Способ получения (-) (цис-1, 2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты(фосфономицина)

(22) Заявлено 25.10,68 (21) 1281148/31-1 32) ПриоритетЗЗ) США Государстоенный комитет оеета 1 йинистрое СССР Опубликовано 15.10,7Дата опубликования(088,8) Бюллетень38 по делам нзабретений и открыт сания 11.11.7(72) Авторы изобретения Иност Хендлин и Эдвард нес Мата и Сагра Иностранн Мерк энданцыОлли Стейпио Мокалес Дэви то Мар(71) Заявите ая фирма Ко, ИНК ША)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ( - ) (ЦИС,2-ЭПОКСИПРОПИ ФОСФОНОВОИ КИСЛОТЫ (ФОСФОНОМИЦИНА) изводству анцис- фостуре 5 ьтуили р 1 оных уг при де- прилени емамПр собо кисл Н О1 ОН Н С - С - С ее точно сипропил)- 25 с употребнклатурой; это фосфоИзобретение относится к протибиотиков,Предложенный способ получения ( в ) ( 1,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты ( фономицина), ранее в патентной литера не описанный, заключается в том, что кул ру - продуцент вида Ягер 1 отпусез 1 гайае Ягер 1 огпусез игЫосйготподепез или Юге тпусез жейпогепз 1 з выращивают в аэроб условиях на среде, содержащей источники лерода, азота и минеральные соли 25 - 38 С и рН 5,5 - 7,5 с последующим вем целевого продукта известными едлагаемый антибиотик, представляет1-цис,2-эпокси-пропилфосфоновую ту формулы Это кислое вещество, которое бо можно назвать ( - ) (цис,2-эпок фосфоновая кислота в соответствии ляемой в настоящее время номе ( - ) указывает, как и буква 1, что новая кислота вращает поляризованный свет в направлении против часовой стрелки (влево по отношению к наблюдателю) при измерении ее двунатриевой соли в воде (концентрация 5%) при 405 ммк.Свободная кислота в кристаллической форме представляет собой белый кристаллический порошок с т, пл. выше 94 С при помещении в баню с такой или более высокой температурой.( - ) (цис - 1,2 - эпоксипропил) -фосфоновая кислота и ее соли являются ценными противомикробными агентами, ингибирующими рост как грам-положительных, так и грам-отрицательных патогенных бактерий. Этот антибиотик и особенно его соли являются активными против Вас 111 цз, Езс 1 тег 1 с 1 на, Яарйу 1 ососс 1, Ба 1- гпопе 11 а и Рго 1 ецз патогенов и их устойчивых к антибиотикам штаммов.( - ) (цис - 1,2 - эпоксипропил) -фосфоновая кислота и ее соли могут применяться как антисептические препараты для удаления вредных микроорганизмов с фармацевтического, зубоврачебного и медицинского оборудования и других предметов, зараженных этими микробами. Они могут применяться и для выделения некоторых микроорганизмов из смесей микроорганизмов. Соли ( - ) (цис,245 50 55 60 65 эпоксипропил) -фосфоновой кислоты могут также применяться для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, у людей и животных, Они являются особенно ценными в этом отношении, так как они активны против патогенных стойких штаммов. Эти соли особенно ценные и потому, что их можно вводить через рот, но они могут быть введены и инъекциями.П р и м е р 1. Лиофилизированную культуру Яг 1 ер 1 отусез 1 гас 11 ае МА(АТСС .21096) используют для инокулирования 50 мл стерилизованной среды следующего состава, г/л:Дрожжевой экстракт 10 Глюкоза 10 Мазо,.Н,О 0,5 Фосфатный буфер ф 2 мл Дистиллированная вода ОстальноеИнокулированную колбу помещают на роторную качалку при 220 об/мин и инкубируют 48 ч при 28 С. Из полученной культуральной жидкости берут 10 мл инокулума для инокулирования колбы Эрленмейера на 2 л, содержащей 500 мл стерилизованной среды такого же состава, как выше. Инокулированную колбу вновь помещают на качалку при 220 об/мин и инкубируют 48 ч при 28 С. Полученную культуральную жидкость используют для инокулирования ферментатора на 189,25 л из нержавеющей стали, содержащего 160 л, стерилизованной среды вышеуказанного состава. Инокулированную среду инкубируют при 28 С при перемешивании и подаче тока воздуха 0,8496 м/мин. Во время ферментации добавляют небольшое количество полигликоля с молекулярным весом 2000 для борьбы со вспениванием. Затем используют 25 л полученного ферментационного бульона для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали на 200 галл, содержащего 510 л стерильной среды следующего состава, г/л:Молотый овес 20 Барда 10 Соевая мука 20 Цитрат натрия 2,0 Аскорбинат натрия 0,5 Дистиллированная вода Остальное.До стерилизации рН ферментационной среды 6,5. Инокулированную среду инкубируют при перемешивании при 28 С с пропусканием воздуха 0,28317 м/мин в течение 3 дней. Во время ферментации добавляют небольшое количество противовспенивающего вещества полигликоля с молекулярным весом 2000. Затем культуральную жидкость фильтруют через диатомную землю. 100 галлонов отфильтрованной культуральной жидкости с рН 7 пропускают через колонку, содержащую сильноосновную анионнообменную смолу типа четвертичного аммония на стирол-дивинилбенф 91 г КНР 04 и 95 г 1 ЧаНР 04 доводят до 1 лдистиллированной водой. 