Способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты

(о) М. КлЗаявлено 03,06,7 501/2 5,71 Геаударетееааик кеиктетВезете Макаетреа ССее делам аэоеретенкка еткрюпй) Опубликовано 25.04,76, Бюллетень15Ь) Дата опубликования описания 13.12.77 Иностранцы ке Абе, Тецуе Затаив% Цу и Тадасиро Фудзи(72) Авторы изобретения му Ямагути, Куние Мацум фирмаивтти Дтд" ия) ИностраннаятыьЪзе К 71) Заявитель ДЕВ АЦВТ 54) СПОСОБ ПОПУ% тиламинодезацетоксицефалобщей формулы лоты,рано Известен химическ аминодезацетоксицефал становлением цефалос ладироваииого угля с иием обре 13 утвщейся 3 намикь цефем. 4 иалевого тадукта до нос зщцутозОдмМ - атом щелочного металла,обрабатывают энзнмным препаратом штамма Вас0 в ведвтег аа В.400 РЕМ-Р матф 748, продуцирующегоэнзим - амнногидролазу ацетамнда, энзим сор.бнруют на носителе, не инакптвнрующемэтот энзим, добавляют к этому носителю водныйраствор 7 . амин дезацетоксицефапоспорвновойкислоты и нз реакционной массы выделщот целевой20 продукт. Энзнм, способный разлагать амццнуюсвязь, получают аэробным выращирчнием Вас 1 цзг"едатегит В 400 ГЕМ-Р 9748 при 25.37 С втечение 12 - 60 час в питательной среде, содержащейсоответствующие количества источников азота, ис.тоников углерода и неорганкческне соли. В качест. авляет собой зн.зацвтоксицеф ало. вьпгода7. аце. 2 Ь 23) Приоритет 14,03.72 (3" Предлагается новый способ получения 7 аминдезаце оксещефалоспорановой кислоты. (7-ЛДСК) .обладающей биологической активностью. ий способ юлучеиия 7 .оспораиовой кислоты воспорииа С в присутствии пвл.деацилирова.маоадипоиислоты, вькод Претригаемый способзиьаое получение 7 аминеижаиовой киавты формулЮ и отличается тем, что, с целые увели таелевогопродукта, водорастворимую ЕФАДОСПОРЛНОВОЙ КИСЛОТУ де В - бензнльная нлн феноксиметнльная груп.ве носителя используют целит, силикагель, активированный уголь, его количество при периодическом способе работы составляет предлочтительно 5 15 вес.% от количества фильрата культуры, Энзим иую реакцию проводят, как правило, на колонке, количество непрореагировавшей 7 . ациламинодез. ацетоксицефалоспорановой кислоты в выходящей реакционной жидкости составляет обычно 0,5-1,Овес,%. Целевой продукт выделяют известньв способом с выходом до 89%.Пример 1.А. 20 л жидкой культуралъной среды (рН 7,0), содержащей % полипептона, 1% дрожжевого эк. стракта и 0,5% июристого натрия, загружаютв чашечный ферментатор на 30 л и стерилизуют в течение 20 мни паром при 120 С. Затем в сте. рильных условиях переносят в эту культуральную среду 200 мл затравочной культуры Вас 111 ца ееЯатег 1 ит В.400 ГЕРМ Р У 45, которую выращивают при 30 С в течение 24 час в культуральной среде указанного состава и фермеитируют при 30 С в течение 48 час с азрацией и перемешиванием при рвахода воздуха 20 л/мин (скорость мешалки 300 об/мин). По окончании ферментацяи клетки удаляют с помощьв центрифуги. сепаратора Вестфа. лия и получают 17,4 л фильтрата культуры.Б. фильтрвт культуры упаривавт до 1/3 обьема при наруяаой температуре 30 35 С и в концентрат добавляют сульфат аммония до достижения 80% яасьццения. Вьиавшяй осадок растворяют в дистнл. лированной воде и обессолнввот на колонке с сефадексом С, Обессолеиный раствор вымори исивавт и получаот 24,3 г стандартна о энзимного проду кт а.В. рН 1 О л полученного фильрата культуры Ва с 111 щ ведатег 1 цв В.400 РЕРМ.Р Нф 748 доводят до 7 с помощью уксусной кислоты. К фильтрату культуры добавляют 500 г диатомитовой земли и полученную смесь перемешивают в течение 30 мии.В течение этого времени постоянно поддерживают рН 7, Затем реакционную жидкость центрифугиру вт на центрифуге корэинчатого ища, затем промывают водой.П р и м е р 2. рН фильтрата культуры Вас 111 ив 1 О ве 1 эатвг 1 це В.400 ГЕРМ.Р Яф 748, полученной в 45пример 1 Б, доводят до значения 7. К каждомулитру фильтрата отдельно, добавляют по с 50 г цалнта "(Гнфло Супер Цел)", активированного угля (фирмы "Вако ДжюнякиКо", для хроматографии), СМ-целлюлозного ионообменника (фир.