Способ получения производных борсодержащих пептидов

,ВЕДОМСТВО СССР1 ГОСПАТЕНТ СССР) А 61 К 37/О 51)5, С 07 К 5 08,5/06,5/ гью АНИЕ ИЗО ЕТ.О К: ПАТЕНТ. 2 Изобретение относится к способу получения борсодержащих пептидов - новых биологически, активных соединений,которые могут найти применение в биохимии в. качестве ингибиторов трипсинподобных сериновых протеаз, например тромбин, калликреин плазмы и плазмин.Цель изобретения - способ получения новых производных пептидной природы, -чнь 1 х, обладающих болеющей активностью и бол ром действия,. растворы ь приготовлены без ис илизатора (органическо е вь 1 сокой ее, широкоторых пользоваго раствомалотокси ингибиру ким спект могут быт ния солюб рителя).Постабом полущих пепти вленная цель достигается спосоения производных борсодержадов общей формулы (1); (72) Шарлс Ейдриен Кеттнер (ОЯ) и Ашокку-(56) Патент США Ь 4318904,;.:; Реагент : амийН 2 ИСНВуНЖгде и " 3,4;. ,л. С 07 С 103/52; опублик. 1982. : Я и Я С, Вг; у=.остаток пинаконового илиОгцп й. др. ТЬгацЬ. Йез, 1985, 37, 145- . йинандйолового эфира, Реагент :;амийо- :, 153; :., : . : кйслота илй пептид Я 1-2-0 Н, где Й 1 и 2 ука "., Европейский патент 0181267,-: : . заны выше; Полученный йродукт формулыкл. А 61 К 37/02, опублик 1986; .: Я 1-2-ИНСЙДСН 2И Ву НЮ где й 1, Е, у,Шредер 3. и Любке К, Пептиды, ч. М. Я,Я и р Имеютзначейия, указаннЫввцйе, , " Мир, 1967, с. 116. -: , -";обрабатывают азидом 1 целочногюМталла.с. 3образованием:соединения, й 1-БЧН- . ,(54) .СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗБОД- - СНСН 2 лйзВуНФ которое восстанавлМ. НИХ БОРССДЕРЖАЩИХ ППТИДОВ -:: вают в присутствии органичеСкой илими 1 еральной кислогы, йрвдпочтительно: (57) Йспользование: в бйолотической и ме-: . бейзолсульфокислоты;собразованиемсое. Я,дицинской химии в качестве соединений,: :. ":,:(СН 2)лйН 2обладаю 1 ЦИхВыСоксй ангИбирующей актив- динения В 1-Е-ИНСН-Ву"Н 1)Ч, последнее;ностью; широким спектром действия, рас- . подвергают взаимодействию с цийамйдом втворы которых могут быть приготовлены безнизшем спирте при 50-150 ОС. Новые инги исйользования солюбилиэатора; Сущность,биторы. имеЮт значения К 10;7 мкм; облаизобретения:.пройзводные борсодержащих дают-:, протйвовоспалйтельйьгй: ипептидов общей ф-лы Й 1-2-МНСН(В 2)-Ву х обезболивающим действиемнаряду с укахНЮ,-где В 1-Н, Ас, Вк, Вос, Вас.ец; В 2- занными:эффектами; 1 б.табл.анализ осадка простым эфиром получают трифторацетат Н -ец - А 1 а - ОВг в виде кристаллического продукта (22,8 г).Элементный анализ для С 6 Н 258205 Ез,%:Вычислено; С 53,19, Н 6,21, М 6,89.Найдено: С 53,37, Н 5 68, й 6,84.Вос-С 1 у -ец - Аа-ОВг. получают реакцией сопряжения Вос - Иу - ОН (5,70 г, 32,6ммоль) с Нец-А 1 а-ОВг по методике смешанного ангидрида, описанной в примере2, Продукт(13,8 г) получают в виде аморфного твердого вещества. Вос(уец - А 1 аОВг деблокируют трифторуксуснойкислотой по методике, описанной для приготовления Нец-А 1 а-ОВг., за исключением того, что трифторацетатная соль можетбыть растворена в простом эфире. Продуктрастворяют в этилацетате и очищают без. водным хлористым водородом. После осаждения полученного продукта придобавлении простого эфира получают 7,7 гхлорида Нуец - А 1 а - ОВг 1 в первомсборе,Вос -ецу -ец - А 1 а - ОВг получаютсопряженной реакцией Вос -ец - ОН (2,62 г,10,5 ммоль) с Н - 61 уец - А 1 а - ОВг по методике получения смешанного ангидрида,описанной в примере 2, После кристаллизации полученного продукта из смеси этилацетат:гексан получают в первом сборе 2,7 гназванного продукта (т,пл. 95 - 96 С),Элементный анализ для С 29 Н 46 М 407,:Вычислено: С 61,89, Н 8,26. М 9,96.Найдено: С 62,00, Н 8.40, М 9,83.Восецу- ец-А 1 а-ОН получают каталитическим гидрированием сложногобензилового эфира (2,6 г, 4,62 ммоль) пометодике, описанной в примере 2, с выходом 2,1 г требуемого продукта, После кристаллизации полученного продукта изгорячего раствора этилацетата получают1,4 г вещества,Элементный анализ для С 22 Н 4 ой 407,:Вычислено: С 55,90, Н 8,55, М 11,86Найдено: С 55,42, Н 8,47, М 11,73,Вос.ец-бу 1.ец-А 1 а-йН - СКСН 2)зВг) Хх В 02-С 1 оН 16 получают реакцией сопряженияВос-(.ецуец-А 1 а - ОН (1.40 г, 2,96ммоль) с амином из примера 1,а по методике, описанной в примере 2. за исключениемтого, что не проводят хроматографическогоразделения. После кристаллизации продукта иэ смеси этилацетат:гексан получают 1,17г требуемого продукта. При ТСХ в системерастворителей метанол:хлороформ (1:9) отмечено единичное пятно при значении Ю0,68.Элементный дляСзбНбзМ 506 ВГВ, : Вычислено: С 55,10, Н 8,11, й 8,93. В1,38,Найдено: С 55,96, Н 8,30, й 8,74, В 1,33,Соответствующий азид получают по методике примера 3 с 97 выходом, которыйпревращают в Восецу - ец-Аа-бороОгп-СоН 16 согласно методу в примере 4.Аналитическую пробу приготавливают путем осаждения указанного продукта про 10 стым эфиром и хроматографическогоразделения его на колонке сНс последующим элюированием из смеси хлороформа с гексаном,Масс-спектроскопия (ГАВ) дляСЗ 6 Н 65 М 606 В:Вычислено: Н; 721,50.Найдено; 721,55.Бензолсульфонат ВосецуецАа-бороАг 9 - С 1 о-Ны получают по методи 20 ке, описанной в примере 5,Соответствующий бороорнитиновый пептид (0,695 г, 0,791 ммоль) подвергают взаимодействию с 5 мл раствора цианамида (50мг/мл) в абсолютном этаноле, После хрома 25 тографирования указанной смеси Й порошкования простым эфиром получают 0,41 гтребуемого продукта.Масс-спектроскопия (ГАВ) дляСз 7 Р 67 НвовВ:30 Вычислено: Н; 763,53Найдено: 763,8.П р и м е р 16. Бенэолсульфонат Н.ец 61 уец - Аа-бороАг 9 - С 1 оНм НС 1.. Бензолсульфонат Восецу.ец 35 Аа - бороАг 9-С 1 оН 16, полученный в примере15 (0,050 г, 0,0543 ммоль), подвергают взаимодействию с 2 мл 4 н.хлороводорода в диоксане в течение. 5.мин при комнатнойтемпературе, Растворитель и избыток НС40 удаляют упариванием. Полученную пробу вы-сушивают над гидроксидом калия в вакуумев течение ночи, а затем после порошкованияпростым эфиром получают требуемый продукт (46 мг) в виде смешанной соли,45 Масс-спектроскопия (ГАВ) дляСЗ 2 Н 59 Ивобв:Вычислено+Н; 663,47.Найдено: 663,50.П р и м е р 17, Бензолсульфонат Вг - Эц 50 (ОВц) - Иу - бороАг 9 - СюНб,Вг - 61 ц-(ОВц)-6 уй Н-СН - СН 2)зВг)В 02- СюН б получают сопряженной реакцией Вг 6 ц-(ОВц) - Ву-ОН с укаэанным амином пометодике, описанной в примере 2, Соответ 55 ствующий азид получают в соответствии сметодом, описанным в примере 3, а бороорнитиновый пептид получен по методикепримера 4,Масс-спектроскопия (ГАВ) дляС 32 Н 49 Й 407 В;Вычислено Н: 613,38,Найдено: 613,60.Конечный продукт получают по методике, описанной в примере 5,Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляСззн 51 М 607 В;Вычислено Н: 655,40,Найдено: 655,37,Элементный анализ дляС 39 Н 57 ч 6010 ЯВ, %,Вычислено: С 57,62, Н 7,08, й 10,34, В1,33.Найдено; С 57,43, Н 7,25, ч 9,91, В 1,23.П р и м е р 18. Бензолсульфонат ВгивОу - бороАгд - С 1 оН 16.Бензолсульфонат Вг - 6 а-(ОВо) - 6 у -бороАгд - С 1 оН 16 (0,13 г, 0,16 ммоль) растворяют в 5 мл диоксана, прибавляютбензолсульфокислоту (0,10 г, 0,66 ммоль) иреакционный раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, После концентрации раствора до объемапримерно 1 мл путем упаривания с последующим порошкованием простым эфиромполучают твердое вещество (0,14 г), Полученный продукт хроматографируют на 2,5х 50 см колонке сНв метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, упаривают, а осадок порошкуют простымэфиром с выходом 53 г названного продукта.Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 29 Н 43 М 607 В:Вычислено Н: 599.34.Найдено: 599,35, 613,36 (не идентифицирован),П р и м е р 18,а. Бензолсульфонат Вг -Иц-бороАгд - С 1 оН 16.Бензолсульфонат Вго - (ОВо) - 6 у -бороАгд - С 1 оН 16 (пример 17, 0,20 г, 0,246. ммоль) обрабатывают безводным хлористым водородом по методике, описанной впримере 6, в течение 45 мин, После порошкования указанного продукта данные ЯМРпоказывают, что примерно 30% трет-бутиловой защитной группы все еще находитсяв указанном продукте. Затем продукт подвергают взаимодействию с безводной триф торуксусной кислотой в течение 45 мин прикомнатной температуре, ТЕА удаляют упариванием и после порошкования полученного осадка простым эфиром получают 143мг названного продукта.Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 29 Р 43 ч 607 В:Вычислено Н: 599,34,Найдено: 599,35. П р и м е р 19. Бензолсульфонат Вг-Рго -РЬе-бороАгд-С 1 оН 16.40 для 45 содержащую 4 мл 0,50 н. трихлорида бора,полученного путем разбавления 1 н. трихлорида бора (АбгсЬ Саетса СоМаапКее, Ю) до 50% сухим хлористым метиленом, и помещенную на баню с сухим льдом. Рас твор перемешивают при -178 С в течение 5мин, затем колбу помещают на баню с льдом (О С), где раствор перемешивают в течение 15 мин. В реакционный раствор медленно прибавляют(5 мл) холодной воды с последующим разбавлением его до 120 мл 20%-ой уксусной кислотой, Органическую фазу отделяют и извлекают продукт. Водную фазу наносят на колонку объемом 20 мл на ЯР-Сефадексе, уравновешенную 20%-ой уксус 10 15 20 25 30 35 Вг Рго - Рпе - ОН (т,пл, 200-201 С) получают по методике, описанной в примере 2,используемой для синтеза дипептидов, Элементный анализ для С 21 Н 22 М 204, %: Вычислено: С 68,82, Н 6,06, й 7,65. Найдено: С 68,91, Н 6,09, й 7,47. Вг-Рго - РЬе - М Н - СН(СН 2)ЗВгВ 02 - С 1 оН 16получают сопряженной реакцией Вг-Рго -Р 1 е - ОН с указанным амином по общемуметоду, описанному в примере 2, за исключением того, что хроматографическое разделение не осуществляют. При ТСХ в смесирастворителей метанол:хлороформ (1:9) наблюдается обширное пятно при В 1 0,72 иследы при 81 0,86. Масс-спектроскопия (ЕАВ)С 35 Н 45 Й 305 В Вг; Вычислено Н: 678,27. Найдено; 677,95. Полученный алкилгалогенид превращают в азид и бороорнитиновый пептид пометодике, описанной в примерах 3 и 4, Масс-спектроскопия (ЕАВ) для (Вг - РгоР 1 е - бороОгп - С 1 оН 16)-Сз 5 Н 47%05 В: Вычислено Н; 615,37, Найдено; 615,42. Целевой бензолсульфонат Вг - Рго - РЬебороАгд - С 1 оН 16 получают по методике, описанной в примере 5, Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 36 Н 49605 Я В: Вычислено Н: 657,39. Найдено; 657,13. Элементный анализ для С 42 Н 55 Й 606 ЯВ,%. Вычислено: С 61,90, Н 6,82, М 10,31, В1,33, Найдено: С 60,16, Н 7,27, М 9,79, В 1,44. П р и м е р 20, Хлорид Вг-Рго-Р 1 е-бороАгд-ОН. Бензолсульфонат Вг-Рго-РЬе-бороАгд - С 10 Н 16 (соединение примера 19, 0,64 г, 0,79 ммоль) растворяют в 4 мл хлористого метилена и охлаждают до -78 С. Реакционную смесь сливают в колбу,для Р ной кислотой, Колонку промывают примерно 150 мл раствора 20%-ой уксусной кислоты с последующим установлением линейного градиента концентраций от 200 мл 20%-ой уксусной кислоты до 200 мл 20%- ой уксусной кислоты, содержащей 0.30 н. НС 1, Продукт элюируют при концентрации НО в интервале 0,08 - 0,15 н. После упаривания растворителя, высушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (0,19 г),Масс - спектроскопия (ЕАВ) для С 26 Н 35 Й 6058:Вычислено Н: 523,29,Найдено; 579,34 (не идентифицирован).Элементный анализ для С 26 НзбЙ 605 С 18, %:,Вычислено: С 53,29, Н 6.55, Й 14,34, В 1,84,Найдено: С 53,27, Н 6,58, Й 13,25, В 1,89.При этерификации названного продукта пинандиолом по методике, описанной в примере 8,а, получают продукт, свойства которого при ЯМР и МС совпадают с исходным сложным эфиром примера 19.Масс-спектроскопия (ЕАВ) для СзбН 49 Й 6058:Вычислено Н: 657,40.Найдено: 657,39,П р и м е р 21. Хлористоводсродная соль Вд-Рго-Р 1 е-бороАг 9-Е,Вх-Рго - Рбе - ЙН - СН 1(СНфйН-С(Й Н)ЙН 2) х В Е 2 Н С 1.Вк-Рго-РЬе-бороАг 9-Е.Свободную бороновую кислоту (соединение примера 20, 0,100 г. 0,179 ммоль) растворяют в 2 мл воды, К полученному раствору прибавляют 0,040 мл 48%-ой фтористоводородной кислоты при комнатной температуре, Почти сразу же образуется смолистообразный преципитат. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, затем замораживают и в вакууме удаляют избыток фтористоводородной кислоты и воду, Остаток растворяют в метаноле, концентрируют и порошкуют простым эфиром. Выход составляет 0,093 г требуемого продукта.Масс-спектроскопия (ЕАВ) для С 26 НЗЗЙ 6038 Е 2:Вычислено Н: 527,29.Найдено: 527,31 и дополнительные значения масс, характерных для свободной бороновой кислоты.Элементный анализС 26 Н 34 Й 60 ЗВ Е 2 С 1 Н 20, %:Вычислено: С 53.47, Н 6,25, И 14,47, В 1,86, Е 6,54.Найдено: С 54.00, Н 6.40, Й 13,48, В 1,95, Е 7,06. П р и м е р 22, Вос-.А 1 а-РЬе(ОЛ)боро 1 уз-СбН иНС.Вос-А а-РЬе-ЙН-СН(СН 2)4 ЙН 2)802 - С 6 Н 12"хбензолсульфокислота.5 Продукт Вос-А 1 а - РЬе-ЙН -СНИСН 2)48 г 802-С 6 Н 12 превращают в алкилазид по методике, описанной в примере 3,за исключением того, что для очистки пол.ученного продукта не требуется хроматог 10 рафии на колонке с 1 Н. Полученный аэидгидрируют по методике примера 4 за исключением того, что берут 2 эквивалента бензолсульфокислоты, а гидрирование проводят втечение 2 ч, Получают конечный продукт при15 40% выходе (т.пл. 154-160 С, разложение).Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 28 Н 46 Й 40 6 8:Вычислено: Н: 547,38.Найдено: 547,43,20 П р и м е р 23. Трифторацетат-бензолсул ьфонат Н-Аа - Рпе-(0.1)боро 1 уз -СбН 12Бензолсульфонат Вос - Аа - РЬе-(ОЯ.боро 1 уз-С 6 Н 12 подвергают взаимодействию с25 трифторуксусной кислотой в течение 1 ч прикомнатной температуре. После упариваниярастворителя и порошкования осадка простым эфиром получают требуемый продуктв виде твердого вещества,30 Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 23 Н 39 Й 4048х Вычислено+Н: 447,31,Найдено: 447,31,Элементный анализ для35 Сз 1 Н 46 Й 409 ЯЕзВ 2 Н 20, %:Вычислено; С 49,34, Н 6,68, Й 7,42, В1.43.Найдено; С 49,26, Н 5,94, Й 7,12, В 1,34,П р и м е р 24, Бензолсульфонат Вос -40 (0)ЧаН ец - боро 1.уз-СбН 12,Вос-(Э)Ча 1-1 ео-ОН получают по методике, описанной в примере 2. Сложный бензиловый эфир получен с 76% выходом,Масс-спектро копия (ЕАВ) для45 С 23 Нзбй 205;Вычислено Н: 421,27.Найдено: 421,38,После гидрирования получают свободную барную кислоту с 100% выходом в виде50 кристаллического твердого вещества белогоцвета,Элементный анализ для С 16 Н 29 Й 205, %:Вычислено: С 59.34, Н 8,87, Й 8,50,Найдено; С 59,34, Н 8,87, Й 8,50,55 Вос-(0)Чаец-ОН связывают с амином, полученным в примере 1,в, используемой для пептидного связыванияВос - Аа - РЬе - ОН с выходом Вос - (0)Ча -1.