Способ очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 7527 51)5 С 12 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКР ЫТИ ИЗОБРТЕЛЬСТВУ"3 ЕЙИЯ АВТОРСКОМ и биологии им вание: в фермент ущн ость нировани качестве репарат о анали.М. Очисттоэоля кут.41, М 6,и др, Улу -трансам сердец ента. - Б 1484. 0,0005 0,0005 люминииальцийремнийМагнийЖелезообальтНикель 0,0005 0,0005 0,00001 0,00001 0,00001 0,00002евай Мышьяк, олово, свинец,сурьма Отсутствиеспектральных линийНа фиг. 1 приведены данные гельэлектрофореза; на фиг. 2 - диаграмма.П р и м е р, Сердца измельчают на мясорубке, заливают 1,5 об. холодной дистиллированной воды, содержащей 1 мМ ЭДТА, и оставляют для экстракции на ночь при 40 С. После экстоакции фарш отделяют центрифугированием (2500 об/мин, 20 мин), К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 405 насыщения (степень насы 00 ОПИСАНИ(56) Кочкина В.М., Торчинский Юка аспартат-трансаминазы из цириных сердец, - Биохимия, 1976с,812 - 818,Кочкина В,МАзарян А.В,шенный метод очистки эспартатназы из цитоэоля куриныххарактеристика препаратов фермохимия, 1978, т, 43, М 8, с, 1478 -Изобретение относится к медицине, в частности к прикладной биохимии.Известен способ очистки аспартаттрансаминазы иэ цитозоля куриных сердец путем фракционирования сульфатом аммония и этанолом с последующей кристаллизацией.Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта, так как на стадии фракционирования сульфатом аммония примеси ионов металлов приводят к частичной инактивации фермента, в результате которой имеет место недостаточно полный выход получаемого белка.Целью изобретения является повышение вйхода целевого продукта при сохранении наивысшей для данного белка удельной активации.Поставленная цель достигается тем, что содержание ионов металлов в препарате сульфата аммония, используемого для фракционирования,составляет,мас,0, не более:(57) Испольэовыделенияокислению. Сдии фракциогомогената впользуют испектральногил 1 табл. ЧИСТКИ АСПАРТАТ-ТРАНСЦИТОЗОЛЯ КУРИНЫХ СЕРприкладной биохимии ов, чувствительных кизобретения: на стая сульфатом аммониясульфата аммония исквалификации "для эа" ТУ 6-09-4087-75, 2щения указана для 25 С), через 30-40 мин образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (300 об/мин, 30 мин). К супернатанту добавляют пиридоксаль-фосфат (10 мкг/мл) и сульфат аммония (до 70 ф, насыщения), После добавления сульфата амо мония раствор оставляют на ночь при 4 С. Выпавший осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 40 мин), растворяют в 0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 и диалиэируют против такого же буфера от солей в течение 24 ч при 4 С, После диализа1 к раствору добавляют пиридоксаль-фосфат(10 мкг/мл), предварительно растворенный в буфере рН 6,0, и а -кетоглутарат (до 10 мМ конечной концентрации), приготовленный на 0,125 М калий-фосфатном буфере так, чтобы конечное значение рН раствора было равно 5,0-5,1, и начинают осаждение этанолом,Для осаждения берут небольшие порции (лучше по 100 мл) ферментного раствора, к ним приливают сразу всю порцию охлажденного до -50 С этанола (к 100 мл ферментного раствора необходимо прилить 120 мл этанола) до конечной концентрации 52, В ы павший осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин) и отбрасывают, а затем концентрацию этанола в супернатанте повышают до 70,5 . Для этого осаждения нет необходимости делить ферментный раствор на небольшие порции, поэтому этанол (охлажденный до -15 С), приливают сразу ко всему обьему фермент- ного растеора, Осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин), заливают небольшим объемом 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5 и оставляют на ночь при 4 С для экстракции фермента. От нерастворившегося осадка экстракт отделяют центрифугированием (15000 об/мин, 30 мин) и диализируют от этанола против 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5, Отдиализованный раствор концентрируют, высаливая его сульфатом аммония (500 мг к 1 мл раствора), а затем высоленный осадок фермента растворяют в 0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 таким образом, чтобы концентрация белка врастворе была не менее 30 мг/мл.Далее кристаллизуют фермент, для чего к холодному раствору небольшими порцияими в течение 1 ч добавляют сульфат аммония до насыщения 42 , После добавления всей навески сульфата аммония пробирку с0,0005 0,00050,0005 0,0005 0,00001 0,00001 0,00001 0,00002 АлюминийКальцийКремнийМагнийЖелезоКобальтНикельМедМышьяк, олово, свинец.сурьма 45 50 Отсутствие спектральных.линий 55 ферментным раствором оставляют в холодной бане на 10-15 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 15 мин) для удалениямеханических примесей, а в прозрачный5 раствор вносят затравочные кристаллы,Пробирку с раствором плотно закрывают ипомещают в холодильник. На следующийдень выпадают кристаллы фермента, их отделяют от маточника центрифугированием10 (6000 об/мин, 15 мин) и растворяют в 0,1 Мкалий-фосфатном буфере рН 7,5,По данным горизонтального гельэлектрофореза на пластинке в полиакриламидном геле (фиг. 1) и последующего15 сканирования геля на О ТВОЯсап х(фиг.2) чистота фермента составляет 99 принаивысшей для данного фермента удельнойактивности, равной 70000 ед/мг,Выход чистого цитозольного фермента20 составляет 78 от общего количества указанной трансаминазы в экстракте и 70 отобщего:.оличества суммарной активностидвух трансаминаз - цитозольной и митохондриальной, Митохондриальная трансамина 25 за, обладающая отличающимися отцитозольной физико-химическими свойствами и являющаяся в данном случае примесным белком, отделяется на 1-й стадииочистки,30 Схема очистки аспартат-трансаминазыиз цитозоля куриных сердец (данные на 1 кгсердец) представлена в таблице,Формула изобретенияСпособ очистки аспартат-трансамина 35 зы из цитозоля куриных сердец, включающий фракционирование сульфатомаммония, фракционирование этанолом икристаллизацию, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения выхода целевого40 продукта, фракционирование проводятсульфатом аммония, содержащим ионы металлов в количестве, мас не более:1752768 Я 0 ют 250 ииг 150 инг,Юет 1 ЕюФиг,1 40 50 М Ю юаоЮгР 60 УО 170 80 ль В.КочкинаМорге нтал оставиехред ктор О.Юрковецка актор В.Петраш Заказ 2734 ВНИИПТираж Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушскэя наб 4/5 нно-издатель оизво 7 1 б 15 у г 0 0 У 0,7 Об ОХ 0 й комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,.101