Способ получения биомассы

СОЮЗ СОВЕТСНИХЭнЭИРЕСПУБЛИК 2 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРОО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОИАССЦ Е.СОЫ, включакщий культивирование ЕвсЬег 1 сЬ 1 а Со 11 В на питательной среде, содержащнй источники углерода В азота, минеральные соли и ростовые факторы, инфицирование полученной биомассы фагом . Т ащ 82 и инкубацию с последуюцим вКпелением ферментов нуклинового .обмена, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода биомассыо в питательную среду дополнительно вводят .глутатиен в концентрации 0,01- 6,015 г/л, инфицирсвание биомассы фагом осуцествляю при плотности культуры 3,0-3,3.10 клеток в 1 мм куль, туральной жидкости,апоостинфекцноннуюй инкубацию проводят в течение 28- 130 мин при рН 7,5-7,6.Изобретение относится к способамполучения биомасс, обогащенных биоло"гически активными веществами.Известен способ получения биомассымикроорганизмов с РНК-лигазной активностью, где в качестве продуцента используют Е.Со 11 В, а в качестве ин",цуктора РНК-лигазы фаг. Т 4+, Выходбиомассы не указан, Активность РНКлигазы 3,7 ед. на мг белка (1,Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ заключающийся в том,что биомассу с полинуклеотидкиназнойактивностью получают культивированием бактерии Е,Со 11 В на питательнойсреде, содержащей г/л; аммоний хлорис 15тый 1; магний сернокислый 0,13 калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0;натрий фосфорнокислый двуэамещенный6,0; глюкоза 4,01 казаминовые кисло,ты 2, О. 20Температура выращивания 37 С. Усоловия индукции ферментов фагом: плот.ность культуры Е,Со 11 2 10 клеток/млмножественность инфекции 4 фаговыхчастицы на клетку. В качестве биости мулятора добавляют триптофан 0,01 г/л,Накопление фермента проводят втечение 12 мин после инфекции фагом.Выход биомассы 2,5 г/л. Активностьполинуклеотидкинаэы 40 ед/мг белка (2) .Однако при этом сравнительно низкий выход биомассы, так как на стадиях инфицирования культуры и постинфекционной инкубации не обеспеченыусловия для интенсивного протеканияпроцесса.Цель изобретения - повышение выхода биомассы,Поставленная цель достигается тем,что в способе получения биомассы 40Е,Со 11 В на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и ростовые факторы,в питательную среду дополнительновводят глутатион в концентрации О, 01 450,015 г/л, инфицирование биомассы фа.гом ТятпР 82 осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3 10 клеток/мл9культуральной жидкости, а постинфекционную инкубацию проводят в течение 5028-30 мин при рН 7,5-7,6,П р и м е р 1, Культуру Е.Со 11 Ввыращивают на питательной среде сле"дующего состава, г/л:ЫНС 1 1,0+1,2 55Мдй 04.7 Н 20 0,13+0,15КН РО 4 3,0+3,5Ба 2 НРО 9,0+10,0Глюкоза 10,0+15,0Гидролизат 60казеина 8, 0-3,0, 0Дрожжевой экстракт 1,0-1,2рН 7,2-74Глюкозу вводят в питательную среду в виде стерильного раствора. Про" 65Глюкозу вводят в питательную средув виде стерильного раствора.Выращивание Е,Со 11 В,1) Инокуляция посевного материала,Культура Е.Со 11 В поддерживается настолбиках МПА вазелиновым маслом, пересевается один раз в 4 месяца. Дляподмолаживания культуру засевают в100 мл основной среды с содержаниемглюкозы 0,5 г/л, инкубируют 10-12 чопри 37+1 С стационарно, Инокулят готовят, пересевая 10-12 часовую культуру на 1 л свежей среды с содержанием глюкозы 1, 0 г/л из расчета 1: 8 ивыращивают в течение 4-5 ч в условиях аэрации.2) ферментация культуры Е,Со 11 Впроизводится после добавления Мнокулята 1:20 по отношению к объему среды, ферментация производится при37+1 ОС в условиях принудительнойаэрации (2 л воздуха на 1 л питательной среды).3) Кнфицирование Е.Со 11 В фагомТ сце 82. Когда плотность культуры достигает З,ЗУ 10 клеток/мл (по калйброКвочной кривой), прекращают аэрирование, добавляют суспензия бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на1 клетку бактерии, т.