Способ определения дегидрогеназ листьев чайного растения

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 91 1111 1 Х 33/48,(51 ррг(,р Р,13 т 1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ это ления шести дегидрогена ты дегидстения на гель, про ые препар тичн У 14но-производстваю и субтропич Бюле на окончан лава 8.8) е З.Нт, 6 ляемой ообщения 1, с. 30 ми, кат леотида- асителей ИДРОГЕНАЗ В ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕАИНОГО РАСТЕНИЯ етение относится нно к способам иидентификации дег йного растения. повышение информ тем одновременно олихия ферназзобе идрогЦельативн в и еде ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(21) 3804281 (22) 22. 10,8 (46) 15.04.8 (71) Всесоюз ное объедине ким культура (72) И.Л. Ве (53) 616.07( (56) Моргила АН ГССР. 197 рогеназ листьев чаиного раносят на полиакриламидныйводят электрофорез. Послеэлектрофореза гели инкубирферных растворах с рН 7,1++0,1 в зависимости от опредегидрогеназы с субстрактализаторами и пиридиновымими при 30-55 С, В качествеиспользуют нитросиний тетр(НСТ) в присутствии феназифата (ФМС). Раствор НСТ гостворяя в 1 мл воды 20 мгвор ФМС - в 1 мл воды 3 мгошивание ведут при 30-35 Сле чего окрашенные гели фи10%-ной уксусной кислоте,2,0 0,7 65 15 0,7 50 5 1 0,2 15 1,5 0,7 Изобретение относится к биохимии,а именно к способам изучения изоферментов, в частности к способамидентификации дегидрогеназ листьевчайного растения. 5Цель изобретения - повышение информативности способа за счет одновременного определения шести дегидрогеназ.Способ осуществляют следующим образом.Частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев чайного растениянаносят на полиакриламидный гель ипроводят электрофорез. После окончания электрофореза гели инкубируют вбуферных растворах с рН 7,1+0,18,65+0,1 в зависимости от определяемой дегидрогеназы с субстратами,катализаторами и пиридиновыми нуклеотидами при 30-55 С. В качестве красителей используют нитросиний тетразолий (НСТ) в присутствии феназинметальсуфата (ФМС),Раствор НСТ готовится растворением25в 1 мл воды 20 мг НСТ, раствор ФМСв 1 мл воды 3 мг ФМС. Окрашиваниепроисходит при 30-35 С в течение 37 ч, после чего окрашенные гели фиксируются в 107.-ной уксусной кислоте, ЗОП р и м е р 1. Определение изоцитратдегидрогеназы. Одним из известныхспособов получают суммарный препаратбелков и ферментов на геле и для избирательного окрашивания изоцитратдегидрогеназы препарат помещают в кювету с раствором, содержащим;Трис-НС 1 буфер 0,05 МрН 8,5, мл 50Изоцитрат натрия, мг 75 40МС 1(10 Х-ный водныйраствор), мл 0,2НАДФ , мг 10НСТ (20 мг на 1 млроды), млФМС (3 мг на 1 млводы), мл 0,7ои выдерживают в термостате при 35 Св течение 3 ч. Окрашенный препаратфиксируют в 103-ной уксусной кислоте,50 2Трис-НС 1 буфер О, 1 МрН 7,1, млГипоксантин 1 М, млНАД , мгНСТ (20 мг на 1 млводы), млФМС (3 мг на 1 млводы), мл выдерживают при 35 С в течение 7 ч,после чего фиксируют в 107-ной уксусной кислоте.П р и м е р 3. Определение альфаглицерофосфатдегидрогеназы,Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету сраствором, содержащим:Транс-НС 1 буфер 0,1 МрН 8,0, мл 50Альфа-глицерофосфатнатрия, мгНАД , мгНСТ (20 мг на 1 млводы), мл 1,5ФМС (3 мг на 1 млводы), мл выдерживают при 35 С в течение 7 ч, после чего фиксируют в 107-ной уксусной кислоте.П р и м е р 4. Определение лактатдегидрогеназы. Суммарный препарат белков и ферментов на геле помещают в кювету с раствором, содержащим: фосфатный буфер О, 1 МрН 7,4, млЛактат натрия 1 М, млИаС 1 (103-ный раствор), гМяС 1 (103-ный раствор), млНАД , мгНСТ (20 мг на 1 млводы), млФМС (3 мг на 1 млводы),мл выдерживают при 30 С в течение 7 ч. После чего фиксируют в 102-ной уксусной кислоте..П р и м е р 5Определение сорбитолдегидрогеназы. Суммарный препарат белков и ферментов на , еле помещают в кювету с раствором, содержащим:2,0 П р и м е р 2.Определение ксантиндегидрогеназы, Одним из известных способов получают суммарный препарат белков и ферментов на геле и для из 55 бирательного окрашивания ксантиндегидрогеназы препарат помещают в следующую среду: Транс-НС 1 буфер О, 1 МрН 8,65, млСорбитол, мгНАД , мгНСТ (20 мг на 1 млводы), мл1303937 Составитель Н. ГуляеваТехред И.Попович Корректор Л.Патай Редактор А, Ревин Заказ 1303/45 Тираж 777 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ФМС (3 мг на 1 млводы), мл 0,7овыдерживают при 35 С в течение 7 ч ификсируют в 107-ной уксусной кислоте.П р и м е р 6. Определение октанолдегидрогенаэы. Суммарный препаратбелков и ферментов на геле помещаютв кювету с раствором, содержащим:Транс-НС 1 буфер 0,1 МрН 8,5, мл 50 10Октанол, мл 2НАД, мг 25НСТ (20 мг на 1 млводы), мл 2,0ФМС (3 мг на 1 мл, воды), мл 0,7выдерживают 7 ч при 35 С и фиксируютв 107-ной чксчсной кислоте.Формула изобретенияСпособ определения дегидрогеназ 20листьев чайного растения путем получения частично очищенного препаратаферментов, нанесения его на полиакриламидный гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией всреде, содержащей буферный раствор,субстрат, нитросиний тетраэолий и феназинметасульфат и идентификациейферментов по окрашенным полосам нагеле, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения информативнос-,ти способа эа счет одновременногоопределения шести дегидрогеназ, приинкубации используют буферные растворы с рН 8,5+0,1, 7,1+О, 1; 8,0+0,1,7,4+О, 1; 8,65+0, 1 и 8,5+О, 1 для определения изоцитратдегидрогеназы, коантиндегидрогенаэы,-глицерофосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сорбитолдегидрогеиазы и октаиолдегидрогеназы соответствен-.но