Способ очистки человеческого -интерферона

)ренение поК 45/02тР,аявке ЕЛОВЕЧЕСКОГО тноситс очистк особеннИзобенно инте стоты и высокои "к льдчо рон ено а к ние про ия - повнроцесса.вляют сле ель и об звэди Споуюцим обра с з рой интерЬеро ате деятельно брабатнвают о елем. Интересе ездвиженном с элюентом. Ва н а об ученныи еток че ревеп н с т з ездвиженным си он, поглоценнь н инем носителе, тем отбираемнй рабатнвают хел, телем с остатко раструюор терюероническим м с ме по меньщеинбранннй1 Ф 2 Ф3. иннй на хеелатирования, включ ме из г Епф отделяютарат интер а т ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕК ПАТЕНТУ 1 21 ) 3593070/2" - 14-ИНТЕРдьЕРОНА ион одного металла, уппн, состояцей из СИнтерйерон, поглоце таллическом носителе сителя, получая преп ОБРЕТЕНИ 2(57) Изобретение относится к медици. не и может быть использовано дляистки человеческого 5-интерюерона, ль - повыддение производительности процесса. Раствор сырого интерАерона пропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатирования, включаюцим по меньддей мере ион одного металла из группы Со, Чд+, 7 п . рН контактирования с синим агарозным гелем 5-9, 10 табл. ц трации,Раствор сырого интерюерона сначала приводят в контакт с обездвиженным синим носителем.Синий краситель можно обездвиживатьна любом из разнообразных обычно используемых носителей, способном соединяться с красителем. В число такихносителей входят (А) соединение красителя через амино-группу антрахиноновой части с агарозой, активированнойбромистым цианом; (В) соединение кра"сителя с гелем поперечно связаннойагарозн способом триазинового соединения через эфирную связь; (С) соеди.нение синего декстрана В (декстран,соединенный с синим красителем, Аирма "Фармесиэ") с агарозой, активированной бромистым цианом методомтриазинового соединения; (Л) соединение синего красителя, связанного сОбщий белок, мг Удельнаяактивность,им.ед,/мгбелка Объем тивность10 им.ед,1240 1,1 1 О 10 бО 200 0,7 200 14 20 1,0 10 40 20 1,4 5 0,9 2 19 1 200 200 2,71 О2,1 10 20 27 0,4 82 ТаблицаЗ Характерист ри зл ин 0,000 30 10 00 агарозы1-й промывочраствор ныи 2-и промыврастворЗлиентХелатникел 1 О колонна агрузочаствор 10 опуще раство 1-и пр 1 вочныи ворпромывочныйвор2 рЭлиа 5 11 Характеристика Исходный материал Раствор сырого интерферонаРаствор, пропущенный через синеагарозную колонну1-й промывочный раствор2-й промывочный раствор3-й промывочный растворХелатцинковаяколоннаПропущенный раствор1-й промывочный раствор2-й промывочный растворОбщая фракция элюиро- вания Исходные матРаствор сыротерФеронаКолонна сине 20,000 142 20,000 10 0,7 110 Т а б л и ц а 22) 22 1523046 Общий белок, мг Выход; % Общая интерферонная акОбъем, л тивность,ф 10 им.ед. 1375 611170 1,7 84020 20 20 2,4 0,4 0,1 60 0,32 1,3 20 0,12 1,4 13 12 90 0,03 60011 71 241,3 2 2500550 0,42 0,12 Общая интерферонная активОбъем, л ность,10 им.ед.6 белка 390 15,4 2500 300 6 11 20013,5 1,0 520069 0,9 30000 2252270 30024877 Та блиц аб Х ъе 2500 125 62 2,5 1,6 1,7 60 0,21 3300 16 26 42 7000 0,15 7100 0,07 Характеристика Раствор сырого интерферонаНадосадочный слой1-й промывочныйраствор2-й промывочныйраствор3-й промывочныйраствор1-я фракция элюирования2-я фракция элюирования3-я фракция элюирования Характеристика Раствор сырого интерферонаПропущенный черезколоннуПромытыйФракция элюирования Раствор сырого интерферонаПропущенный через колоннуЭлюирование30%-ным растворомэтиленгликоля40%-ным растворомэ тиленгликоля50%-ным растворомэтиленгликоля Выход, Общий % белок,мг Таблица 4 Удельнаяактивность,ф 10 им,ед./мгфбелка Т а б л и ц а 5 Удельная активностьу 10 им ед /мгФ23 1523046 Извлечение, г Общая активностьИФН,2210 ЕИ Удел ьная ак" Общеесодержание Объем тив протеина,МГ ностьч 10ЕИ/мгпротеина 10010475 280 43240 54 1252,4 3750 40004000400300 12012590 2005050 0,4 0,20,8 0,120,232 ф 5 0,75 0,30 1,05 40 20 60 30 30 60 УдельнаяактивностьЕИмг Общеесодержание протеина,мг Объем,Извлечение, Е 15,4 101,8 10 64 50 2000 2210 10,3 10 0,2 1060,1 10 7,0 10 109 125 5,1 10 0,34 6,5 Характеристика Колонна из хелата цинкаНеочищенный ИФНПропускается черезПромывка.