Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов gtcgac

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 6 ТССАС(57) Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве штамма продуцета В 1)гоЬип) тг 0 о 1 ВНИИСХМ В, содержащего только одну рестриктазу, и использование для очйстки фермента комбинации методов из фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе 7%-ный полиэтиленгликоль - .2 О-ный декстран в присутствии 0,7 М МаС и хроматографий на фосфоцеллюлозе Ри гепарин-сефарозе с элюцией раствором йаС в концентрации 0,5-0,7 М, что позволяет в 6 - 8 раз повысить выход целевого фермента и тем самым снизить себестоимость продукции,(21) 4772065/13(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и ЦентральныйСибирский ботанический садСО АН СССР(56) ВоЬегсз В 3. Везтг 1 стоп емовез апбйегзозЬзогпегз, - Нос. Асдз Вез., 1987,ч. 15, р. 189 - 217.Аггапс 1,1,В., Муегзпечч геигст 1 оп епЯтгерто)т)усез а 1 Ьоз 6 2ч. 118, р. 127 - 135,Махае 11 А.апб На 1гемгссоп епбопос 1 еазч. 203, р, 77-84,Авторское свидетельство СССРйг 767197, кл, С 12 й 9/00, 1978,Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последова тел ь н ость нуклеотидов 6 ТС 6 А С.Известен ряд способов получения рестриктаз, узнающих и расщепляющих в ДНК последовательность нуклеотидов 6 ТС 6 АС, но большинство из них имеют небольшие выходы фермента ввиду низкой продуктивности штаммов микроорганизмов и трудоемкие процессы очистки ферментов,и расщеплять последовательнотидов 6 ТС 6 АС,Недостатком способаемкость, так как он включатографии (Био-гельДЕАЕ-целлюлоза ДЕ,фароза и фосфоцеллюлозадержит две рекстриктазы;что затрудняет процесс очимента не указан.Известен способ полазы рестрикции Яа 61 пухроматографий (фосфоДЕАЕ-сефадекс А, ггидроксилапатит). нукле является трудоет четыре хромаА,5 и),аминопентил-се- Р), Штамм соЯа 1 6 и Яа 611, стки. Выход ферндонуклее четырех за Р,гароза и учения этем такжцеллюлепарин-а Известен споазы рестрикции 5 б получения эндонукле, способной узнавать ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ 1752769 А 1Недостатками способа являются сложность процесса оцистки, содержание вштамме двух рестриктаз Ба 61 и Яа 1 611.Выход Фермента по активности на конечном этапе составляет 0,8от исходного.Получаемый препарат рестриктазы За 61нестабилен при хранении,Наиболее близким по техницеской сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ полученияэндонуклеазы рестрикции За 1 61, способнойузнавать и расщеплять последовательностьнуклеотидов 6 ТС 6 АС, Способ вклюцаеткультивирование Я 1 герювусез а 1 Ьцз 6 насреде Гаузе в течение 3 сут, сбор биомассыцентрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком, центрифугирование ихроматографии на колонках с Био-гелем А 0,5 т и гепарин-сефарозой с последующимдидлизом,Недостатками способа являются использование в качестве штамма- продуцента Я,а 1 Ьаз, содержащего две рестриктазыЯа 6 и За 1 61, длительное культивирование, низкий выход целевого продукта(5000 -6400 ед.акт,/г биомассы) и небольшаяконцентрация последнего (2000 ед,акт./мл),Целью изобретения является повыше. ние выхода целевого фермента, узнающегои расщепляющего последовательность нуклеотидов 6 ТС 6 АС.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу в качестве штамма-про дуцента эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплятьпоследовательность нуклеотидов 6 ТС 6 АС,используют штамм РЬгоЬца тгНо 1, продуцирующий только одну рестриктазу В 1 г 1 вповышенном количестве, в совокупности сметодом очистки фермента путем фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран вприсутствии 0,7 моль/л ИаС 1 с последующими хроматографиями на Фосфоцеллюлозе Р 11 и гепарин-сефарозе.Используемый штамм ЙЫгоЬов тгНодепонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии подномером В.Наличие в штамме только одной рестриктазы с большим ее содержанием на 1г клеток позволило применить для очисткифермента простой способ, сочетающий такие хорошо себя зарекомендовавшие стадии для очистки рестриктаз, какфракционирование клетоцного экстракта всистеме полиэтиленгликоль - декстран и двехроматографии на фосфоцеллюлозе Ригепарин-сефарозе,В результате использования предлагаемого способа удается получить 40000 ед.акт, фермента из 1 г влажных клеток (около 12 .исходного содержания фермента в грубом 5 экстракте), что в 6 - 8 раз больше, чем в известном способе, Полученная рестриктаза характеризуется следующими свойствами;узнает и гидролизует последовательностьнуклеотидов 6 ТС 6 АС, оптимальное значе 10 ние рН для действия рестриктазы 8,0; оптимальная температура 37 С; для проявленияактивности рестриктазы требуются ионыМц (оптимальная концентрация Мц 1015 мМ); оптимальная концентрация йаС в15 реакционной смеси 100-120 мМ.