5 10 5 20 25 30 35 40 зольной матрице (Дауекс 1 К 2). Смолу элюируют 3%-ным раствором хлористого аммония в 90%-ном метаноле, элюаты собирают фракциями по 2 галлона. Фракции 4, 5 и 6 содержат большее количество антибиотика. Фракции 4 и 5 раздельно упаривают при пониженном давлении для удаления метанола до концентрации около 200 мг/мл твердых веществ. Затем 275 мл концентрата фракции 5, содержащего 51 г твердых веществ, пропускают через 8,9 л специального полиакрилоамидного геля, давая разделиться, обессолиться и сконцентрироваться веществам с молекулярным весом от 200 до 2000. Сорбированное на геле вещество элюируют со скоростью 50 мл/мин водой при проверке элюата рефрактометром. Элюат выделяют фракциями, анализируют и соединяют активные фракции, в которых между 5600 и 6320 мл содержится 19,1 мг/мл твердых веществ с активностью 68 ед/мл по Рго 1 епз и 1 даг 1 з на дисках и пластине. Это представляет ( - ) (цис,2-эпоксипропил) -фосфоновую кислоту с активностью 3,6 ед/мг.Аналогично получают четыре дополнительные хроматограммы с использованием порций по 275 и 287 мл концентрата фракции 5 и двух порций по 285 мл концентрата фракции 4. Активные фракции из всех пяти хроматограмм соединяют и упаривают при пониженном давлении до 100 мг/мл, 660 мл полученного концентрата имеет активность 4,1 ед/мг.100 мл этого концентрата пропускают через колонку, содержащую 2480 мл сильно кислой катионообменной смолы сульфонатного типа со стирол-дивинилбензольной матрицей в водородном цикле. Сорбированное вещество отмывают водой при расходе 19 мл/мин, Собирают фракции по 20,5 мл элюата, который проверяют записывающим рефрактометром. Фракции 52 - 62 анализируют и соединяют для получения водного раствора антибиотика. Аналогично еще 5 порций по 100 мл концентрата хроматографируют на сильно кислой смоле, Наиболее активные фракции полученного элюата соединяют с фракциями 52 - 62 и получают всего 1870 мл. Этот водный раствор ( в ) (цис,2-эпоксипропил)-фосфоновой кислоты имеет рН 6,8, общее содержание твердых веществ 2,9 мг/мл, активность 70 ед/мл.Таким образом, активность натриевой соли антибиотика в этом водном растворе составляет 24 ед/мг.Водный раствор затем упаривают при пониженном давлении и сушат вымораживанием с получением 4,7 г продукта. П р и м е р 2. Лиофилизованную культуру Ягер 1 огпусез вгЫос 11 гоп 1 одепез МА(ЧЯ 1 Ц.-,3413) используют для инокулирования 50 мл среды следующего состава, г/л:Дрожжевой экстракт 10 Глюкоза 10 Мд 504 НиО 0,05446977 Составитель С. Щенева Техред Г. Дворина Редактор Л, Тюрина Корректор Л Котова Заказ 2423/8 Изд.1371 Тираж 456 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 5фосфатный буффер ": 2 мл Дистиллированная вода Остальное. Инокулированную среду в колбе Эрленмейера на 250 мл инкубируют при 28 С в течение 3 дней на роторной качалке, Колбу с посевом первой генерации используют для инокуляции серии таких же колб. Посев второй генерации используют для инокуляции (с помощью 2,5%-ного инокулума) серии из 10 колб Эрленмейера на 2 л, содержащих по 350 мл среды следующего состава, г/л:К 2 НРО, 0,7 КНР 04 0,3 Цитрат натрия 2 Н 20 0,5 МФ 04 7 Н 20 0,1 Казаминовая кислота 2,0 Декстроза (стерилизованнаяотдельно) 10Дистиллированная вода До требуемогообъема, Инокулированные колбы инкубируют при 28 С в течение 5 дней на роторной качалке при 145 об/минПолученные в колбах культуральные жидкости соединяют, фильтруют и анализируют. Дальнейшую обработку ведут известным способом,П р и м е р 3. Лиофилизированную культуру Ягерогпусез ъ"ейпогепз 1 з МА(МКК 1.-3426) используют для инокулирования 50 мл стерильной среды из примера 2 в колбе на 250 мл, Инкулируют 3 дня при 28 С на роторной качалке при 220 об/мин, Полученный инокулум используют для инокулирования колб Эрленмейера на 250 мл, соф 91 г КН 2 Р 04 и 95 г Ха 2 НР 04 доводят до 1 лдистиллированной водой. держащих по 50 мл стерильной казеин-мясной среды следующего состава, г/л:Гидролизат казеина(К - Х-амин) 2,5Мясной экстракт 1,0 ХаС 1 5 Соевая мука 10 Барда 2 Кукурузная вымочка 5 Декстроза 20 К 2 НР 04 2 СаСОз" 10 Дистиллированнаявода До т ебуемог р о 15 объема,Инокулированные колбы выращивают 4дня при 28 С на роторной качалке при 220 об/мин, Полученную культуральную жидкость центрифугируют. Зона ингибирования 20 25 мм на бумажных дисках 7 мм по методике анализа по Рго 1 ецз цдаг 1 з МВ.Дальнейшую обработку ведут известными способами. Предмет изобретенияСпособ получения ( - ) (цис,2-эпоксипропил) -фосфоновой кислоты (фосфономицина), отличающийся тем, что культуру - продуцент вида Ягер 1 оп 1 усез 1 гайае 30 или Ягер 1 огп усев чгЫос 11 гогподепез, илиЯгер 1 огпусез ъедгпогепз 1 з выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при 25 - 38 С и рН 55 - 75 с последую щим выделением целевого продукта известными приемами. ф Добавляют после доведения рН до 7.