Фракция элюированияКолонна из голубогоагараПропускается через1-я промывка2-я промывкафракция элюирования1-я2-яВсего характеристика Исходный раствор СРОПропускается через ,промывка1-я фракция элюирования 45 2-я Фракция элюирования 46 3-е элюирование 48 ДиализированныйрастворКолонна из хелата цинкаПропускается через + промывкаФракция элюирова- ния Общая активность ИфН,ЕИ Т Р 2 б л и 12 а 726Таблица 9 1523046 Извлечение,Е Удельнаяактивность10 им.ед./мгфбелка Общая активность интерФеро на,х 10 им. ед бщий Объем,Характеристика елок,мг 60 Внесенный раствор 6000Пропущенный + промытыйЭЛюированиеФракция 1 20Фракция 2 150Фракция 3 150 378 228 3 20600400Таблица 10Извлечение,% 36 6,8 0,23253,5 212,42 0,4748 Общая активность интереро на,х 10 им.ед6 бщий Удельная . активностьк 10 им.ед/мг белка Характеристика Объем, мп елок,мг Внесенный раствор 300 14,49,30,23 5701013 ПропущенныйПромытйЭлюирование:Фракция 1Фракция. 2 30046 0,90,03 0,40,01 2,445 420 0,80,45 30010000 20 Составитель А. АгуреевТехред Л.Сердюкова КорректорМ. Максимишинец Редактор Н. Киштулинец Заказ:6985/59 тираж 643 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина, 101О ЖН Ьо И 35 ЖН ИН-( Х Поперечно свя,гф ЪЯ . занный агарозо 803 Н О вый гель ирования обездвиженнотеля с раствором сыро- можно использовать Для контак о синего нос о интерФерон ибо порционн пособ,тй метод, либо колонный о ин Раствор сырог лучен путем обр Фибробластовых Игла, содержавш озы с поли 1; и обработкой цикл тиномицином Д,мер бып пческих ерФерои чело абот кл еток в среде МЕМ 0,4% метилцеллюл С, с последующей гексимидом и ак й ол осырого интерФентерферона 6,2 хобавлено 21 мгтиномицина Д наней агарозы (АФФ"Био-Рад"чение 40 л раствораивностью иед. было д100 мкг, акмп геля сиФирмывания в те на с ак м 10 имбелка и 1 л,30), После л еремеш боковой цепью АФФиа-геля 10 (Фирмы "Био-Рад лэб." именуемой ниже"Био-Рад) через пептидную связь сполисахаридным носителем, Можно также использовать другие носители, например поперечно связанный декстраноОвый гель например СеФадекс , (Фирма "Фармесиэ"), и виниловый полимерс гидроксильными группами, которыйтакже можно использовать как носительдля для хелатметаллической хроматограчии в следующей стадии, предпочтителен гидроФильгый гранулированныйполимер, например, Тойоперл (Фирма Тойо сода комн. ).Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий,В), так как он весьма эФФективносвязывается с интерФероном, не вызывает отделения красителя от носителя,поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабильнымв условиях рН от 6 до 13, и он легкодоступен на рынке, Этот синий.агарозо вый гель имеет следующую структуру иреализуется под товарным наименованием "Блу сеФароз С 1 бВ (Фирма "Фарме рсиэ"1 "Матрекс гель блу А (Фирма( Фирма "Био-Р ад" ), дврживания в течение 3 ч надосадочная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой Физиологическим раствором, содержащим Фосфатнокислотный буФер. Надосадочная жидкость была извлечена снова, Колонну дважды промывали и элюировали. Использовали следую- щие промывочные растворы и элюент:первый промывочный раствор (320 мл):раствор 1,0 М хлористого натрия, содержащий 10 мМ ФосФор. нокислого натриярН 7,2)второй промывочный раствор (280 мп)ф25%-ный раствор этиленгликоля содержащий 10 мМ ФосФорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2)элюент (400 мл):55%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ ФосФорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2).