ец-ЙН-СНСН 2)48 г)802-С 6 Н 2 с выходом97%.1807988 бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия, Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрия и после фильтрования и 5 упаривания получают кристаллический продукт, После выделения и промывания этилацетатом получают 3,26 г соединения, т,пл, 176-177 С.Элементный анализ для С 17 Н 25 МОЗВгВ, 10 %: Масс-спектроскопия (ГАВ) для С 27 Н 531 ч 406 В;Вычислено Н: 541,41.Найдено: 541,46, 15Элементный анализ для С 33 Н 59 М 409 ЯВ 1,5 Н 20, %:Вычислено: С 54,62, Н 8,61, К 7,73, В 1,49.Найдено: С 54,58, Н 8,59, й 7,92, В 1,98. 20П р и м е р 25. Бензолсульфонат Ас-РЬе -Боро 1 уэ - С 6 Н 12Продукт примера 25 получают по методике, описанной в примере 22.Ас - РЬе - МН-СН(СН 2)4 ВгВ 02 - С 6 Н 12 получен с 72% выходом.Масс-спектроскопия (ГАВ) для С 22 Н 348204 В В г:Вычислено Н: 481,00.Найдено; 481,21. 30Азид получен с 57% выходом, Конечный продукт получают при 50% его выходе,Масс-спектроскопия (ГАВ) для. С 22 Н 37 М 304 В;Вычислено Н: 418,29.Найдено: 418,31.Элементный анализ для С 29 Н 42 Й 307 ЯВ Н 20, %: 25 35 Вычислено: С 5 б,бб, Н 7,47, й 7,08, В 401,82.Найдено: С 56,88, Н 7,47, К 7,22, В 1,53.П р и м е р 26. В-(О.ЦЬогог 9 - С 6 Н 12 ХХНВг,45 В 2 - (0,1 )М Н СНСН 2)з В г)В 02 - С 6 Н 12 получают путем взаимодействия амина, полученного в примере 1,в (5 г, 15,9 ммоль), с эквивалентным количеством бикарбоната натрия в смеси, состоящей иэ 4 мл диоксана 50 и 4 мл воды при 0 С, После первоначального перемешивания реагентов реакционную смесь разбавляют б мл раствора иэ 50% диоксана с водой и нагревают до комнатной температуры, Реакционную смесь переме шивают в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим экстрагированием ее в этилацетате и промыванием водой, 0,2 н. НО, 5-ым водным раствором Масс-спектроскопия (РАВ) для С 27 Н 518306 В В г;Вычислено Н: 604,31.Найдено; 604,31.Полученный алкилбромид превращают в соответствующий азид при 85% выходе по методике, описанной в примере 3, с последующим его гидрированием, Конечный продукт получают в виде белого твердого вещества с 62% выходом,Вычислено; С 53,44, Н 6,59, И 3,67, В2,83.Найдено: С 54,50, Н 6,76, й 3,68, В 2,84,Полученный алкилгалогенид (1 г, .2,62ммол ь) превращают в соответствующуюсоль изотиорония. Требуемый продукт 0,84г получен в виде твердого вещества белогоцвета.Масс-спектроскопия (ГАВ) дляС 18 Н 28 ЙЗОЗЯ В;Вычислено Н: 378,20,Найдено: 378,21.Элементный анализ дляС 18 Н 29 йзОЗЯВВГ, %:Вычислено: С 47,18, Н 6,38, М 9,17, В2,36,Найдено: С 46,11, Н 6,71, М 8,97, В 2,22.П р и м е р 27, ЬенэолсульфонатВг(0 Л.) ба роАгц - С 6 Н 12.Алкилгалогенид(полученный в примере26, 2 г, 5,25 ммоль) превращают в азид (0,97г, т,пл, 138 - 139 С) по методике, описаннойв примере 3. Полученный аэид превращаютбензолсульфонат В-бороОгп - С 6 Н 12 по методике примера 4 при почти количественном выходе.Масс-спектроскопия (РАВ) дляС 18 Н 27 И 20 ЗВ:В ычислено Н: 319,22.Найдено 319 26Бензолсульфонат В 2-бороОгп - С 6 Н 12П р и м е р 28. Бензолсульфонат Ас- ец - ТЬОВц) - бороАгд-С 1 оН 16.Ас -ец-ТЬг(ОВц) - ОН получают путем связывания Ас- ец-ОЯц с Н-ТЬг(ОВц)-ОН по методике, описанной в примере 12, для дипептидного синтеза за исключением того, что конечный продукт получают в виде белого аморфного твердого вещества после хроматографии на колонке с .Н, Асец-ТЬг(ОВц)-ОН (3,29 г, 9,90 ммоль) подвергают сопряженному взаимодействию с амином (пример 1,а) по методике получения смешанного ангидрида. описанной в примере 2, за исключением того, что не нужно проводить хроматографию на колонке с .Н-го,Ас -ец - ТЬг(ОВо)-ИН-СН(СН 2)3 Вг 1 ВОгС 1 оН 16 получают в виде аморфного твердого вещества белого цвета с выходом 5,39 г, Полученный алкилгалогенид превращают в соответствующий азид с 82% выходом по методике примера 3 за исключением того, что для последующей очистки нет необходимости в проведении хроматографии, Полученный азид (3;88 г, 6.42 ммоль) гидрируют по методике, описанной в примере 4. Бензолсульфонат Ас -ец-Т 1 г - (ОВц) - бороОгпС 1 оН 16 получают 74% выходом после хроматографии на колонке сНи порошкования простым эфиром,Масс-спектроскопия (ГАВ) для С 30 Н 55 Й 406 В:Вычислено Н: 579, 43,Найдено: 579,48.Бороорнитиновый пептид превращают в конечный продукт с выходом его 86% по методике примера 5,Масс-спектроскопия (ГАВ) для С 31 Н 57 Й 606 В:Вычислено Н: 621,45,Найдено: 621,50.Элементный анализ для С 37 НбзйбЯ 09 В, %:Вычислено: С 57,05, Н 8,17. И 10,79, В 1,39,Найдено: С 56,47, Н 8,01, й 10,93, В 1,34.П р и м е р 29. Бензолсульфонат Ас -ео -ТЬ-бороАгд - С 1 оН 16Бензолсульфонэт Ас- ец-ТЬг-(ОВо)- бороАгд-С 1 оН 16 (пример 28. 0.200 г, 0,257 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл хлористого метилена и 2 мл 4 н, НС:диоксан, затем полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Рэстворитель упэривают в вакууме, а полученный осадок сушат в высоком вакууме. Требуемый продукт получают в виде белого твердого вещества с 97% выходом после порошковэния простым эфиром.колонке сН, После гидрирования по методике примера 4, хроматографии на колонке сНи порошкования простым эфиром получают бензолсульфонат Ас уз(Вос) - Рго-бороОгп - С 1 оН 16 с выходом 20 81 о/Масс-спектроскопия (ГАВ для С 32 Н 558507 В,Вычислено Н: 634,43,Найдено: 634,46,Бороорнитиновый пептИд (2,0 г, 2,53 ммоль) подвергают взаимодействию с цианэмидом по методике примера 5 с выходом 1,8 г требуемого продукта в виде твердого вещества белого цвета. 25 30 Масс-спектроскопия (ГАВ) дляСЗЗН 57 М 707 В:Вычислено Н; 676,46.Найдено: 676,41,Элементный анализ 35 для С 39 Н 63 Й 7010 ВЗ %:Вычислено: С 56,23, Н 7,64, й 11,77, В 1,30.Найдено; С 56,06, Н 7,48, ч 11,75, В 1,22.П р и м е р 31.,Ас- уз-Рго-бороАгдС 10 Н 162 Н СБензолсульфонэт Ас- уз(Вос) - Рго-бороАгд-С 1 оН 16 (пример 30, 0,30 г, 0,360 ммоль) подвергают взаимодействию со смесью, состоящей из ледяной уксусной 50 кислоты с 4 н, НС и диоксана в соотношении 50:50 (%); в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают, а остаток сушат в вакууме, Полученный осадок растворяют в воде и пропускают через 5 мл колонку на А 01-Х 8(С - форма). Полученную пробу упаривают и после порошкования остатка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества белого цвета (230 мг),Масс-спектроскопия (ГАВ) дляС 27 Н 49 Мбобв;Вычислено Н: 565,39,Найдено: 565,48,П р и м е р 30, Бензолсульфонат Ас -уз(Вос)-Рго-бороАгд-С 1 оН 16.Дипептид Ас -ус(Вос) - Рго-ОН получают по методике, описанной в примере 13.После кристаллизации из этилацетата пол 10 учают указанный продукт в виде белоготвердого вещества (т,пл. 160 - 161,5 С). Указанный дипептид Ас - .уз(Вос) - Рго - ОН(3,15 г. 8,18 ммоль) подвергают сопряженной реакции с амином (пример 1,а) по мето 15 дике, описанной в примере 2, Полученныйпродукт(5,8 г) используют без дополнительной очистки. Полученное соединение пре. вращают в азид по методике примера 3 свыходом его 73% после хроматографии наМасс-спектроскопия (ГАВ) дляС 28 Н 49 Й 703 В:Вычислено Н: 576,40.Найдено: 576,45, 5П р и м е р 32, Бензолсульфонат Ас-А 1 а 6 ц(ОВц) - бороАг 9 - С 1 оН 16.Ас - А 1 ац(ОВц)-ОН получают путемсвязывания Ас-Аа - ОЯц с Н - 61 ц(ОВц) - ОНпо методике примера 13. Продукт выкристаллиэовывают из смеси зтилацетат:гексан(т,пл, 147,5-148 С),Элементный анализ для С 14 Н 24 й 20 б, о :Вычислено: С 53,14, Н 7,66, И 8,85.