Вектор рмв 124 для получения фрагментов днк с произвольными липкими концами и способ его конструирования

СОН:)3 СОВЕТСНСОЦИАЛ ИСТИЧРЕСПУБЛИК 446160 19) (11 А 2 М 15/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ЕТЕНИЯ ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВ ЛЬСТВ ДНК с пр Полученн молекуля ЕсоК 1 Ф Бюл. У 47научно-исследовательолекулярной биологиив, О.И.Серпинский,Х.Дегтярев сится к молекуетической инжесобой векторную ения фрагментов(57) Изобретение отнлярной биологии и гемерин ипредставляетДНК РВИ 124 для получ(21) 4149175/2 (22) 17,11,86(46) 23. 12.88. (71) Всесоюзный ский институт (72) А,Н.Синяк Н,К.Данилюк, С и В.Е.Чижиков (53) 575,224.2 (56) Доклады а 1984, т.278, 11 р (54) ВЕКТОР рИВ ФРАГМЕНТОВ ДНК ИИ КОНЦАИИ И С 577.2/048 (088.8)адемии наук СССР.5, с.1250-1253.124 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯС ПРОИЗВОЛЬНЬЙЯ ЛИПКИОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАоизвольными липкими концами, ая рекомбинантйая ДНК имеет рную массу 1,8 МД и содержит - РзС 1 фрагмент ДНК плазмиды р 11 К 222 с геном 6-лактамазы и частью модифицированного гена А -галактозидазы Е.со 1, а также синтетический полнлинкер длиной 42 н.о. Полилинкер включает между попарными сайтами РоЕ 1 и Н 8 а 1 набор сайтов для эндонуклеаз рестрикции Ва 1 16, Асс 1, Ндпй 11, Ваа Н 1 противоположной полярности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонирования субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды рМВ 124 по сайтамРоЕ 1 и Н 8 а 1 с последующим их выщепнением рестриктае раК 1 и Ва. 2 с.к. Я ф-ЛЫ еС:(1 Ч)55 Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных ДНК методами генетической инженерии и мо 5 жет найти применение в биотехнологии при создании штаммов"продуцентов целевых продуктов. Целевую плазмиду получают путем расщепления ДНК плазмиды рН 1 МВ эндонуклеазами рестрикции ВашН 1 и ЕсоК 1, лигирования полученного гидролизата с синтетическими олигонуклеотидами САТСССССТСАТССАС и ААТТСТССАТСАСССС с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т 4 в случае получения рМВ 123. Полученйой смесью трансформируют клетки Е.со 1 ВМН 7118 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фе нотипом Ьас (промежуточная плазмида рМВ 121). Из индивидуальных клонов выделяют ДБК плаэмиды рМВ 121, которую расщепляют эндонуклеаэами рестрикции Рз 1 и Ба 1 С 1 и лигируют с ,ЗО олинонуклеотидами ССАТСАСССС и ТССАССССТСАТССТССА, Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.со 1 и проводят отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипомЬас (промежуточная ппазмида рМВ 123).Расщепляют ДНК плазмиды рМВ 123 эндонуклеазой рестрикции Нпй 111, достраивают "липкие" концы с помощью ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) и 40 лигируют полученный дуплекс. Получен. ной лигазной смесью трансформируют клетки и проводят отбор клонов, ус" тойчивых к ампициллйну, с фенотипом Ьас (плазмида рМВ 124).45П р и м е р 1. Химический синтез олигонуклеотидов проводят твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носителя используют модифицированный силохром. Цель изобретения - создание вектора, позволяющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произвольными ".;ипкими" концами.Поставленная цель достигается конструированием плазмиды рМВ 124, состоящей из ЕсоК 1-Рз 1 фрагмента ДНК плаэмиды рПК 222 и полилинкера: Наращивание олигонуклеотидной цепи проводят от 3 - к 5 - концу с помоlщью динуклеознддифосфатных производных (МеО) Тг Нр(РЬС 1) ИР(РКС 1) . Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографий на МсЬгозогЬ КР 18 сначала в О, 1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 15-40 Е. Затем раствор выделенного тритилолигонуклеотида упаривают досуха, растворяют в 2,5 мл 807-ной водной уксусной кислоте и выдерживают при комнатной температуре 45 мин. Раствор упаривают досуха, растворяют остаток в 1 мл дистиллированной воды н хроматографируют на ЬсЬгозогЬ РК 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 5-207Конструирование целевой рекомбинантной ДНК рМВ 124 состоит из ,цвух этапов. На первом этапе конструируют промежуточные плазмидные ДНК рМВ 122 и рМВ 123.5 мкг ДНК плазмиды рИ 1 МВ гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции ДашН 1 и ЕсоК 1 в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20 мМ трис-НС 1, рН 7,8, 10 мМ М 8 С 1 , 10 мМ 2-меркаптоэтанол) и 100 мМ НаС 1 прио37 С 1 ч. Реакционную смесь после добавления 5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта. Затем к реакционной смеси добавляют ЖаАс до концентрации 0,3 М, рН ,0 и осаждают ДНК двумя объемами этанола, Полученный препарат ДНК вектора рМ 1 МВ растворяют в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС 1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).К 5 мкл раствора вектора рИ 1 МВ добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов (1 П и 1 Ч), 2 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 в 30 мкл буфера 2 (20 мМ144 б 160 5 СССТССАСААСААТСССАААСТСАССАСААТ; (Ч)5 АТСАААААСТТАААТСТСАССАТТСТССТСА; (Ч 1) 5 ССССААСААССССАСАСААСТСАААСАТСА; (Ч 11)т 5 СССАСАТСТСТАААСАСТСААСАТСТТТСА, (Ч 111) трис - НС 1, рН б, 10 мМ МдС 1 , 1 О мМ 2-меркаптоэтанол и 0,5 мМ АТР).Реакционную смесь выдерживают 12 ч при 10 С, затем используют для5 трансформации клеток Е.со 11 ВМН 7118 Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5 Х ЬВ агар, содержащий 75 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/млс Х-Са 1. Чашки инкубируют 12 ч при 37 С. 10 Из колоний, имеющих Ьас фенотип, щелочным методом вьщеляют ДНК плазмиды рМВ 121. Взр 1 и Ро 1 с 1 гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4 Х ПААГ. Клон, имеющий дополнительный 15 РоЕ 1-сайт в плазмидной ДНК, выращивают в 100 мл среды, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 16 ч при 37 С на качалке (200 об/мин). Клетки собирают центрифугированием 20 (6000 об/мин, 10 мин, 4 С), плазмидную ДНК рМВ 121 выделяют щелочным методом с последующей дополнительной очисткой в градиенте плотности СзС 1.5 мкг ДНК плазмиды рМВ расщепляют 25 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Рз 1 в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ ЮаС 1, 1 ч при 37 С. Затем к реакционной смеси добавляют ИаС 1 до концентрации 150 мМ, 2-меркапто этанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Ба 1 С 1, выдерживают 1 ч при 37 С, Реакционную смесь после добавления 6 мкл 04 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и изоамилового спирта. ДНК вектора рМВ 121 осаждают этанолом и растворяют в 50 мл ТЕ-буфера.5 мкл раствора вектора рМВ 121 отбирают для получения плазмиды рМВ 4 О 123. К реакционной смеси добавляют по 20 пкмоль олигонуклеотидов 1 и 11, 2 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 в 30 мкл буфера 2 и выдерживают 12 ч при 10 С. Полученной лигазной смесью трансфор Из полинукиеотидов (1-Ч 111) полу 55 чают дуплексы клонирования.Реакционную смесь, содержащую по 100 пмоль меченного у-Р .АТР полинуклеотида (Ч) и фосфорилированного мируют клетки Е,со 1 ВМН 7118. Из ко лоний (получение см.выше, имеющих Ьасфенотип, вьщеляют плазмидную+ДНК. После рестрикционного анализа с помощью Взр 1 и Ро 11 эндонуклеаз определяют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта.5 мкг ДНК плазмиды рМВ 123 гидролизуют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Нпй 111 в 50 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ ИаС 1, 1 ч при 37 ОС, Затем в реакционную смесь добавляют ЙМТР., до концентрации 100 мкМ и НО до общего объема 100 мкл, прибавляют 1 ед, ДНК-полимераэы 1 (фрагмент Кленова) и выдерживают 30 мин при 20 С. Реакционную смесь разбавляют 5 мкл 0,4 М ЭДТА (рН 8;О) и экстрагируют водным фенолом и изоамиловым спиртом. ДНК осаждают двумя объемами этанола. 