е, б,б 10 БОЕна 1 мл культуральной жидкости. Одновременно добавляют глутатион0,015 г/л,4) Постинфекционное инкубированиепроводятпри рН 7,5-7,6, регулируемое раствором НН ОН и аэрации 2 л воздуха на 1 л питательной среды в теводят культивирование в условиях принудительной аэрации до тех пор, пока плотность культуры достигнет 3,0-3,3 109 клеток/мл культуральной жидкости, и осуществляют инфицирование фагом из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, одновременно добавляют глутатион в концентрации 0,010-0,015 г/л и продолжают культивирование 28-30 мин, поддерживая рН 7,5-7,6, Процесс прекращают охлаждением культуральной жидкости др 5 ОСВыход биомассы 7,0-8,5 г/лАктивность полинуклеотидкинаэы 45-47 ед/мг бел "каАктивность РНКЗаказ, 3132/21 Тираж 523 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП фПатент, г.ужгород, ул,Проектная, 4 чение 28 мин, после чего быстро охлаждают культуральную жидкость до50 С,Выход биомассы 8,5 г/л,Активность полинуклеотидкиназы 47 ед/мг белка,5. Активность РНКлипазы 5,0 ед/мг белка,П р и м е р 3. Питательная средасодержит, г/лгЮН 4 С 1МПВО,7 Н 2 ОКНОРР 4На Нр 04Гл 2 юкозаГидролизатказеинаДрожжевойэкстракт 1,0рН 7, 2-7,4Введение глюкозы, инокуляция посев.20ного материала, Ферментация культурыподобны примеру 1,Инфицирование Е,Со 11 В фагом ТМ 2проводят, когда плотность культуры достигает 3 10 клеток в мл,добавляют сус пензию бактериофага иэ расчета 2 Фаговые частицы на 1 клетку бактерии,т,е. 6. 109 БОЕ на 1 мл культуральнойжидкости, глутатион добавляют в количестве 0,01 г/л. Постинфекционную ин- З 0кубацию проводят 30 мин. Выход биомассы 0,7 г/л. Активность полинуклеогидкиназы 45 ед/мг белка. АктивностьРНК липаэы 5,2 ед/мг белка.П р и м е р 4, Питательная среда, З 5введение глюкозы, инокуляция посевного материала, Ферментация культурыЕ,Со 11 Вподобны примеру 1.Инфицирование Е.Со 11 В Фагом Т ат82 проводят; когда плотность культу"ры достигает 3,2 109 клеток в 1 мл 40культуральной жидкости, добавляютсуспензию бактериофага из расчета 2фаговые частицы на.1 клетку бактерии,т,е, 6,4.1 УБОЕ на 1 мл культураль"ной жидкости, глутатион добавляют в 45количестве 0,013 г/л; Постинфекционную инкубацию проводят.в .течение29 мин.Выход биомассы 8,0 г/л. Активностьполинуклеотидкиназы 46 ед/мг белка; 50 Активность РНК-лигазы 5,1 ед/мл белка,Применение предлагаемого способаобеспечивает хороший выход биомассы(7,0-8,0 г/л) с активностью полинук"леотидкинаэы 45-47 ед/мг белка и РНКлипазы 5-5,2 ед/мг белка,Выращивание культуры до плотности клеток 3 - 3,3 х 10 в , 1 мл культуральной жидкости,множественность инфицирования 2 фаговых частиц на бактериальную клетку достаточна для того, чтобы каждая микробная клетка была атакована фаговой частицей, при этом не чызывая лизирования клеток извне, что может иметь место при более высокой множественности инфицирования, Добавление глутатиона в питательную среду способствует прикреплению фаговых частиц к поверхности клеток Е,Со 11 и активизирует мембранные процессы. Таким образом достигается 98-100 инфицирование клеток фагом, что интенсифицирует накопление ферментов, так как Фаг является индуктором и полинуклеотидкиназы и РНК-липазы,Осуществление постинфекционной инкубации в течение 28"30 мин способствует накоплению РНК- . липазы в то же время без снижения активности полинуклеотидкиназы, максимум активности которой наблюдается к 23-25-ой минуте постинфекционной инкубации,Образованию и стабилизации целевых Ферментов и биомассы способствует ведение постинфекционной инкуба ции при рН 7,5-7,6,.Технико"экономический эФФект предлагаемого способа заключается в обеспечении получения ферментов РНК-липа"зы и полинуклеотидкиназы комплексным путем.Способ обеспечивает повышение выхода биомассы и целенаправленное на-. копление в ней ферментного комплекса полинуклеотидкиназы и РНК-линзы в3-.3,5 раза.