Найдено: С 53,28, Н 7,53, й 9,08. 15Ас-Аа - 61 ц(ОВ ц)-й Н - СНСН 2)зВгВ 02 -С 1 оН 1 б получают по методике примера 2 заисключением того, что вместо зтилацетатаиспользуют хлороформ для отделения органического слоя на начальной стадии реакции и не проводят хроматографии наколонке с Н. После упаривания органического слоя получают 87 выхода требуемого и родукта в виде частичнокристаллического твердого вещества. Алкилбромид превращают в азид по методике,описанной в примере 3, Целевой продукт(т,пл. 165-166 С) получен с 50 выходомпосле кристаллизации неочищенного продукта из хлороформа, 30Элементный. анализ для С 28 Н 47 йб 07 В,;.Вычислено; С 53,51, Н 7,55, Й 6,69, В1,73.Найдено: С 55,51, Н 7,50, М 6.50, В 1,66. 35Бороорнитиновый пептид получают пометодике примера 4 с 79 выходом требуемого продукта.Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 28 Н 49 Й 407 В; 40Вычислено +Н: 565,38.Найдено: 565,51.Конечный продукт получают в видетвердого аморфного вещества белого цветас выходом 70 опо методике примера 5. 45Масс-спектроскопия для С 29 НбйбОтВ:Вычислено Н: 607.40.Найдено: 607,41.Элементный анализ дляСэ 5 Н 57 йб 01 бВЯ,; 50Вычислено: С 54,96; Н 7.53, М 10,99, В1,41.Найдено: С 54,36. Н 7,71, й 11,27, В 1,21,П р и м е р 33. Бензолсульфонат Ас-А 1 а 61 ц-бороАгд - С 1 ОН 1 б, 55бензолсульфонат Ас-А 1 ац(Вц)-бо- роАГЯ-С 10 Н 16 (пример 32. 0.10 г. 0,131 ммоль) растворяют в 10 мл уксусной кислоты, через полученный раствор в течение 20 мин пропускают хлороводород. Затем раствор леремешивэют в течение 1.5 ч при комнатной температуре и после упаривэния растворителя получают масло. Требуемый продуктполучают в виде твердого белого вещества (82 мг) после просушивания в вакууме и порошкования простым эфиром,Масс-спектроскопия (гАВ) для С 25 Н 4 зйб 07 В;Вычислено Н; 551,34.Найдено: 551,41.Используя аналогичные методы, которые описаны в примерах 22 и 23, получены дополнительно соединения (см. табл. 16).Проведены биологические испытания соединений, полученных описываемым способом.Показано, что все эти соединения могутбыть отнесены к категории малотоксичных веществ. Ингибиция калликреина плазмы человеческой кровиКаллекреин плазмы человека получают из протогена АГ (А 6), поставляемого из Швейцарии. Специфическая активность, как описывает поставщик, составляет 15 единицна мг. 1 единица определена как количествофермента, необходимого для гидролиза 1 мкмоль субстрата, Н-(Р)Рго-РЬе - Аг 9-паранитроанилина,(КаЬ 52302), эа минуту при концентрации субстрата 0,50 мМ при 25 С в 50 мМ калий-фосфатном буфере. рН 8.Маточный раствор фермента 1 ед/мл приготавливают в 50 о -глицерин - 0,1 М натрийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлористого натрия и 0,1 ополизтиленгликоля 6000 (РЕ 6), В стандартных испытаниях 10 мкл основного раствора кэлликреинэ прибавляют к 990 мкл раствора, содержащего 0,20 мМ Н-(Р)Рго-РЬеАгц-пара-нитроанилида 32302 в 0,10 мМ натрийфосфатного буфера, рН 7;5, в состав которого входит 0,20 М хлорида натрия и 0,1 РЕ 6, при 25 С, Действие ингибиторов оценивают при регистрации ферментативной активности, определяемой при измеренииповышения интенсивности поглощения при 405 нм по времени как в присутствии, так и в отсутствии ингибиторов. В табл, 1 приведены уровни ингибиторов и активность, замеренные в интервале 10-20 мин после стимуляции активности. Активность контрольных ингибиторов составляет 0,0092 0,0095 мин,В табл. 1 показана биологическая активность ингибиторов калликреина плазмы крови человека.Из табл. 1 следует, что укаэанные ингибиторы имеют значения К0,7 мкм. Наиболее эффективным синтетическимобратимодействующим ингибитором является 6-амидино-(4-амидинофенил)-бензо/Р/тиофен, имеющий значение К = 0,7 мкм,Таким образом, приведенные в табл, 1соединения являются более активными ингибиторами каллекреина, чем известноепроизводное бензо//3/тиофена.Кроме участия в коагуляции крови калликреин высвобождает брадикинин из белковых субстратов. Брадикинин повышает 10васкулярную проницаемость, оказывает хемотактическое действие на лейкоциты и вызывает боль, Первые два вида активностисвязаны с воспалением. Поэтому предполагается, что ингибирование калликреина име- "5ет противовоспэлительный иобезболивающий эффект,Соединения по изобретению были испытаны также в отношении ингибированиятромбина.Ингибиция тромбина (зстеразная активность).Тромбин человека (специфическая активность 2345 Й)Н ед/мг) получают из Я, С),Р. (эЬогатог)ез, ЯоцФ Вепс), Ю( от НТ 102), 25Маточный раствор тромбинэ готовят в 0,01М Р(РЕЯ-буфере, рН 6, содержащем 0,75 М.хлорида натрия, Анализ тромбина проводятв натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М натрийхлорида и 0,1% РЕ 6-.306000, Исходная концентрация субстратасоставляет 0,10 мМ, а концентрация тромбина составляет 1,0 НМ в расчете на массу,В табл. 2 приведены уровни ингибиторов и активность, измеренная в интервале 3510-20 мин после стимуляции реакции, Ак-тивность тромбина для контрольной группысоставляет 0,0076-0,0005 минРезультаты приведены в табл. 2.Биологические данные, представленные 40втабл, 2, подтверждают превосходство соединений в соответствии с описываемым изобретением над известным соединениемМ-альфа-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-4-эмидинофенилаланинпиперидин, Хотя и данные в табл. 2 не выражены в виде значенийКь но все-таки возможно определить значения К на основе данных, представленных втабл. 2. Значение К определяется как концентрация ингибитора, требуемая для 50 50ингибирования фермента в отсутствии субстрата. Присутствие субстрата, напримертромбина, имеет защитный эффект на фермент, Из данных, представленных в табл. 2,следует, что все испытанные соединения 55имеют значение К ниже 6 нМ. Для следующих соединений значения К) были определены методом Лайнуиеера иБрука после установления равновесия ферментэ и ингибитора при рН 7,5. К 1(конечная конц.)Эти соединения, включающие Ас-А)а - (3)о-ЬогоАгц-С 10 Н 16, которое обладает значением К (конечной концентрации) 10 нМ, т.е. значением, которое считается примерно равным К 6, превосходят сравнительное соединение еще по той причине, что их можно вводить без применения органического растворителя-солюбилизатора.В случае пептидов - производных бороновой кислоты, растворимость которых 1- 50 мг/мл. органического растворителя-солюбилизатора не требуется.Ингибиция свертываемости крови, проявляемая при определении АРТТ и РТ.