0,5 мкг полученной ДНК обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 в 30 мкл буфера 2 в течение 16 ч прио10 С, Реакционную смесь используют для трансформации клеток Е.со 1 ВМН 7118. Суспензию клеток после трансфор - мации высевают на 1,5 Х агар, содержащий 45 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл Х-Са 1. Из колоний, имеющих Ьас фенотип, выделяют плазмидную ДНК щелочным методом. Взр 1 и Взр 1 + Нпй 111 - гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4 Х ПААГ. Первичную структуру в районе встроенного полилинкера определяют по методу Максама-Гилберта.П р и м е р 2, Получение субфрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствуквцую 32-60 аминокислотам человеческого интерлейкина, с произвольно запланированными липкими концами,Описанным способом синтезируют и выделяют следующие нуклеотиды: холодным АТР полинуклеотида (Ч 1) в 100 мкл буфера 3 (60 мМ трис-НС 1, рН 7,5; 10 мМ МяС 1, 10 мМ 2-меркапо тоэтанол) нагревают 10 мин при 50 С, охлаждают до 20 С, добавляют,дЮР до(хп) 5 ССТСТССАСССТТСАСТТССАСТАСААТТАССТТСАТА. концентрации 250 мкГ 1 и 10 ед. ДНК- полимеразы 1 (фрагмент Кленова), Реакционную смесь инкубируют 30 мин при 20"С, добавляют 1 О мкл 0,4 М5 ЭДТА (рН 8,0), экстрагируют водным фенолом. ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содержащим 2% 1.1 С 104, промывают спиртом, сушат на воздухе, осадок растворяют в воде. Полученный дуп О лекс расщепляют 500 ед. эндонуклеазы рестрикции Ба 1 С в 200 мкл буфера 2, содержащего 150 мМ Г 1 аС 1, в течеоние 12 ч при 37 С. Аналогично получают дуплекс из полинуклеотидов (Ч 11 15 и Ч 111), который расщепляют обработкой 200 ед. эндонуклеазы рестрикции Ве 1 11 в 200 мкл буфера 2, содержащего 50 мМ МаС 1, в течение 12 ч прио37 С. Оба рестрикта выделяют с помо щью гель-электрофореза в 8% ПААГ, фРеакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 124 совместным расщеплением 25 эндонуклеазами рестрикции .Вап)Н 1(50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 100 мМ Г 1 аС 1 при 37 С 1 ч) и Ба 1 С 1 40Аналогично примеру 1 из полинуклеотидов (1 Х) и (Х), (Х 1) и (Х 11) получают дуплексы, которые затем расщепляют эндонуклеазами рестрикции ВЕ 111 и Ба 1 С 1 соответственно. Реакционную смесь, содержащую по 2 пмоль приготовленных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции Вап)Н 1 и Ба 1 С 1 (условия 50 см. выше), обрабатывают 2 ед. ДНК-лигазы в описанных условиях. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е.со 1 ВМН 7118. ДНК, вьщеленные из колоний, имеющих 1.ас фенотип, гибридизуют с -" Р-мечеными зондами, полученными из полинуклеотидов (1 Х и Х 11), ДНК, гибридизирующиеся с обоими зондами, дополнительно анализиру 606(условия см, выше) обрабатывают 2 ед,ДНК-лигазы в описанных условиях. Лиглзной смесью трансформируют клеткиг,со 11 ВМН 7118 (или Л 1 103). Из колоний, имеющих 1.асЕ фенотип, гиб 92ридиэирующихся с Р -мечеными зондами, выделяют ДНК и дополнительноанализируют с помощью Вяр 1, ЕсоК 1 иРя 11 гидролиза.Бактерии Е,со 11 ВМН, содержащиеплазмиды р 11, 58 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл 1.Всреды. Для получения целевого субфрагмента, кодирующего часть геначеловеческого интерлейкинас заранее запланированными "липкими" концами, 15 мкг ДНК плазмиды р 1 Ь 58 в15 мкл буфера 1, содержащего 50 мМГ 1 аС 1, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы рестрикции Ро 11 или Няа 1 1 ч при37 С, Целевой фрагмент длиной 83 нуклеотидных пар вьщеляют с помощьюэлектрофореза в б% ПААГ. Структуруполученного фрагмента подтверждаютметодом Максама-Гилберта,Описанным способом синтезируютполинуклеотиды ют с помощью Вяр 1 и ЕсоК 1 + РяС 1 гидролиза.Колонии, имеющие плазмиды р 11. 