Полученный ферментный препарат свободен от значительных количеств неспеци-фицеских нуклеаз и фосфатаз, Приинкубации 200 ед,акт. фермента с 1 мкг ДНК20 фага в течение 2 ч при 37 С наблюдаетсястандартный набор фрагментов ДНК, Фрагменты ДК, полученные при инкубации 10ед.акт, фермента с 1 мкг ДНК фага в течение2 ч при 37 С, сшиваются ДНК-лигазой и по 25 вторно гидролиэуются рестриктазой Всг 1, .Определяющими отличиями предлагаемого способа являются использование в качестве штамма-продуцента ЯЬгоЬ 1 иатгЮо 11, содержащего только одну рестрикта 30 зу, и использование для очистки ферментакомбинации методов из фракционированияклеточных компонентов в двухфазной сис.теме полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,7 моль/л йаС 1 и хроматографий на35 Фосфоцеллюлозе Ри гепарин-сефарозе,что позволяет. в 6 - 8 раз повысить выходцелевого фермента по сравнению с известным способом, дает возможность получатьболее концентрированный ферментный40 препарат (50000-80000 вместо 2000ед,акт./мл в известном способе),П р и м е р 1, Культивирование штаммаВЬхоЬОгп тгНо 1,Культуру Влг 0 о 1 выращивают на пита 45 тельном бульоне следующего состава, г/лводы: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; хлористый натрий 5;.глюкоза 10. Для получения;. - :,инокулята суточную культуру с плотной сре. ды засевают петлей в две колбы с 50 мл50 питательного бульона в каждой, Выращивают в течение 24 ч на термостатированнойкачалке при.28-30 С со скоростью 200 - 250об/мин. Затем полученным таким образоминокулятом засевают девять колб с 250 мл55 питательного бульона в каждой и выращивают культуру в тех же условиях (24 ч при28 - 30 С и 200 - 250 об/мин), Сбор биомассыпроводят центрифугированием в течение 20мин при 5000 об/мин. Конечный выход биомассы 6,0-6,5 ч/л.1752769 Составитель Л,Юшкова Техред М.Моргентал Корректор О.Юрковецкая Редактор В.Летраш Заказ 2734 . Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 П р и м е р 2. Очистка фермента, 2 г клеток суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 0,1 М трис-НО, рН 8,0, 0,1 М йаС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1%-ный тритон Хи лизоцим 0,1 мг/мл до гомогенного состояния. Смесь инкубируют 30 мин при 0 С в ледяной бане и затем обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДНтри раза по 20 с с перерывами по 40 с для охлаждения,К суспензии добавляют 10 мл раствора, содержащего 11,2%-ный полиэтиленгликоль ПЭГ, 3,2%-ный декстран Ти 1,05 М МаС 1 (конечные концентрации ингредиентов в суспенэионной смеси: полиэтиленгликоль 7%, декстран 2% и йаС 0,7.М).Смесь тщательно перемешивают, выдерживают 20 мин при 0 С и затем центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин, Супернатант (13,5 мл) собирают и диализуют 3 ч против 400 мл буфера А, содержащего 20 мМ калийфосфат, рН 7,4, 0,1 М НаС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1%-ный тритон Х, Отдиализованный раствор наносят на колонку (8 мл) с фосфоцеллюлозой Р, Колонку промывают 16 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом МаС от 0,1 до 1,0 М в буфере А, Рестриктаза йтгобычно элюируется с колонкйпри концентрации йаС 0,5-0,65 М. Фракции, содержащие активность рестриктазы, объединяют (12 - 15мл) и диализуют 3 ч.против 400 мл буфера А.Отдиализованный раствор наносят на колонку (2 мл) с гепарин-сефарозой. Колонку промывают 5 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом йаС от 0,1 до : 1,0 М в буфере А, Рестриктаза Всг 1 обычно элюируется с колонки при концентраций чаС 0,5 - 0,7 М. Фракции, содержащие рестриктазную активность, объединяют (3-5 мл) и диализуют против 100 мл буфера Б,содержащего 10 мМ трис-НО, рН 7,4, 50 мМН С 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТАи 50-ный глицерин в течение 16 ч.5 Полученный ферментный препарат хранят при -20 С в течение 6 - 12 мес.Выход рестриктазы Втг 1 из 2 г клеток80000 + 20000 ед.акт. с концентрацией80000 + 20000 ед,акт./мл,10 Использование предлагаемого способапо сравнению с известным позволяет повысить в 6-8 раз выход целевого фермента;сократить в 3 раза время культивирования;повысить в 30-50 раз концентрацию фер 15 мента в конечном препарате. Формула изобретенияСпособ получения рестриктазы; спо 20 собной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов ОТСОАС,предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма в жидкой питательной среде. сбор биомассы25 центрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком и хроматографическуюочисткуфермента, отличающийся тем,что, с целью повышения выхода целевогопродукта, в качестве продуцирующего мик 30 роорганизма используют штамм ВЫгоЫоаг 0 о ВНИИСХМ В, перед очисткойполученный клеточный дезинтеграт фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-ный полиэтиленгликоль и 2-ный35 декстран, в присутствии 0.7 М йаС 1, а хро. матографическую очистку ведут последовательно на фосфоцеллюлозе Ригепарин-сефарозе с элюцей раствором чаСв концентрации 0,5 - 0,7 М,40