Эффект ингибиторов протеазы на свертываемость крови )и ч)гто определяют путем измерения их действия по двум разным клиническим параметрам, времени частичного активированного тромбопластина (АРТТ) и. времени протромбина (РТ). Реагенты для каждого из указанных анализов поставляет Оепега Р)адпозбсз, )еззцр МО. Маточные растворы ингибиторов готовят в 25 мМ НЕРЕЯ-буфере, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия, Для АРТТ-анализа, раствор ингибиторэ (0,100 мл) инкубируют обычной человеческой плазмой крови (0,100 мл) и спонтанным реагентом АРТТ (0,100 мл). После инкубирования в течение 5 мин при 37 С к указанному раствору прибавляют хлорид кальция (0,100 мл) и время свертываемости, измеренное в секундах, определяют на фиброскопе, В табл, 3 приведены данные влияния различных концентраций ингибитора на время свертываемости крови по сравнению с временем свертывания крови контрольных групп, установленным при отсутствии ингибитора,Для РТ-анализа растворы ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычно плазмой крови человека (0,100 мл) в течение 2 мин при 37 С, Затем к инкубированному раствору прибавляют симпластиновый реагент (0,200 мл) и определяют время свертываемости крови, приведенные в табл. 4,10 Стабильность ингибиторов в человеческой плазме, определенная при АРТТ,Стабильность ингибиторов в плазме оценивают по их способности ингибировать свертываемость крови. В первую очередь, основные растворы (1 мкМ) ингибиторов, подлежащих испытанию, которые приготовлены в 25 мл НЕРЕЯ-буФера. рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия, разбавляют до 50 обычной плазмой крови человека. Смеси готовят при 0 С, затем аликвоты (0,200 мл) отбирают и инкубируют в течение 50 55 В табл, 5 приведены суммарные данныерезультатов. представленных в табл, 3 и 4,показывающие расчетные концентрации ингибитора, необходимого для увеличениявремени частично активированного тромбоплатина (2 хАРТТ) и времени протромбина(2 хРТ) в два раза,Соединение, Название ингибитораобозначенное в табл.3 - 5, 7-10А Вос-(О)РЬе-Рго-ЬогоАгд-СюНиВ Н-(О)РЬе-Рго-ЬогоАгд-СюН 16С Вос-(О)РЬе-РЬз-ЬогоАпд-С 0 Н 1 бО . Ас-РЬе-ЬогоАгд-С 1 сН ы 15Ингибиция свертываемости крови, установленная при определении (ТТ)(временитромбина).Действие ингибитора протеазы Ас-(О)РЬе-Рго-бороАгд - ОН на свертывание крови 1 п ч 1 го определяют путем измерения еговлияния на тромбиновое время (ТТ). Смесь,состоящую из 0,2 мл обычной кроличьейплазмы и 0,05 мл буфера, содержащего ингибитор в 6-кратном количестве требуемой 25конечной концентрации, нагревают до 37 С,Свертываемость крови стимулируют путемвведения тромбина (0,05 мл в 6-кратном количестве конечной концентрации), Используемый тромбин закупают от Я 1 дта 30СЬее 1 са Совр. (НТ, активность 1190ЮН ед/на мг белка) и готовят в буфере.Используемый как для ингибитора, так итромбйна буфер представляет собой 0,1 Мтрис-буфер (12,10 г/л), содержащий 0,154 М 35йаС 1 (8,84 г/л) и 2,5 мг/мл сывороточногобычьего альбумина. рН 7,4. Тромбиновоевремя, измеряемое в секундах, определяютна фиброскопе. 8 табл, 6 представлены данные влияния ингибитора на время свертывания крови по сравнению с временемсвертываемости контрольной группы без испбльзования ингибиторов, Показатели эффекта представляют усредненное значениекак минимум трех замеров. Если реакция 45свертываемости не происходит в течениеЗОО с, то ее прекращают. 2 мин при 37"С, Прибавляют одинаковый объем спонтанно-приготовленного реагента АРТТ и замеряют время свертывания крови, как описано в примерах на с. 49, Конечная концентрация ингибитора в течение анализа свертывания крови составляет 250 нМ, Инкубационное время, приведенное в часах, и время свертывания, замеряемое в секундах, для каждого ингибитора приведены в табл. 7. Показатели стабильности для соединений Е и Р определены одновременно с контрольной группой, Показатели для соединений А, В получены на другой день,Стабильность ингибиторов в буферном растворе,Ингибиторы, каждый при концентрации 1 мкМ, инкубируют при комнатной температуре в 0,20 М натрий-фосфатном буфере,рН 7,5, содержащем 0,20 М хлорида натрия и 0,100 РЕ 6, Затем отбирают, аликвоты (4 мкл) и анализируют на тромбиновую пробу, В табл. 8 приведены данные тромбиновой активности, (в %), сохраняющейся после инкубации, и продолжительность нахождения в нэтрий-фосфатном буфере испытуемых ингибиторов. В случае использования ингибитора А имеется незначительная потеря ингибиторной активности. Ингибитор В теряет свою биологическую активность в течение часа.Ингибирование свертывания крови после перорального приема ингибиторов 1 и ч 1 чо.Самки. крыс (Яргэдце Оаччеу СОВатз, весом 130 - 140 г, предоставленные СЬаг 1 ез Тчег 1 аЬз, 1 пз, чч 11 а 1 пд 1 оп МА) энестезируют пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно). На вентральной поверхности шеи выполняют срединный надрез и в одну иэ каротидных артерий вводят полиэтиленовый катетер с выведением его у тыльной части шеи, После выведения крысы из состояния наркоза контрольные пробы крови берут из введенного в каротидную артерию катетера, производят антикоагуляцию цитратом натрия и центрифугируют (2000 х об/м, 10 мин.). Плазму переносят в пластиковые пробирки и выдерживают на льду до их анализа. Тромбиновое время определяют в фиброскопе.Крысы получают протеаэный ингибитор Ас - (О)РЬе - Рго-бороАгд-ОН в носителе либо только носитель через желудочный зонд в обьеме менее 4 мл, В качестве носителя используют 5% диметилсульфоксид в физиологическом растворе. Пробы крови берут в разное время после орального приема, которые анализируют как описано выше, В табл.9 приведены полученные данные временисвертывания крови в секундах, В случае, когда время свертывания крови превышает 300 с, в таблице указано как300. Остальные данные показывают среднее время, необходимое для коагуляции, 5 , измеренное в секундах, + означает стандартное отклонение от нормы.Ингибицияи чиччо коагулирования крови после перорального приема ингибитора. 10 Для дополнительной демонстрации способности данного соединения ингибировать свертываемость крови 1 п ч 1 чо, крыс анестезируют пентобарбиталом натрия (50 15 мг/кг, внутрибрюшинно); после чего в яремную вену вставляют катетер и отверстие закрывают, После выведения крыс иэ наркоза перорально вводят либо 5 мг/кг ингибитора и ротеаэы, Ас - (О) Р Ье - Рго-бароАгд-О Н, 20 растворенный в воде, либо равный объем воды. Через 30 - 60 мин всем крысам вливают 500 ед/кг тромбина в течение 1 мин, Все 14 крыс, получающие только воду, погибли в течение 10 мин после вливания тромбина, 25В противоположность этому только 8 из 17 . крыс, получившие ингибиторсодержащую воду, погибли в течение 10 мин, а оставши-, еся жили 1 ч и в это время их усыпили.Ингибицияи чача свертываемости кро ви после перорэльного местного и ректального приема.Общая методика: самцы крыс 1 ечч 1 з весом 300-350 г анестезируют пентобарбитолом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно) и в 35 яремную вену вставляют силастиковую канюлю, прикрепленную к полиэтиленовой .трубке 50, Указанную трубку выводят наружу у тыльной части шеи и прикрепляют к шприцу через стопорный вентиль, Пробы 40 крови (0,5 мл) набирают в шприц, который промыт цитратным буфером до каждого забора крови перед и через разные промежутки времени после приема ингибитора протеазы Ас-(0)РЬе - Рго-бороАгд-ОН, За тем пробы крови переносят в герметичные емкости, содержащие цитратный буфер, Кроме того, после каждого забора крови канюлю промывают физиологическим раствором. Затем пробы крови центрифугируют 50 (2500 об/мин в течение 15 мин) и для измерения времени коагуляции используют 0,2 млпроб плазмы. Измерения времени свертываемости крови проводят на фиброскопе, как описано ниже, Прежде всего, 55 плазму(0,2 мл) помещают, в фибростэкан и прибавляют трис-буфер (50 мкл), рН 7,4. Буферный раствор, содержащий плазму, инкубируют при 37 С в течение 1 мин, затем добавляют 50 мкл 24 мк/мл тромбинового раствора в трис-буфере и замеряют время коагуляции в секундах. Если время коагулирования превышает 300 с, далее указывают, как300,Пероральное введение: крыс с введенным в яремную вену катетером выводят из состояния наркоза до перорального приема ингибитора. Водный раствор ингибитора протеазы Ас-(0)РЬе-Рго-бороАгд-ОН, содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,75 мл воды нэ кг массы крысы вводят через зонд, В табл, 10 приведены полученные данные.