912 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл 1,В среды. Для получения целевого субфрагмента, кодирую- щего часть гена человеческого 1 Ес произвольными липкими концами, 15 мкг ДНК плазмиды р 11.-912 в 150 мкл буфера. 1, содержащего 50 мМ ИаС 1, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы рестрикции РоК 1 или Н 8 а 1 ч при 37 С.Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар вьщеляют с помощью электрофореза в 6% ПААГ.Таким образом, предлагаемый способ получения субфрагментов ДНК с произвольными липкими" концами, основанный на применении плаэмпдных рМВ 124,14461 бО Нца 1 в полилинкере и при использовании для клонирования сайтов для рестриктаз Ба 1 С 1, Асс 1, Нпд П и ВашН 1появляется возможность получать уникальные "липкие" юнцы, определяемыеструктурой самого произвольно выбранного фрагмента ДНК, клонируемого поуказанным сайтам. Это может позволить 10 использовать такие фрагменты в генетической инженерии для одновременнойи направленной сборки несколькихФрагментов ДНК в системе Ы чдСго,Кроме того, уникальные "липкие" кон цы Фрагментов могут позволитьих раздельное мечение прн помощи Р, что3необходимо для определения первичныхструктур ДНК и для ряда других биохимических задач.207Формула изобретения 25 30 ССАТСАССССТССАСААОСТАССТТССАТСССССТСАТССАСАССССТАСТССССАССТСТТССАТССААССТАСССССАСТАССТСТТАА,щиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Ро 11;вставку субфрагмента для клонирования по Яа 1 С 1 и ВашН 1-сайтам полилинкерной области;емкость не менее 622 п.о.;штаммы-хозяева: штаммы Е,со 1 сЬасЕ М 15 фенотипом.2. Способ конструирования вектора рМВ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольными липкими концами, заключающийся в том, что плазмидную ДНК рГ 1 В 123 дополнительно расщепляют эндонуклеазой рестрикции Нпй 111, достраивают липкие концы с помощью ДНК полимеразы 1 - фрагмент Кленова и циклизуют ДНК-лигазой Фага Т 4. ВНИИПИ Заказ 6086 38 Тираж 528 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 имеет существенные преимущества, Прежде всего, конструкция плазмидной ДНКрМВ 124, содержащей между попарньмисайтами эндонуклеаз рестрикции Ро 11и Няа 1 противоположной ориентации,набор сайтов для рестриктаз Яа 1 С 1,Асс 1, Ндпд 11, Нпд 111, ВатН 1 даетвозможность в отличие от известногоклонировать фрагмент из несколькихсубфрагментов и, таким образом, получать протяженные химически синтезированные ДНК фрагментыВ примере 2фрагменты клонированы из двух субФрагментов, что позволяет в несколькораз уменьшить объем биохимической игенно-инженерной работы при получениицелевой последовательности ДНК. Несомненным преимуществом является использование при получении произвольных "липких" концов целевых фрагментов ДНК коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции РОКЕ и Няа 1,В некоторых случаях возможно ограничиться использованием только однойрестриктазы Ро 1 с 1, что значительноудешевляет сПособ получения фрагментов ДНК,Благодаря наличию сайтов узнаваниядля эндонуклеаз рестрикции РоИ и с попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции РоЫ и Няа 1 противоположной полярности сайты для эндонуклеаз рестрикции Ба 1 С 1, Асс 1, Нхпй 11 и ВавН 1;фрагменты размером 11, 88, 180, 174, 268 область полилинкера, 260, 298, 434, 450, 580 п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Взр 1;Фрагменты размером 26, 34, 60, 118, 140, 288, 242, 484, 424 область полилинкера, 489, 588, п.о., образующиеся после расщепления эндонуклеазной рестрикции Мвр 1;фрагменты размером 8, 88, 181, 244, 280, 614, 1254 п,о., обраэую 40 45 50 55 1. Вектор рМВ 124 для получения фрагментов ДНК с произвольнымй липкими концами с мол. массой 1,8 ИД, содержащий ЕсоК 1-Рзс 1 фрагмент ДНК плазмиды рУН 222 с геном в-лактомазы и частью модифицированного гена р-галактозидазы Е.со 1 д, синтетический полилинкер размером 42 п.о., имеющий структуру