Штамм е. 1651, содержащий плазмиду 307-продуцент термолабильного токсина

ОЮЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК а аиБО 2 И 15 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ИСА СТВУ(54) ШТАММЩий ПЛАЗМИОЛАБИЛЬН льский инсти"робиологии(57) Штамм щий плаэмид ция Научно тута эпиде им,Н.Ф.Гам бильного т Янишевскийиов е 1 веп 1979,А. у, 198 К АВТОРСИОМУ СВИ"1 пСесйоп апй 1 шьыпь.сч.24, В 3, р.760.1 песСхоп апд 1 апыпч,36, У 1, р.215-220. ЗОБРЕТ 01.1 К Б 1651, СОДЕРЖАЬ Т 307-ПРОДУЦЕНТ ТЕРОКСИНА Е.со 1 К 81651, содержау рЬТ 307, У 10 коллекисследовательского инст иологии и микробиологии леи - продуцент термола оксина.022702 50 11Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к получению непатогенного штамма Е.со 1, характеризующегося повышенной продукцией термолабильного токсина.Препарат термолабильного токсина Е.со 1 является веществом, необходимым для получения вакцин и сывороток против диарейных,забблеваний человека и животных, вызываемых патогенным Е.со 11.Известные штаммы Е.со 1 д, продуцирующие термолабильный токсин, являлись природными патогенными штаммами, выделенными от больных. животных и людей. Эти штаммы характеризуются относительно низкой продукцией токсина (0,4-0,5 мг на 1 л культу- ральной жидкости).Цель изобретения - создание генно- инженерным способом высокопродуктивного штамма термолабильного энтеротоксина, непатогенного для животных и человека.Предлагаемый штамм Е.со 1 КЗ 1651 синтезирует в 10 раз больше термола. бильного токсина, чем исходный природный штамм Н 74-114, выделенный от больного человека. Штамм КЗ 1651 является непатогенным, так как создан на основе штамма Е.со 1 х К 12, который не может колонизировать тонкий кишечник животных и человека - ,место действия термолабильного энтеротоксина. Штамм КЗ 1651 содержит гибридную плазмиду рЬТ 307,созданную на основе векторной плазмиды рВВ 322 и природной плазмидывыделенной из штамма Н 74-11.4 и детерминирующей синтез. термолабильного токсина. Конструирование плазмиды рЬТ 307 осуществляли с помощью рестриктацион.- ной эндонуклеазы Р зй 1, Полученная гибридная плазмида содержит . вставку размером в 6 тыс.нуклеотидных пар. Количество копий плазмиды р Т 308 на одну клетку штамма КЗ 1651 составляет около 20.Штамм Е.со 1 КЗ 651 хранится в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиоло.гии им.Н.Ф,Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 10. ные, неспорообразующие, не кислотоустойчивые, оксидазоотрицательные.Культуральные признаки. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный 5 и бродильный, каталазо-положительные.Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блестящие с ровнымикраями, через 24 ч достигают 1,О 1,2 мм в диаметре.Мясо-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, вязкой консистенции, гладкие, круглые, прижатые сровными краями.Кровяной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые с ровными краями. Гемолиз не выявлен.Среда Эванса. Аэробные условиявыращивания. Через 5 ч образуют муть.Через 15 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь сероватого цвета.Мясо-пептонный бульон. Аэробныеусловия выращивания. Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через 24 ч на дне пробирки появляется микробная взвесьсеровато-белогоцвета.1Физиолого-биохимические признаки.Бактерии штамма Е.со 1 КЗ 1651 растутв пределах от 5 до 43. С при оптимуме 37 С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие угле-.35 воды, спирты, органические кислоты.Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаются собразованием пирувата.Бактерии в качестве источника 40 азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме,так и в органической форме в видепептона, аминокислот. Желатину неразжижают. Уреазной активностью не обладают, Индола не.образуют. Устой"чивы к тетрациклину 20 мкг/мл).Непатогенные для лабораторных жи-.вотных,Для количественного определения термолабильного энтеротоксина использовали метод двойной диффузии в агарозном геле. Для этой цели быпи использованы препараты антитокснческой противохолерной сыворотки.Характеристика штамма.Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы, 1,1-1,5 х х 2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальньщи жгутиками, грамотрицательКак известно, аминокислотные последовательности соответствующих субъединиц термолабильного токсина Е.со 1 и Ч 1 Ьгдо сЬо 1 ега во многом гомологичны, а сами субъеднницы имСоставитель А.ИвановаРедактор П.Горькова Техред М.Ходанич Корректор Т.Колб Заказ 2689/3 Тираж 499 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул. Проектная, 4 3 11 мунологически родственны. Поэтому для термолабильного токсина Е.со 11 применяются антихолерная сыворотка.Использование штамма К 3165 для получения термолабильного токсина иллюстрируется следующим примером,П р и м е р. Бактериальные клетки объемом 50 мл выращивают в течение ночи в 0,5 л колбах в среде Эванса, содержащей 27.-ные казаминовые кислоты, 0,6 й-ный дрожжевой экстракт, 0,253-ный ЯаС 1, 0,873-ный КНР 04 и 0,257.-ный раствор глюкозы. Клет- . ки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М трис НС 1 рН 8,6. Клеточную суспензню подвергают озвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе.При двухкратном титровании клеточных лизатов штамма К 81651 положительная реакция в гель диффузии с антитоксической противохолерной сы" вороткой наблюдается в разведении 1:128. В то же время, лизаты клеток 02270штамма Н 74-114, полученные в тех же условиях, в гель-диффузии проявляют активность в разведении 1;16. Учитывая тот факт, что чувствительность этой реакции для энтеротоксина составляет 2 мкг/мл, можно считать, что концентрация термолабильного энтеротоксина в клеточных лизатах штаммов КЯ 651 и Н 74-114 составляет не ме" О нее 10 и 1 мг/л культуры соответственно. Непатогенность и высокая продуктивность полученного штамма делают 15 его Ъерспективным для налаживанияпроизводства энтеротоксина Е.со 1 ь в промышленном масштабе.Энтероток" син может быть использован для получения химических вакцин, антисыворо ток и других диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых патогенными штаммами Е.со 11 и ИЬго сЬо 1 ега.