Штамм бактерий аснrомовастеr agile продуцент рестриктазы aag 525 i

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ ЕСПУБЛИК 9) .Я ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР . 53)5 С 12 М 9/14,МИТЕТОТКРЫТИЯ ИЕ ИЗОБРЕТЕН П Е К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) Н.Н.Соколов, И,И.Федор, А.Б.Фицнер, . Н.В.Аникейчева, А.А.Калугин, О.Т.Самко, М.А,Эльдаров и Э, Б,Хорошутина(56) Мауег Н., СговзсЬеб 1 В., ЯСЬопе Н НоЬот 6. С 1 а 1 а Нее ге зМСТ 1 оп епдопос 1 еазе гоа СагуоЬабоп агнце 1. - Ицс 1, АС 1 бв Вез., 1981, ч. 9, р, 4833-4845.(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ АСНВОМОВАСТЕ 8 А 6 Е - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ААО 5251.1 о 7) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях в микробиологической промышленности, Целью изобретения является получение Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в экспериментальной работе в области молекулярно-генетических исследований, в микробиологической промышленности.Цель. изобретения - получение штамма, продуцирующего новую рестриктаэу Аад 5251, обладающую более высоким выходом.Поиск штамма-продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода тестирования активности в толуольных экстрактах микробных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агароэном геле. штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом, Штамм-продуцент АСЬговоЬастег адПе 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма АСЬгопоЬас 1 ег ад 11 е 525 содержит новую эндонуклеэзу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 - . А ТфС 6 А Т - 3 , в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе 5-6 х 10 ед/г сырой биомассы, Для изошиззомера Аад 5251 - рестриктазы Оа 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Аад 5251 составляет (1,7 - 1.,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает выход известной рестриктаэы С 1 а 1 (430 ед). Штамм АСЬгоаоЬастег адИе 525 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранится под М ВКМКМ МГУ (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов).Штамм АСЬгоаоЬастег ад 1 е 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.Рестриктаза Аад 5251, изошизомер С а 1, узнает последовательность нуклеотидов А Т С 6 А Т и расщепляет ДНК фага Л в 15 участках, Аб 2 в двух, рВЯ 322 в одном и неимеет один участок узнавания на наиболее 35 40 Культура типична для АсЬгогпоЬастег 45 50 гидролизует ДНК обезьяньего вируса ЯЧ 40 и ОХ 174;Эндонуклеаза рестрикции Аад 5251 является ценным инструментом для работ в области генетической инженерии. Фермент распространенном в генетической инженерии векторе для клонирования плазмиде рВВ 322, причем сайт рестрикции локализуется в области гена, ответственного эа устойчивость к тетрациклину. Таким образом, клонирование ДНК в данном участке при .помощи Аад 5251 в значительной степени облегчается возможностью проведения селекции рекомбинантов по фенотипу Тс (чувствительность к тетрациклину).Характеристика штамма.МорФологические свойства.Палочки размером 0,7 х 2-4 мкм обычно расположены поодиночке, подвижны. грамотрицательны.Культурально-биохимические свойства, На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на чашке Петри с мясопептонным агаром мелкие, блестящие, края ровные. На мясопептонном бульоне на дне пробирки осадок, среда прозрачная.Отношение к кислороду: строгий аэроб.Желатина уколом - очень медленное разжижение.Чувствительность к антибиотикам: культура чувствительности ко многим антибиотикам, резистентна к пенициллину, стрептомицину, полимиксину,Условия выращивания и хранения Культура хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: бульоне Хоттингера, среде 1 В. При культивировании на среде 1 В наблюдается продолжительная лаг-фазаОптимум роста при,37 С. Зона рН роста культуры лежит впределах 4,6-9;5. Оптимум роста культурыи образования фермента при рН среды7,2 - 7,4, При рН 10,0 культура не растет,адИе.Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л 250 млосновного перевара Хоттингера, 5 г йаС 1,1 г К 2 НРОа, до 1 л воды,Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках.П р и м е р 1. Культуру АсЬгоеоЬастег ад 11 е, штамм 525 предварительно адаптируют на питательной среде, содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера,10 15 20 25 30 5 г йаС 1, 1 г К 2 НР 04, до 1 л воды, при 37 С в течение ночи. Инокулят для ферментера готовят, паресевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды иэ расчета 1:10, и размножают в условиях аэрации.Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37 С в условиях аэрации. рН среды 7,2-7,4.Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают,в пределах 7,4 - 7,6.Выращивание продолжают до фазы замедления роста.Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости.Содержание рестриктазы Аад 5251 6000 ед/г биомассы.Определение активности фермента проводят экспресс-методом в толуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК,Выделение эндонуклеаэы рестрикции Аад 5251.5 г биомассы АсйгогпоЬастег адПе 525 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2 - 4 С. После удаления остатков клеточных оболочек. и неразрушенных клеток фермент фракционируют 10-ным полиэтиленимином, а затем в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран, Обогащенный рестриктазой экстракт хроматографируют в калийфосфатном буфере в градиенте КС 1 на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ), затем. на колонках с гепаринсефарозой и голубой сефарозой (фирмы "Фармация" );Получают 8,5 х 10 ед. фермента в 2,5 мл . глицеринового буфера. Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 12 мес. Выход очищенного препарата рестриктазы Аад 5251 составляет 1,7 х 10 ед. на 1 г сырого веса биомассы,Рестриктаэа пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования,П р и м е р 2. Культивирование штамма А, ад 11 е 525 проводят аналогично описанно-. му в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду 1.В, которая содержит в 1 л 10 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г йаС 1 идо 1 л воды,Выход биомассы 4 г/л культуральной жидкости,После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Аад 5251 1,9 х 10 ед/г биомассы.1648976 адержание рестриктазы в биомассе 5000-6000 ед, на 1 г сырой биомассы.Для изошизомера Аад 5251 - рестриктазы Са 1 выход очищенного фермента около 5 430 ед. на 1 г сырого веса биомассы.Выход очищенного фермента Аад 5251(1,7-1,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает известные цифры для Са 1 (430 ед).10 формула изобретенияШтамм бактерий АсЬгоаоЬастег адПеВКМ В- продуцент рестриктазы Аад 5251,Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251.Поиск новой рестриктазы проводился путем скрининга у 150 штаммов различных видов бактерий. Биомасса штамма А. адйе 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 - А Т 1 С 0 А Т, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: со 15 Составитель И, ПриваловаРедактор Л. Веселовская Техред М,Моргентал Корректор М. Шароши Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 Заказ 1499 Тираж 380 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5