мы ",Серва Ко", 0,5 мкг/г) н амберлита СС(форма Н), полученные смеси перемешивают в течение 30 мнн. В это время рН попдержнвввт около 7, затем каждый носитель выделяют фильт.55ровзнием, промывают водой и получают влажный носитель. Рассчитывают степень энзимной адсорбцни для каждого носителя, принимая за 100% ную адсорбцию энзима степень адсорбции целмтом, при этом получают результаты, приведенные в табл. 1. Таблица 1 Носитель Относительнаястепень адсорбции,% Белит Активнрованный уголь СМ целлюлозаАмбе лит СС.50 10081,2 П р н м е р 3, Белит с сорбированным диацилнрующим знзимом (энзнмный титр 1800 ед/г), полу ченный в примере 2, промывают буферным раствором 0,01 М фосфата (рН 7,5), набивают в колонку, снабженную рубашкой (5 х 50 см)т и промывают в течение 1 час при определенной скорости этим же буферным раствором.Наружную температуру колонки поддерживают около 37 С. Затем через колонку пропускают 6 л(5 мг/мл свободной кислоты) водного раствора натрий 7 . фенилацетамидодеэацетоксицефалоспо. раната при определенной скорости, вытекающую жидкость фракционнр уют на отдельные фракции (количество каждой фракции 10,8 мл).рН 6,4 л элюата доводят до 6 и упаривают до 1/10 объема, Концентрат доводят до рН 3,7 с помощью 6 й н. соляной кислоты,при этом образующаяся 7-АДСК начинает выпадать в осадок. Для завершения осмкдетаи концентрат охтаждают льдом, осадок отфильтровывают, промывают не. большим количеством ледяной воды, хорошо про. мывают ацетоном и после сушки получают 14,00 г белой 7 АПСК, т,пл, 240.242 С, выход 72,4%. Этот продукт растворяют в водном растворе едкого патра (2,5), раствор обесцвечивают активнрованным углем, доводят рН до 3,7 с помощью бйн, соляной кислоты и охлаждают льдом для ооокдеиа 7-АДСК. Затем 7-АДСК отфильтровывают, про мывают небольцпеч количеством ледяной воды, промывают ацетоном и сушат, при этом получают11,4 г очищенного продуктаП р и м е р 4, Повторяют:пример 3, но вместо целита с ссрбированным деацилирующим знзимом для получении 7 АДСК используют активированный уголь с сорбированным энэимом, СМ.целлюаду с сорбированным знзимом и амберлнт ССс сарбированньм энзимом. Получают результаты. прнведеннь 1 е в табл. 2.Носитель Выход,% Активированный угольСМ- целлюлозаАмберлит СС58,2 51,8 48,5 37,5 32,9 31,3 СООНчто, с целью увеличенияа, водорастворимую сольефзлоспорвновой кисло. отличающийся тем, выхода целевого продукт 7 вцилзминодеэвцетоксиц ты общей формулыЧСО- ЙН ООМкснметильная групгде 11. баз щелочного металлт контакту сепые Вгим . вмнногидый фильтрат адс М. агомподвергаюВас 1 Поз пмярующего энэчем укаэанн фнльтратом ппвммв ЕРМ. Р Яе 748, продуци. ролззу вцетзмидв, прнорбировзн нв носителе. ставитель А фрегерхред М. Левицкая О, Кузнец Корректор И. Гок каз 753/1333 Тираж 576ударственного ко митепо делам изобрете035, Москва, Ж-Э 5,Подписноета Совета Министров СССРниз и открытийРаушская наб., д 4/5 иал ППП "Патент, г, Ужгород, ул, Прое П р и м е р 5. Для получения культурыпроводят вырзщивзние, как в нрнмере 1. 1 л этойкультуры переносят в резервуар для выращиваниякультуры на 250 л, в котором находится 200 лсреды такого же состава в прнмере 1, и ведутвыращивание при 30 С в течение 48 час, Для получения 350 л культуры (фильтрата) используют 2резервуара на 250 л. К фнльтрату культуры добавляют 3,5 кг целита и смесь перемешивают 30 мин,поддерживая рН среды 7. Затем смесь дегндрвтируют на центрифуге, остаток промывают водой иполучают 5,2 кг влажного целитв (энзнмный ппр5000 ед/г). Этот целит помещают в поливинилхло.ридную колонку размером 120 х 900 мм и через неепропускзют раствор (5 мг/мл) 7.фенилацетамидо.дезацетоксицефзлоспорановой кислоты в фосфат.ном буферном растворе 0,05 М рН 7,5), поддерживая температуру 37 С, Элюировзнне заканчивают в те.челне 72 чвс, и получают всего 375 л элюата. К этомуэлювту добавлюот 290 л ацетона, рН полученной смесидоводят до 4,0 бн. соляной кислотой, перемешивают втечение 30 мин и оставляют нв ночь для выпадения осад. ЭОка. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном исушат, получают 1130,2 г кристаллов 7- АДСА (чисто.та 90,0%), выход 89,2%,Формула изобретения Способ получения 7 . амннодеззцетоксицефзл-оспорановой кислоты общей формулы