тупыми концами восстанавливают кольцевую структуру ДНК лигазой Т и трансформируют в НВ 101клетки. Иэ колоний, растущих на содержащей ампициллин среде, выделяютплазмидную ДНК и ДНК-образцы, которые анализируют с помощью агарозного 30и полиакриламидного гельэлектрофореза после переваривания с рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК 1, Рчц 1.1и ВярР 1. На основании полного молекулярного веса плазмиды (2,3 АСЬ) иразмера фрагментов, полученных прирасщеплении ВврР 1 (587; 457; 434;267; 240; 80 Ьр) устанавливают, чтоплазмида рНС 81 содержит участокмежду нуклеотидами 2069 и 2 плазмидырВК 322 с мутацией, ответственной завысокое число копий.Выделяют Фрагмент ДНК размером/ 1030 вр, полученный расщеплениемрНС 81 рестрикционными эндонуклеазамиРя 1 и Тац 1, фрагмент ДНК размером780 вр, полученный расщеплениемрВК 322 ферментами Рв и С 1 а 1, ифрагмент ДНК размером 218 вр. полученный расщеплением рВК 329 ферментом50Тая. 1. Три полученных. фрагмента ДНКсмешивают в эквийолярном соотношении,сшивают ДНК лигазой, а клетки НВ 101трансформируют лигатом, Из отдельныхклонов, выращенных на содержащейампициллин среде, выделяют плазмидную ДНК. Эти плазмиды обладают фенотипом большого числа копий. Расщепляя плазмидные ДНК рестрикционными эндонуклеазами, устанавливают,что они были получены путем связывания трех хорошо различных фрагментов различного происхожденияВ этихплазмидах проксимальная часть Р -1лактамазного гена была получена изрВК 322, участок ответственный зарепликацию - иэ плазмиды рВК 322, афрагмент, выделенный из рНС 81, содержал кроме дистальной частилактамазного гена также мутацию,приводящую к высокому числу копий.Следовательно, мутация образовывафется между нуклеотидами 2573 (Тац 1)и 36 12 (РвС 1) ДНК плазмиды рВК 322.Опеределяют нуклеотидную последовательность этого участка и сравниваютс известной последовательностьюрВК 322, В результате этого сравнения устанавливают замену в положении 4074 гена.Как результат образовавшейся точечной мутации окончание транскрип.ции репрессорной РНК нарушается ипроисходит синтез РНК большего молекулярного веса, которая уже не может более функционировать как репрессор репликации. Окончание репрессорной функции приводит к большомучислу копий. За счет этой спонтанной точечной мутации число копийплазмиды в клетке можно повысить в20-30 раз (примерно 1000) по отношению к исходному значению. За счетэтой точечной мутации число копийлюбой плазмиды с тем же участкомрепликации, что и рВК 322, можно существенно увеличить.Е.со 1 т. НВ 101 клетки трансформируют плазмидой рНС 314. Выделяют плазмиду ДНК и анализируют с помощью гельэлектрофореза после расщепленияЕсоК 1 и Ря 1 1 рестрикционными эндонуклеазами, Для дальнейших исследованийотбирают плазмиду, которую можнорасщепить на фрагменты 2300 и 110 врс помощью ЕсоК 1 и на фрагменты 1580и 820 вр с,помощью РвЕ 1 (рНС 314),Плазмиду расщепляют рестрикционнойэндонуклеазой ВашН 1 и полученную линейную молекулу частично расщепляютферментом НпГ 1. Фрагменты ДНК размером 2010. вр выделяют в 1,27-номагарозном геле,Концы молекулы содержащей однотяжевые участки, пслуча.ные при расщеплении ферментами ВашН 1 и НпГ 1,превращают в тупые концы субфрагмен з144380 том Кленова с помощью ДНК полимеразы 1,а затем рециркуляризируют Т индуцированной полинуклеотидной лигазой. Легированные ДНК трансфор 5 мируют в клетки НВ 101 и выделяют един:чные .:олонии. Получают плазмиду рНС 312, которую нельзя расщепитьэндонуклеазой ВашН 1, но можно линеаризировать ЕсоК 1 и получить фрагменты 10 1495 вр и )1 э вр после расщепления НпГ 1. Для получения вектора с большим числом копий подходящего для клонирования ДНК фрагментов с тупыми концами, плазмиду рНС 312 расщепля ют рестрикционными эндонуклеазами ЕсоК 1 и Нпй 111, а затем из агарозного геля выделяют фрагмент 1980 вр. Этот Фрагмент смешивают с ДНК плазмиды ПАИ 7, расщепленной ферментами 20 ЕсоК 1 и НпЕ 111, и связывают молекулы полинуклеотидной лигазой. Клетки Е,со 1 НВ 101 трансформируют легированной плазмидой и из единичных бактериальных колоний, устойчивых к 25 Ашр, выделяют плазмидную ДНК, Плаз" мидная ДНК, полученная таким образом (РНС 624), не имеет С 1 а 1 сайта, но в отличие от плазмидной рНС 312 ее можно разрезать рестрикционными эн- З 0 донуклеазами Бша 1, Ба 11 и ВашН 1.