Местное применение: в брюшной полости крыс с введением в яремную вену катетером выполняют 3-х см разрез, пока они все еще находятся в наркотизированном со- стоянии, Находят толстую кишку и разъединяют ее восходящую и нисходящую часть. Водный раствор ингибитора протеаэы Ас - (0)РВе - Рго - бороАгд - ОН, содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу) в 1 мл воды на кг массы крысы, инъецируют в восходящую часть полости толстой кишки. Разрез закрывают, используя скобки для наложения шва. В табл, 11 приведены полученные данные,Ректэльное применение: в качестве методики для ректального введения ингибитора крысам с вставленным в яремную вену катетером используют методику КавЦа, Вкратце говоря, изготавливают приспособление. состоящее из 0,89 см и 0,71 см силиконовых прокладок, соединенных в длину на 2 см проволочкой. Указанное приспособление вставляют в ректальное отверстие крысы, причем сначала прокладку большего размера и затем приклеивают к анальному проходу соответствующим клеем, Введение ингибитора осуществляют путем инекцирования через расположенную снаружи прокладку. Доза для ректального приема составляет 3 мг ингибитора протеазы Ас- (0)РЬе-Рго - бороАгд - ОН на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу),в 0,6 мл воды на кг веса крысы, В табл, 12 приведены полученные данные.Ингибиция и ччо воспалительного процесса, вызванного кротоновым маслом,Получают два раствора: в первом содержится в 5 ф -е кротоновое масло, известное как агент, вызывающий воспаление, в ацетоновом носителе (кротоновый раствор), а второй раствор содержит 5-е кротоновое масло в ацетоновом носителе, к которому добавлено 10 мг/мл предлагаемого соединения (испытуемый раствор), Кротоновый раствор (10 мкл) или в альтернативном варианте испытуемый раствор наносят на правое ухо каждого животного (крысы Яргадое ОаМеу СО, весом 130-140 г, представленные Свагез В 1 чег 1 аЬз, пс, ЧЧщпдоп, МА). Ацетоновый носитель в чистом виде (ацетоновый раствор, 10 мкл) наносят на левое ухо каждого животного, Через час после обработки животных усыпляют, их уши отрезают, штампуют на диски размеров 1/4 дюйма в диаметре и взвешивают, Разбухание измеряют как разницу в весе между кротоновым раствором, которым обработано правое ухо и ацетоновым раствором - левое ухо. Полученные данные сравнивают с индометацином, который известен в качестве нестероидного противовоспалительного средства, приготовленного и наносимого аналогичным образом как и испытуемое соединение, В табл, 13 приведены усредненные значения для соединения Р, Ас - Р 11 е-бороАгд-С 1 оН 16, Используемый . термин "доза" означает количество активного противовоспалительного ингредиента в мкг (соединения А, С, О. Е, Е или О, или индометацина) в растворе, нанесенном на правое ухо, а и означает количество крыс, которое используют в каждом тесте. "ЗЕ" означает стандартную погрешность,В табл. 14 показана антивоспалительная активность соединений А, С. которыевзяты при одних и тех же.условиях (доза =:199 мкг).Ингибирование плазмина боролизиновыми пептидами,Плаэмин плазмы человека получают отфирмы Ааег 1 сап Оаопозбсз, Огеепюс 1, Ст,концентрация активных центров в препарате, определяют методом, аналогичным методу; описанному Со 1 еаап и др. Анализферментов осуществляют на спектрофотометре РегЫп-ЕтегавЬса 4 С с использованием вычислительной машины типаРегйп-Е 1 еег 7300. В качестве буфера ис пользуют 50 ммолей трис-буфера, рН 7,4,содержащего 110 ммоль хлорида натрия,0;1 ф ПЗГ 6000 и 0,30 ммоль Н-(О)Уа 1-1 еи уз-дара-нитроанилида, К этой смеси при. бавляют соответствующие количестваингибитора и затем плазмина. При 25 С измеряют повышение интенсивности поглощения при 405 нм по времени, Посколькуингибиторы связываются медленно. скорость реакции определяется по касательной,проводимой к кривой реакции, по истечении10 мин от начала реакции, В каждом случаеосуществляют контрольное испытание безприменения ингибитора. Во всех случаяхконцентрация плазмина составляет менее10 концентрации ингибитора. Результаты приведены в табл,15.Проведенные испытания показали, чтосоединения по изобретению малотоксичны, обладают высокой ингибирующей активностью с широким спектром действия, кроме того, все зти соединения могут быть введены в организм без применения растворителя-сол юбилизатора.Формула изобретенияСпособ получения производных борсодержащих пептидов общей формулыВ - Е - ИН - СН - ВУНа12В 1 - Н, Ас, В 2, Вос, Вос - .ео;В 2 - (СН)2 пйнС(МН)ИН 2, и = 3,4;У - остаток пинаконового или пинандиолового эфира;НЧЧ Сбн 550 зН, НС 1, НВгЕ = ОЯ. - Р 1 е, ОР 11 е - Рго, ОР 1 е-РЬе, Аауз, Рго-Р 1 е, А 1 э-Р 1 е, ОЬ-Р 1 е, А 1 а-йа,Иц - Бу, 01 уеа - А 1 а, пиро - 61-РЬе; Уа 1- Уа, (О)Уа - ео, 1 уз - Рго, 1 ец-Т 1 го тл и ч а ю щ и й с я тем, что амин формулыН 2 й - СН ВУНХ(СН 2)пЮ 130 где и = 3, 4, ЧЧ и уу 1 = С 1, Вг;У - остаток пинаконового или пинандиолового эфира, вводят во взаимодействие саминокислотой или пептидом формулыВ 1-Е - ОНгде значения Я 1 и Е указаны выше,и полученный продукт формулый 1-К - МНСН - ВУНУ, обрабатывают азидом щелочного металла собразованием соединения формулыВ 1 - г - ИН - СН-ВУНИ45 . (СН 2)паузгде значения Р 1, Е, У, и и чЧ указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бенэолсульфокислоты, с образованием соединенияй- Е - й Н - С Н - ВУН 1(СН 2)пй Н 255где значения Р 1, Е, У, Я, и указаны выше,и последнее подвергают взаимодействию сциэнэмидом в низшем спирте при температуре 50 - 150 С,й 1-КН-Н-ВУНУ,Й 2где Н - Н, Аз, В, Воз, Возец;82 - (СН 2)пйН-С(ИН)КН 2, где и = 3, 4;У - остаток пинаконового или пинандиолового эфира;На - С 6 Насзн, НС 1, Нвг;Е - О или 1.-РЬе, ОР 1 е-Рго, ОРЬе-РЬе,Аауз, Рго-РЬе, А 1 а-РЬе, 6 ц-РЬе, А 1 ац,6 цу, 61 уец-Аа, ругоц-РЬе, Ча-Ча 1,ОЧа 1- ец, 1 уз-Рго, 1 ец-ТЬг, заключающийсяв том, что амин формулыН 2 М СНБУНЯ,(СН 2)Ягде и = 3, 4;. ЧЧ и чЧ - О, Ви;У - остаток пинаконового или пинандиолового эфира, вводят во взаимодействие саминокислотой или пептидом формулы (1)й 1 - . - ОНзначения Я 1 и 2 указаны вышеи полученный продукт формулы (1 У)Й 1-Е-.ЙНСН - ВУНЮ(СН 2).азначения В 1, Е, У; Ю Ю и и указаны выше,обрабатывают азидом щелочного металла собразованием соединения формулы (У)В -Е-ИН - СН - ВУНЯ,(СН 2)пйэзначения В 1, 2, У, Чl и и указаны выше,которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бензолсульфокислоты,с образованием соединения (У 1)В - Е-МН-СН - ВУНЮ1(СН 2)пй Н 2значения В, Е, У, 9/ и и указаны. выше,последнее подвергают взаимодействию сцианамидом в низшем спирте при 50 -150 С.В описании изобретения используютсяследующиесокращения для аминокислотных остатков:Аа = 1:аланинАГ 9 = ;дргининАзи - 1:аспарагинАзр -аспарагиновая кислотаСуз =-цистеин6 и = 1.