Получен выход частично очищенного интерферона в элюате( 300 мл) 81% от исходного раствора интерферона, очищение в 33 раза.)дистиллированную воду иФосФорнокислого натрияиспользовали при скоростока 30 мл/г в течениеочередновторой промывочный раствор (5020 мМ раствор лимоннокислогонатрия (рН 5,0)элюент:0,1 М буФерный раствор укскислота - уксуснокислый н(рН 4 ф 5) еВыход хелатцинковой хр 87%, а общий выход 70%. Д очистка в 330 раз.Активность и выход интерФерона, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.1. 0,1 М (рН бэ ти по ч поусиая атрий оматографиостигнута В колонну с хелатом цинка 10 мп) элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мп/г. После двойной промывки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент 1первый промывочный раствор (300 мл5 152304Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламидного геля.Часть конечного элюата подвергли5диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировали. После восстановления лиофилированногодиализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электрофорезу с использованием полиакриламидного геля в присутствии НДС согласно способу Лэмпи (Нейчэр, 227,680-685 (1970 для проведения анали.за активности интерферона и красителя сблестящей синью Б 200.В результате активность интерферонаи темно-синяя полоса были обнаруженытолько в положении, соответствовавшем молекулярному весу примерно 2023000.Анализ актиномицина Д.Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы.Часть конечного элюата обессолили 25путем гель-хроматографии, используяСефадекс О 25 после добавления сывороточного альбумина человека(1 мг/мл), Добавляя дополнительнонебольшое количество сывороточногоальбумина человека и лактозы обессоленный элюат профильтровали черезфильтр 2 мкм и лиофилировали. Актиномицин Д был обнаружен в количествене больше 0,0003 мкг/106 им.ед. ак 35тивности интерферона,Злюат из колонны геля синей агарозы содержал: 0,7 мкг/м актиномицина Д. Общее количество актиномицинаД составило 210 мкг. Кроме того, присутствие актиномицина Д в элюате изколонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) ипутем биопробы.Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом гельхроматографии с использованием Сефадекс 0-25 после добавленич человеческого сывороточного альбумина.Удаляя этиленгликоль, обессоленныйэлюат лиофилировали. Все же былообнаружено около 0,7 мкг/10 им.ед,6интерферонной активности актиномици-на Д,Пирогенное испытание на кроликах.Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилированный материал инъектировали внутривенно трем кроликам (2 10 им.ед./кг 6 6массы кролика), Суммирование пнреко сии для всех трех кроликов было О,б С. Интерферон, очищенный по предлагаемому способу, оказался отрицательным к пирогенномуиспы анию на кроликах. Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля синейагарозы, инъектировали внутривеннотрем кроликам (2 1 О им. ед/кг массыкролика ). Суммирование пирексии длявсех трех кроликов было 1,5 фС. Интерферон, очищенный согласно способухроматографии синей агарозы, оказалсянеопределенно отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах.П р и м е р 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интерферона, подобный использовавшемуся впримере 1,20 л раствора сырого интерферонапропустили через колонну синей агароэы объемом 20 мл (Матрекс гельблу А , фирмы ",Амикон корп"), Колонну трижды промыли и элюировали.Использовали следующие промывочныерастворы и элюент.первый промывочный раствор(200 мл);25%-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористогонатрия (рН 7,2).третий промывочный раствор(40 мп);407-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия иМ хлористогонатрия (рН 7,2),элюент (200 мл):553-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия,Хелатцинковую колонну 5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюирования, и элюатиз колонны синей агарозы непосредственно пропускали через хелатцинковую колонну. Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюировали.Промывочные растворы и элюент былиследующими:35 первый промывочный раствор.20 мМ лимоннокислый натрий(рН 5,0):элюент 1100,2 М буферный раствор уксуснаякислота - уксуснокислый натрий,содержащий 1 М хлористого натрия.Интерферонная активность, выход,количество белка и удельная активность каждой стадии показаны втабл.2,П р и м е р 3. 20 л раствора сырого интерферона с интерферонной ак.тивностью 15 10 им. ед. и 60 мг/л6общего белка контактировали с 40 млсинеагарозного носителя Матрексгель Блу А фирмы "Амикон корп.")Носитель, на который был адсорбирован интерферон, загрузили на колонну. Затем колонну дважда промыли иэлюировапи. Использовали следующиепромывочные растворы и элюент:первый промывочный раствор30.содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2).второй промывочный раствор(400 мл):25%-ный раствор этиленгликоля,содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7 в 2)ф40элюент:(400 мл).100 мл раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мп хелатникелевую колонну. Использованная колонна хелата 45никеля была. приготовлена так же, какв примере 1, за исключением того, чтовместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никеляХелатникелевую колонну промыли иэлюировали. Испольэовали следующиепромывочный раствор и элюент:промывочный раствордистиллированная вода и 0,1 Мфосфорнокислого натрия (рН 6,7)использовали поочередно55элюент:0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,5).Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл,З.Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был отрицательным относительно испытания Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д. П р и м е р 4. Была повторена процедура примера 3 за тем исключением, что хелаткобальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны причем хелаткобальтовую ко-," лонну приготовили как в примере 1, йо вместо хлористого цинка использова-ли раствор хлористого кобальта.Злюат (15 мп) содержал 4,510 им,6 ед.,интерферона (выход 60%) и 0,25 мг белка. Удельная активность составляла 1,8 10 им, ед,/мг белка, КонечВный элюат был отрицательным к испытанию Лимулуса. В нем не было обнаружено актиномицина Д.П р и м е р 5. Культивировали, штамм Е. коли, в котором был интегрирован структурный ген -интерферона, и культивированный штамм. подвергли процедурам сбора бактерий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний, Белковую фракцию, содержащую -интерферон, .полученный из штамма Е.коли, растворили в 25%-ном растворе этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2), с целью получения раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферон-, ную активность 510 им,ед. и 20 мг6белка на 1 мп.40 мп раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мп синей агарозы (Матрекс,гель блу А фирмы "Амикон корп."), уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащим 1 М хлористого натрия, Колонну дважды промыли с целью удаления примерно 95% белка в растворе сырого интерферона, и элюировали с фракционированием в каждую фракцию 2 мп, Использовали следующие промывочные растворы и элюентфпервый промывочный раствор (10 мп):25%-ный раствор этиленгликоля,содержащий 1 М хлористого нат 9 1523046 1 Ория и 1 О мМ Фосфорнокислого натриявторой промывочный раствор (10 мп)40 .-ный раствор этиленгликоля,содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислогонатрияэлюент:60%-ный раствор этиленгликоля,содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислогонатрия,Элюат (12 мл) из колонны синей агарозы имел интерферонную активность1,6 1 О им.