П р и м е р 2. Для определения относительного числа копий рНС плазмид выращивают Е.со 1 НВ 101 культуры, содержащие плаэмиды различных разме ров, полученные из рекомбинантных рВК 322 и производных с большим числом копий т эго же размера до достижения идентичной плотности клеток. Из идентичных количеств полученных сус пензий без амплификации выделяют плазмидную ДНК. Образцы, взятые из препаратов ДНК, подвергают электроФоретической обработке на агарозном геле в 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 45 40- и 50-кратном разбавлении соответственноПлазмиды с большим количеством копий и их пары с нормальным числом копий (того же молекулярного веса) исследуют одновременно, Результаты экспериментов показывают, что число копий рНС плазмид в 20 - 30 раз больше, чем число соответствующих рНВК 322 производных с "нор мальным числомкопий 55П р и и е р 3, Абсолютное число копий рНС глазмид определяют путем мечения ДНК клеток, содержащих плазмиды хп чиччо и измерения отношения радиоактивности в выделенных плазмид" ных ДНК и в хромосомных ДНК, Этим способом число копий плазмид одинакового размера с рНС 314 (ИВ 1,6 х 10 д) составляло около 1000 на клетку (мол. вес хромосомы2 10 д) От 60 до 657. полного содержания ДНК клетки составляет плазмидная ДНК. Для мечения ДНК п ч.чо клетки, содержащие плазмиды, культивируют на И 9 культуральной среде, дополненной следующими компонентами: 0,5 казаминовой кислоты (Р 1 Есо), 0,57. глюкозы; 1 мкг/мл витамина В,;2 ммоль ИяЯО , 2 мкг/мл тнмидина;250 мкг/мл аденозина и 0,4 мВ 8/мл ( Н-тимидина) 888 Вр/моль (Хемапол, Прага) .Клетки, содержащие плазмиды, расщепляют. Хромосомные и плазмидные ДНК отделяют друг от друга градиентным центрифугированием с этидиумбромид(цезий)хлоридом в равновесной плотности клеточного лизата, полученного из бактериальной суспензии, выросшей на 2 мл/ОД, = 4 - 5 (45000 об/мин, 40 ч, 20 С).Плазмидные векторы рНС 312, рНС 314 и рНС 624 07,03.84 г, депонированы в Национальной Коллекции Иикроорганизмов (ОК 1, Венгрия) под кодом 9 00279, 00280 и 00281 соответственно.Формула изобретенияСпособ конструирования плазмидного вектора рНС 314 или рНС 312, или рНС 624, заключающийся в том, что плаэмидную ДНК рНС 1 расщепляют ретрикционными эндонуклеазами ЕсоК 1 и Ргц 11, затупляют концы с помощью субфрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии ИМАТР,восстанавливают кольцевую структуру ДНК с помощью ДНК лигазы Т и трансформи - руют штамм бактерий ЕзсЬегсМа со 1 д НВ 101, из ашр" клонов выделяют плазмиду рНС 81, которая содержит точечную мутацию С - Т в положении 3074 участка гена, кодирующего репрессорную ДНК, далее ДНК плазмиды рН 081 обрабатывают эндонуклеазой ЕсоК 1, дефосфорилируют щелочной фосфатазой и сшивают с ЕсоК 1 фрагментом плазмиды ПУХ, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют штамм Е.со 1 д НВ 101, отбирают ашр колонии, из нихРедактор И,Дербак Заказ 6401/58 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5 14438 выделяют плазмидкую ДНК, расщепляют Е.соВ 1 и РвС 1 эндонуклеазами и отбирают рНС 314, которая может быть расщеплена на Фрагменты размером 2300 5 и 100 1 Ь и на Рз 1 Фрагменты размером 1580 и 820 1 Ь, далее рекомбинантную плазмидную ДНК рСН 314 в случае конструирования рНС 312 расщепляют Ваш Н 1 эндонуклеазой, затем полученную 10 линейную ДНК частично гидролизуют НпГ 1 эндонуклеазой, выделяют Фрагмент размером 2010 ЕЬ, восстанавли" вают кольцевую структуру ДНК, транс". Формируют штамм Е.со 1 х НВ 101 данной 15рекомбинантной ДНК и отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНС 312, со 06 6держащую Е,соК 1 и НпГ 1 сайты рестрикции и образующую фрагменты размером 1495 и 5 16 КЬ после расщепления эндонуклеазами Е.соК 1 и Н 1 п 11 плазмиду рНС 312 в случае конструирования рНС 624 расщепляют Е .соВ 1 и Нпй 111 эндонуклеазами и выделяют Фрагмент 1980 1 сЬ, смешивают с расщепленной Ферментами Е.соК 1 и Нпй 111 ДНК плазмиды ПИЛ, фрагменты сшивают ДНК лигазой Т, трансформируют штамм бактерий Е.со 1 НВ 101, полученной плазмидой и из ашр клонов отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНС 624, содержащую Яша 1, Ба 11 и ВашН 1 сайты.