-глутамин6 ц - 1:глутаминовая кислота61 у = глицинН 1 в = 1:гистидин1 е --иэолейцинец =1-лейцинуз - 1:лизинМес = 1-метионинРЬе =1-фенилаланинРго = 1:пролинЗег = -серинТЬг =-треонинТгр = 1:триптофан45 пластинках КС 18 Рдля оф-ТСХ фирмы ЮЬащаи. Нейтральные соединения наблюдали в УФ-области и после экспонирования парами иода, Соединения, содержащие свободные аминогруппы, подкрашивали ни 50 55 нгидрином; а соединения с гуанидиногруппами подкрашивали красителем ЯаКа 9 цсЫ. Краситель ЯаМаццсЫ проявляет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например, которые содержатся в бораргининовых пептидах. П р и м е р 1,а. 1-амино-бром-бутилборонат пинандиол НО.МН 2 - СНСН 2)зВг)В 02-СюН яНО Туг =-тирозинЧэ = 1-валинТам, где прибавлен префикс О, упомянутые сокращения обозначают аминокисло 5 ту О-конфигурации. Там, где прибавленпрефикс О или 1, упомянутые сокращенияобозначают то, что аминокислота можетиметь или конфигурацию О, или конфигурацию 1,"0 Используемый термин й-концевая защитная группа относится к различным аминоконцевым защитным группамиспользуемым в синтезе пептидов; Примеры пригодных групп включают ацильную за 15 щитную группу, например ацетил (Ас),бензоил (В 2), или алифатические уретановые защитные группы, например третбутоксикарбонил (Вос).Приводимые далее в описании примеры20 иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения, Все указанные точкиплавления не откорректированы. Все частиприведены в весовых частях, а температурыуказаны в С. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного яденрногомагнитного резанЬнса (ЯМР или ЯМР) .1. указаны в дельта-единицах, частях на млн.,исходя из внутреннего тетраметилсиланового стандарта. Многочисленные сокращеЗ 0 ния, используемые в указанных примерах,имеютследующие значения: ТРА - трифторуксусная кислота; ОМГ-й,й-диметилформамид; МС - масс.-спектрометрия; ТСХ -тонкослойная хроматография; оф-ТСХ - тон 85. кослойная хроматография с обращеннойфазой. Сложноэфирные защитные группыбарных кислот имеют аббревиатуры: -СбН 12"- = пинаконовая группа и -С 1 оН 6 = пинандиоловая группа.40 Все аминакислотные остатки представ. лены в 1.-конфигурации, если не оговореноособо.ТСХ и оф-ТСХ осуществляют на пластинках из силикагеля 60 фирмы Е.МегМ и5 5 5: 10.10 10 10 10 100 100 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 10000 10000 10000 1 2 3 4 6 8 9 10 11 1 3 7 8 9 10 111213 14 5 7 11 12 14 ,. 1618 .19 20 21 22 5 5 8 8 11 16 16 18 а 14 18 20 21 40 19 15 14 .9 22 22 Ингибирование калликреина плазмы человека Вос(0)РЬе-Рго-ЬогоАгд-СоНе2 НО Ас-(О)РЬе-Рго-ЬогоАгд-С 1 оН юНО Вос(0) Рве-Рве-Ього-Агд-Сон 6ВЯА Ас-А 1 а.уз(Вос)-ЬогоАгд-СюНеВЗА Ас-А 1 ауз-ЬогоАгд-С 10 Н 362 НО Вос.еоуео-А 1 а-ЬогоЯгд-С 1 оН 1 еВЗА Вгоу-ЬогоАгд;СюН 16 ВЗА Вг-Рго-Рпе-ЬогоАгд-С 1 оН иВЯА Вг-Рго-РЬе-ЬогоАгд-ОН НС 1 Вг-Рго-РЬе-ЬогоАгд-Р Вос-А 1 а-РЬ ОЛ.Ього 1 з СеНаНОИнгибирование тромбина Ас-(О)-РЬе-Рго-ЬогоАгд-СюНиНС 1 Вос(0)РЬе-Рго-ЬогоАгд-С 1 оН ыВЗА Ас-(О)-РЬе-Рго-ЬогоАгд ОННС Н(0 РЬе-Рие-ЬогоАгд-С 1 оНе2 НС Вос(Ь)РЬе-РЬе-ЬогоАгд-С 1 оНеВЗА Н.еоу-йо-А 1 а-ЬогоАгд-СЫН ые НОВЯА Вос-еоуео-А 1 а-ЬогоАгд-СяН 6ВЗА Вг.о(О Во)-61 у-ЬогоАгд-С 1 оН 16. ВЯА Ас-Аауз(Вос)-ЬогоАгд-СюН йВЯА Вгоу-ЬогоАгд-С 1 оНыВЗА .: Вг-Рго-,РЬе-ЬогоАгд-ОН НС 1 Вг-Рго-РЬе-ЬогоАгд-Р Вос(0)Ча 1-1.ео-Ьогоуз С 6 Н аНО Вг-Ргб-РЬе-ЬогоАгд СоН 16ВЗА Восеоу-ео-А 1 а-ЬогоОги Сойм ВЗА Ас-А 1 а.уз-ЬогоАгд-С 1 оН и2 Н С 1 Ас-Рпе-Рго-ЬогоАгд-С 1 оН 16НО Вос-Аа-РЬе(0,1.)Ього 3 уз Сей аНС Н А 1 а-Рпе(ОА.)бого.уз СеНа2 НО Ас-РЬе-Ього 1. 3-СеННС 1Время активировэнного частичного тромбопластина, измеренное в секундах нгибирование свертывания кров 41 1807988 отромбиновое время нное в сек. бл 42 абли 5 Таблица 344 1807988 43 Таблица 6 Тромбиновое время Рго- ыван Устойчивость ингибиторов в плазме человек 8 Табл Устойчивость ингибиторов в буфереВ качестве ингибитоСреднее время, нео ное в секундах, + стандар э испытан Ас(0) бходимое для св ное отклонение оАгя-ОН.измеренТаблица 71807988 46 45 Таблица 9Ингибирование свертывания крови вслед за пероральным доэированием и ччо бли цаДанные представляют собой среднее для 2 крыс. Данные представляют собой среднее для 3 крыс лица ирование и ччо свертывания крови после введения через ободочную кишку (ингибитор Ас-(О) РЬе-Рго-ЬогоАгд-ОН) нДаейные представляют собои среднее для 2 крыс,Данные представляют собой среднее для 3 крыс Ингибирование и ччо свертыванияви вслед за пероральным введением48 1807988 47 Таблица 12 Средние данн я бли ца 13 нгибирование воспалительного процесса, вызванного кротоновым масло Табл и ца 14йгибирование воспаления, вызванного кротоновым маслом Т.а гибирование плазми Ингибированиеп чЬо свертывания крови после ректального введения (ингибитор АсО)Рпе-Рго-ЬогоАгц-ОН)50 1807988 49 Таблица Соединение . ные масс. спе м считан айдено для за Вос-Ча-Ча-Ього 1 уз-С 6 Н 12ВЯАН-Ча 1-Ча 1-Ього 1 уз-С 6 Н 12ВШАХ С 26 Н 52 Й 406 С 21 Н 44 Й 404-(О РЬе-РЬ 4 М 404 7 2 4,45 7,39 2 ВЯА 2 ВЗА бО СЗОН 49 Й 408 ВС 25 Н 4 ОЙ 405 ВС 22 Н 43 Й 4 В 9 87,3 0,35 4 ВЯА - Бензолсульфоновая кислотаТРА - Трифторуксусная кислота оставитель В, Волковехред М.Моргентал ктор И. Муск едакт Подписноеизобретениям и открытиям при ГКНТ ССС , Раушская наб., 4/5 аказ 1393 Тираж ВНИИПИ Государственного комитет 113035, Москва, венно-издательский комбинат "Патент", г. д, ул.Гагарина, 10 из хВ осо-РЬеуго 61 ц-РЬеН-(О)Ча 1- еУВ Продолжение табл,154-бром-хлорбутилборонат пинандиол получают по методике, описанной Мапезоп и др, В обычном эксперименте осуществляют гидроборирование аллилбромида (173 мл, 2 моль) бораном пирокате хина (240 мл, 2 моль) путем. прибавления борэна к аллилбромиду с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 4 ч до 100 С в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилборо ната (т,кип, 95 - 102 С, 0,25 мм), выделяют перегонкой с выходом 49 о . Указанный пирокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+)эльфа-пинандиолом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 15 50 мл тетрагидрофурана (ТНР), интенсивно перемешивая указанную смесь в течение 0,5 ч при 0 С, а затем 0,5 часа при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавляют 250 мл гексана. Пирокатехин 20 : удаляют в виде кристаллического твердого вещества, Количественный выход получают путем последовательного разбавления гексаном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении, При 25 упаривании растворителя получают продукт(147 г) в виде масла.Вычислено, О : С 51,85 Н 7,38; Вг 26,54; С 1 зН 2202 В гВ:Найдено,: С 52,85; Н 7,30, Вг 26.58.: 30 4-бром-хлорбутилбороната пинандиол получают. гомологизацией соответствующего пропилбороната, Хлористый метилен (34,8 мл,.0,540 моль) растворяют в 500 мл ТНЕ и затем медленно прибавляют к 1,54 М н-бутиллития в гексэне (350 мл, 0,540 ммоль) 35 . приОС. Пинандйол 3-бромпропилборо: ната (148 г, О 490 моль) растворяют в 500 мл ТНР, охлаждают до точки замерзания ука. занного раствора и вводят в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) рас творяют в 250 мл ТН=, охлаждают до 0 С и.