ед. (выход 80%) и 4,6 мгбалка. Средняя удельная активность вкаждой фракции была 2,510 им,ед,/мгбелка (макс. : 5 10 им.ед,/мг белка),Элюат подвергли анализу так же, 20как в примере 1. В результате чистотаинтерферонной активности при молекулярном весе примерно 19000 составляла10-50(средняя 25 ).6 мл элюата из колонны синей агаро-дзы пропустили через 1 мп хелатцинковой колонны, уравновешенной 60 -нымраствором этиленгликоля, содержащим1 М хлористого натрия и 1 мМ Фосфорнокислого натрия. Колонну трижды промьши и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюентфпервый промывочный раствор (6 мп):60 -ный раствор этиленгликолясодержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ Фосфорнокислого35натриявторой промывочный раствор (6 мл):дистиллированная вода.третий промывочный раствор (6 мп):220 мМ буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащий2 М хлористого натрия (рН 6,0),элюент:01 М буферный раствор Уксусно 45кислого натрия, содержащий 1 Мхлористого натрия (рН 4,0).Конечный элюат (4 мл) имел интерферонную активность 4,0 10 им.ед.(выход 50 ) и 0,4 мг белка. Удельнаяактивность была 1 10 им. ед./мг бел 8ка.Конечный элюат подвергли анализукак и в примере 1 и обнаружили однуполосу в положении молекулярного весапримерно 19000. Чистота была больше5597 .П р и м е р 6. Была повторена процедура примера 3, за тем исключением,что вместо хелатникелевой колонныиспользовали хелатцинковую колонну ив качестве элюента использовали 0,2 Мраствор 1 -гистидин, уравновешенныйхлористый натрием (рН 7,0).Элюат (20 мп) имел 50 1 О им.ед.интерферона (выход 67 ) и 50 г общего белка. Удельная активность быпа1,0 10 ф им.ед./мг белка,П р и м.е р 7. Использовали сыройинтерферон, полученный из .человеческих фибробластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному впримере 1,К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 42 106им.ед. и концентрацией белка -70 мг/лдобавили 30 мп геля синей агарозы(ММгех Се 1 В 1 ие А "Аппсоп согр".)После перемешивания смеси в течение3 сут и выдержки в течение Зч удалили надосадочный слой и гель синейагарозы пропустили через колонну,промывая 200 мп 1,0 М раствора хлористого натрия, содержащего 10 мМфосфата натрия с рН 7,2 (буфер А).Затем колонну дважды промыли,Перед элюированием интерферона дляулучшения очистки к выходу вышеука-.занной колонки подсоединили колонку.с 15 мп свежего геля агарозы, уравновешенного буфером А, содержащим25 -ный раствор этиленгликоля, Послетретьей промывки интерферон элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:первый промывочный раствор (200 мп)буфер Авторой промывочный раствор (300 мп),буфер А, содержащий 25%-раствор этиленгликоля,третий промывочный раствор (120 мп),3 М раствор хлористого натрия,содержащий 30 мМ фосфорнокиелого натрия (рН 7,2) и 30 -ныйраствор этиленгликоляэлюент (600 мл)буфер А, содержащий 55%-ныйраствор этиленгликоля. Раствор элюата фракционировали. Результаты представлены в табл.4.Фракцию второго элюирования подвергли дальнейшей очистке с помощью хелатцинковой хроматографии.В колонну с хелатом цинка (15 мтт) ввели буфер А, содержащий 50 .-ныйраствор этиленгликоля. Часть (270 мп) фракции второго элюирования иэ вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получения 50 -ного раствора этиленгликоля и.пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч.Все операции проводили при температуре 2-8 С, После двойной промывки колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:первый промывочный раствор (200 мп)дистиллйрованную воду и 0,1 М раствор фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/ч в течение 1 ч поочередновторой промывочный раствор (30 мп):202 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокисло-.го натрия (рН 7,2) элюентф0,1 М уксусной кислоты - уксус 25нокислого натрия буферный раствор, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 7,4),Активность, выход интерферона, количество. белка и удельная активность этой процедуры очистки представлены в табл.5. Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анализу посредством электрофореза полиакриламидного геля . в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) для определения чистоты, Элюат подвергли пирогенному испытанию с помощью теста Лимулуса, используя 40 обнаруживающий эндотоксин реагент. Чистдта интерферона 90 , элюат отрицательный к испытанию:Лимулуса при содержании интерферона 1,6 10 им.б ед. /мл, 45Сравнительный пример .1. Во вторую колонну геля агарозы (Ма 1 гех СеХ Вшие А 4 мл) загрузили 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натрия, рН 7,2 (буЬер В).Чась .;р кни (45 мл) второго элюирования из кы онпы геля синей агарозыописачой в примсрс /, разбавили 5 мл буфера А и 75 мл буфера В и про пустили через вторую колонну геля синей агарозы при скорости потока 20 мп/ч, Все операции проводили при 15-25 С,Буфер, содержащий 30, 40 и 50 , - ный раствор этиленгликоля соответственно пропустили через колонну со скоростью потока 20 мл/ч.Результаты второй хроматографии геля синей агарозы представлены в табл.6.Интерферон иэ элюата, содержащего 40 -ный раствор этиленгликоля, из которой колонны геля синей агарозы подвергли. такому же анализу, как в примере 7, для определения его чисто ты и проведения пирогенного испытания.Чистота его была 60 и результат испытания Лумулуса положительный,Сравнительный пример 2. Колоннуиз хелата цинка (50 мл ) уравновешивали при помощи РВЯ. Неочищенный интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30ю 10 ме/мп и концентрацию протеина670 мг/л, пропускали через колоннухелата цинка с объемной скоростью100 мл/ч. После промывки колонну подвергали элюированию, При этом использовали следующие промывочные раствори элюентфпромывочный раствор (400 мл).дистиллированную воду и 0,1 Мраствор фосфата натрия (рН6,7) использовали с объемнойскоростью 100 мл/ч в течение1 ч, с чередованиемэлюент:0,1 М буферный раствор уксус-.ной кислоты - ацетата натрия,содержащий 1.0 М хлорида натрия (рН 4,7),Фракцию элюирования на колоннехелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматографии на голубом агаре,Колонну из голубого агара (5 мп) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натрия, содержащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из вышеупомянутой колонны халата цинка пропускали через колонну. с голубым агаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкратной промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант:,первый промывочный раствор (50 мл)1,0 М раствор хлорида натрия, 13 1523046содержащий 10 мМ Фосфата натрия, рН 7,2 (буфер А), второй промывочный раствор (50 мп 1:буфер А, содержащий 25% этиленгликоля;элюантбуфер А, содержащий 55% этитенгликоляРаствор элюата подвергали фракционированию. Результаты приведены втабл.7,Сравнительный пример 3, В качестве исходного материала использовалинеочищенный интерферон фибробласта,. который имел активность интерферона7,7 10 ме/мп и концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор. 13 ч. Затем смесь пропускали черезстеклянный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см),. Далее колонну промывали 100 мп РВИ, азатем 0,01 М раствором глицина-НС 1при рН 3,5, и элюировали 0,3 М буфером глицина-НС 1 при рН 2,0, содержащим 0,1 мг/мл альбумина сывороткичеловека.Элюаты подвергали диализу с использованием 41 л 1 М раствора ИаС 1,буферированного 0,02 М раствором фосЬата (рН 7,4).Диализированный раствор;пропуска 35ли через колонну с хелатом цинка сразмерами 0,67 см,затем колонну промывали 10 мл 1 М раствора хлорида натрия,. буферированногст О, 02 М раствором фосфа 40та (рН 7,4) и 10 мл О, 1 М буфера ацетатанатрия (рН 5,9). Затем колонну элюировапи 0,1 М буфером ацетата натрия(рН 4).Полученные резульгаты приведены 45в табл,8. Сраттттттте."ьттьтй тптт 1 т р 4, Использунл т ьт 1 г й че.1 тове 1 тегнцй Фцбробластный тттттарфет .цатта 1 тот ц о ц нтгттользуемо -50 :ту в примере 7.Рагтвор сывото ццттрферона, имеющего акттвкостт ттттт грФерона 38 10 им, ед./л, конттентраттттю белка 63 мг/ли удельную активность 6 10 им.ед./мг55 белка, регулируют до рН 2 путем добавления 6 н. НС 1 и загружают в колонку. БР-Сефадекса , 20 мл, 2 гм мФ 6,4 см), После .,агрузки 6 л раствора сырого интерферона со скоростью потока 40 мл/ч колонку промывают 200 мп дистиллированной воды. Затем колонку элюируют 320 мп 0,1 М буферного раствора Фосфорнокислого натрия (рН 8,3), Раствор элюата фракциони" руют. Результаты приведены в табл,9.Вторую и третью фракции элюирования используют для последующего способа очистки путем хелатцинковой хро-, матографии.Колонну с хелатом цинка (3 мл, 1 см 3,8 см) уравновешивают 0,1 М буферным раствором фосфорнокислого натрия (рН 8,3). Вышеуказанные фракции (300 мп) из колонки БР-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока 6 мл/ч. После промывки дважды колонну элюируют, Используют следующие промывочный раствор и элюент:9первый промывочный раствор (40 мп);дистиллированная вода и 01 Мраствор Фосфорнокислого натрия(рН 6,71, используемые пооче-,редно со скоростью потока6 мл/ч в течение 1 чвторой промывочный раствор (6 мл):2 М хлористый натрий, содержащий 20 мМ Фосфорнокислого натрия (рН 7,2)элюент:О,1 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислыйнатрий, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 4,7)Результаты этого способа очистки приведены в табл.10.Используемый в качестве исходного материала раствор сырого интерферона имеет рН 7,3, После отстаивания в течение 10 дней его интерферонная активность составляет 3810 им.ед./л и никаких изменений в активности интерферона не обнаружено. Тогда .как после отстаивания в течение 1 О дней раствора сырого интерферона, имеющего рН 2, перед загрузкой его в колонку БГ-Сефадекса, интерферонная актив 6ность снижается до 16 10 им,ед./л, Это означает, что раствор сырого интерферона неустойчив при рН 2,Изобретение имеет следующие существенные признаки и преимущества по сравнению с известным техническим решением.Способ очистки в соответствии с известным техническим решением включает ЯР-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметаллической хроматографией. Сырой интерферон, очищаемый в соответствии с известным способом, имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет активность интерферона 3,2 1 О им,6 ед./л и концентрацию белка 20 мг/л, а используемый в примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5 1 О им.ед./л и концентрацию белька 25 мг/л. Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого 15 интерферона с относительно низкой концентрацией.Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей хелат металлической хроматографией. В соответствии .с этим способом очистки сырой интерферон с высокой концентрацией (например, сырой интерферон, используемый в примере 7, имеет ак тивность интерферона 42 1 О им.ед./лб и концентрацию белка 70 мг/л) может быть удовлетворительно очищен.Кроме того, как видно из примера 7, в котором использовали сырой интерферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 477. Таким образом, известный способ непригоден для очистки сырого интерферона с высокой концентрацией. Это становится более очевидным из сравнения результатов примера 7 с результатами сравнительного примера 4 (в обоих примерах материалом для очистки был сы рой интерферон с высокой концентрацией). Извлечение,Е Пример 7 Сравнительный 45 пример4 1-я очиститель 36 ная стадия2-я очиститель 69 20 ная стадия Применение известного способа ограничивается сырым интерфероном с относительно нИзкой концентрацией, Предлагаемый способ применим к сырому интерферону как с низкой концентрацией, так и с высокой концентрацией.Известный способ имеет недостаток,заключающийся в том, что перед з агрузкой колонки БР-Сефадекса сырой интерферон обязательно делают сильнокислотнымпоскольку интерфвронная активностьпри таком кислотном состоянии заметно теряется, как показано в сравнительном примере 4.Этот недостаток известного способа не обнаруживается в изобретении,поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществляют вусловиях почти нейтрального рН.П р и м е р 8. Используемый раствор неочищенного интврферона получают путем обравотки клеток человеческого фибробласта с использованиемметодики, аналогичной примеру 1..К раствору неочищенного интерферона, который имеет активность интерферона, равную 30000 ед,/л, белковуюконцентрацию, равную 0,11 мг/мл ирН 7,2, прибавляют б н. раствор НС 1или 1 н. раствор БаОН с тем, чтобыдовести рН до 2,3, 4,5,6,7,8,9 или10.Устойчивость каждого раствора неочищенного интерферона испытываютпутем определения титра, оставшегося после отстаивания каждого раствора неочищенного интерферона при температуре 4 С в течение 16 ч,Ниже приведены результаты испытания, выраженные в процентном содержаниирН Устойчивость,%2 833 694 805 90б 977 1008 989 94.10 80Затем 15 мл каждого раствора неочищенного интерферона помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку, в которую также помещают 0,05 мп синего красителя в качестве носителя (Ма 1 гех Ое 1 В 1 иеА)и смесь неремешивают при 4"С в течение 16 ч. После удаления надосадочного слоя и промывания дважды 2,5 мн 10 мМ раствора фосфат натрия - 1 н. ЫаСХ рН 7,2) 2 мп18 17 1523046 20 Та блиц а 1 Общийбелок,мг Общая активность интерферона,10 им.ед.6 Удельнаяактивность,им.ед,/мгбелка Объем,Выход, % Характеристика 3,0 10 630 30,000 186 32,000 3 570 20 0,2 320 1,4 280 1,0 10 150 81 300 143 285 285 1,8 0,6 300 106064124 2,5106104. 101,0 10 41,00,161,2 50 10 20 30 32 34 10 10 мМ .фосфата натрия - 1 н. ИаС 1 (рН 7,2), содержащего 55%-ный этиленгликоль, прибавляют к носителю. После центрифугирования удаляют надоса 5 дочный слой, содержащий частично очищенный интерферон,Затем определяют количества потерянного интерферона (общее содержание интерферона, не абсорбированного на носителе, и интерферона, содержащегося в промывном растворе) и восстановленного интерферона.Ниже приведены результаты выраженные в процентном содержании. 15рН Потеря, Восстанов% ление, %2 53 13 504 20 465 9 656 7 707 7 688 8 739 6 67 25 10 6 50 Исходный материал Раствор сырого интврферонаКолонны геля синей сахарозыНадосадочная жидкость1-й промывочныйраствор2-й промывочныйрастворФракция элюированияХелатцинковаяколоннаЗагрузочный раствор Пропускаемыйраствор1-й промывочный раствор2-й промывочный раствор1-я фракция элюата2-я фракция элюатаОбщая фракция элюата Как видно из вьппвприведенных результатов, когда рН раствора неочищенного интерферона был доведен до 5-9, раствор неочищенного интерферона оставался устойчивым и восстановление частично очищенного интерферо" на было высоким.Формула изобретения Способ очистки человеческого 3-ин-. терферона путем контактирования раствора неочищенного интерферона с сорбвнтом, обработки сигнала элюантом с последующей металл-хелатной хрома-: тографией полученного элюата, при которой носитель содержит хелатообразующий остаток, а в качестве иона - Со+ или М или Еп и элюции це 4 2 +алевого продукта гистидином или кислотным буферным раствором, о т л и " ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения производительности процесса, в качестве сорбента используют синий агарозный гель, а контактиро" ванне проводят при рН 5-9.