прибавляют несколькими порциями к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в 45 течение ночи, Затем растворитель упаривают, а полученный осадок растворяют в гексане и промывают водой После просушивания над безводным сульфатом магния и фильтрования растворитель удаля ют с выходом целевого продукта (140 г),Пинандиол 1-амино-бромбутилбороната получают путем растворения гексэметилдисилизэна (28 г, 80 ммоль) в 30 мл ТН Р, охлаждения полученного раствора до -78 С 55 и прибавления к нему 1,62 М н-бутиллития в гексане (49,4 мл, 80 моль), Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры, повторноохлаждают до -78 С и прибавляют пинандиол 4-бром-хлорбутилбороната (28 г, 80 моль) в 20 мл ТНР,Реакционную смесь медленно нагревают докомнатной температуры и перемешивают втечение ночи, Растворитель удаляют упариванием, вводят сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выделяютфильтрованием в атмосфере азота, Фильтрат охлаждают до -78 С и добавляют 4 н, НСв диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакци- .онную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этойтемпературе перемешивают ее 2 ч, Полученный продукт(20 г) выделяют фильтрованиемв виде твердого вещества. После просушивания в вакууме неочищенный продукт растворяют в хлороформе и нерастворившеесявещество выделяют фильтрованием, Фильтрат упаривают и осадок растворяют в этилацетэте, Целевой продуктвыкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г(т,пл. 142-144,5 С, (ао(ОА)КН 2-СННСН 2)зВг 1 В 02 СОНиНЬ.Пинакон 4-бром-хлорбутилборонатэполучают по методу, описанному для получения соответствующего пинандиола (пример 1,а), за исключением того, что вместопинандиола используют. пинакон, пинакон3-бром-пропилбороната (т,кип. 60-64 С,0,35 мм) и 4-бром-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112 С, 0,20 мм) перегоняют.Элементный анализ дляС 10 Н 1902 ВГС В:Вычислено,: С 40,38, Н 6,45Найдено, : С 40,70, Н 6,37,Хлористоводородную соль пинакона 1 амино-бромбутилбороната также получают по методике примера 1,а. Целевойпродукт выкристаллизовывают из смесиэтилацетат:гаксан с выходом его 52 о .Элементный анализ дляС 10 Н 22802 В ГСВ:Вычислено, О : С 38,19, Н 7,05, й 4,45, С11,27, Вг 25,41.Найдено, О : С 38,28, Н 7,39, М 4,25, С11,68, Вг 26,00. П р и м е р 1,в, Гидрохлорид 1-аминохлорбутилборонат хлористоводороднаясоль пинакона,(0, )МН 2 СН(СН 2)зС 802 - С 6 Н 12НС 1, Синтез дипептида ВОС (О) РЬе - Рго - ОН Пирокатехин 3-хлорпропилборонат осуществляют вначале с получения дипеп(т.кип, 80 - 85 С, 0,30 мм) и пинакон 3-хлорп- тидного бензилового эфира, а затем удалеропилового эфира бороновой кислоты ния указанного сложного эфира (т.кип. 63 С, 0,20 мм) получают по методике 5 каталитическим гидрированием, Воспримера 1,а за исключением того, что вме- (0)РЬе-ОН (10,0 г, 37,7 ммоль) растворяют в сто аллилбромида используют аллилхлорид, 50 мл ТН Г и к полученному раствору прибава вместо пинандиолаберутпинакон. ляют М-метилморфолин (4,14 мл, 37,7оЭлементный анализ для СэН 1802 С 18; ммоль). Раствор охлаждают до -20 С, а заВычислено, %: С 52,85, Н 8,89, С 17,33. 10 тем к нему прибавляют изобутиловый эфир Найдено, %: С 53,41, Н 8,15, С 16,81. хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7 Гомологизацию также осуществляют поммоль). Через 5 мин в реакционную смесь методике примера 1,а, а полученный про- вводятН-Рго - ОВЕ 1. НО(9,11 г,37,7 ммоль), дукт выделяют перегонкой (т.кип. 95 С,. растворенныйв 50 млхлороформаиохлаж,25 мм) с 65% выходом,15 денный до -20 С. Прибавляют триэтиламинЭлементный анализ для С 1 оН 1902 С 128: (5,25 мл, 37,7 ммоль) и полученную смесь Вычислено, %: С 47,47, Н 7,58, С 28,02. перемешивают 1 ч при -20 С и 2 ч при комНайдено, %: С 47,17, Н 7,45; С 1 27,75. натной температуре. Реакционную смесь Хлористоводородную соль пинакона 1- фильтруют и фильтрат упаривают, Оеадок амино-хлорбутилового эфира бороновой 20 растворяют в этилацетате с последующим (борной) кислоты получают по методике, . промыванием 0,2 н. НС 1, 5%-ным водным аналогичной примеру 1,а. Целевой продукт . раствором бикарбоната натрия и насыщенвыкристаллизовываютиззтилацетата с пол-ным водным раствором хлористого натрия, учением 8,8 гпродукта(т.пл,132-135,5 С) и Органический слой сушат над безводным 2,2 г продукта (т,пл. 145-147 С), Продукт с 25 сульфатом натрия, фильтруют и упаривают т.пл, 145-147 С используют для анализа с получением 15,2 г Вос - (0)РЬе-Рго-ОВЕ 1 вЭлементный анализ для С 1 оН 22 М 02 С 8:виде масла, Полученный бензиловый эфир Вычислено,%; С 44,47, Н 8,23,М 5,19, В (15,2 г) растворяют в 100 мл метанола и 4,00. ",: затем гидрируют при начальном давленииНайдено, %; С 44,01, Н 8,23. М 4,77, В 30 40 фунтовдюйм (2,812 кг/см ) в аппарате 3,80: .;:. -Парра в присутствии 0,5 г 10% палладиевойП р и м е р 1,г. (ОЛ)1-амино-бромпен--, черни (РИС), Реакционный раствор фильт- . . тилового боронат эфира бороновой кислоты " руют через целигтм и упаривают с выходом пинакон НС 1, . ;:-.:.:.: твердого вещества.Указанный твердый(ОА)МН 2-СНИСН 2)48 г)802 СбН 12НС 1.:35 продукт выделяют и промывают этилацета Пинакон 4-бромбутилового эфира боро- . том, а затем простым эфиром с получением новой кислоты получают по методу, описан г требуемого продукта (т,пл, 176,5- ному для получения пинандиола . 177 С).3-бромпропилового эфира борной кислотьЭлементный анализ для С 19 Н 26 М 205, (пример 1,а); эа исключением того, что ал (%):лилбромид заменяют на 4-бром-бутен, а Вычислено: С 62,95, Н 7,24, М 7,73.пинандиол на пинакон, Продукт выделяют в Найдено: С 62,91, Н 7,15, М 7,53.виде масла (т.кип. 77 С, 0,3 мм), После го-Вос(О)РЬе-Ра-МН-СН(СНфВг)802-С 10 Н 16 мологизации получаот 5-бром-хЛорпенти- получают связыванием указанного дипеплового эфира бороновой кислоты пинакой, 45 тида с соответствующим амином по методи: Масс-спектроскопия(С 1):С 1 Н 2028 гС 18 ке смешанного ангидрида, СмешанныйВычислено,%,Н;310,47.ангидрид Вос - (О)РЬе-Рго-ОН получают Найдено, %:Н: 310.при растворении указанной кислоты (4,94 г, Целевой продукт хлористоводородную: 13,6 ммоль) в 30 мл ТНР с последующим соль пинакона 1-амино-бромпентилового 50 прибавлением М-метилморфолина (1,50 мл, эфира бороновой кислотц получают по ме,6 ммоль). Затем реакционный раствор охтодике примера 1,а при выходе 35% лаждают до -20 С и добавляют иаобутилоЭлементнцй анализ для вый эфир хлормуравьинойкислоты(1.77 мл, С 11 Н 24 М 028 гВС 1; %; 13,6 ммоль), После перемешивания в течеВычислено: С 40,22, Н 7,36, М 4,26, С 55 ние 5 мин при -20 С в реакционную смесь10,79, Вг 24,32, 8 3,29. вводят амин, который получен в примереНайдено; С 39.23, Н 7,18, М 4,04, С 1 1,а, МН 2-СНЕСН 2)зВг)802-СоНы НС 1 (5 г,15,21, Вг 25,66, В 3,75, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажП р и м е р 2. Вос-(0)РНе-Рго - МН- денного хлоформа. ОхлажденныйтетрагидСНЦСН 2)зВ г)8 02-С 1 оН 6, рофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13,6ммоль) прибавляют к реакционной смеси иперемешивают смесь в течение 1 ч при-20 С и примерно 2 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют и оставшуюсяжидкость в фильтрате упаривают. Осадокрастворяют в этилацетате и промывают0,2 н. НС 1, 5 О-ым водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазусушат над безводным сульфатом натрия,фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9 г продукта в виде масла. Указанныйпродукт растворяют в метаноле и хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см с 1 Н.Фракции, содержащие целевой продукт,объединяют и упаривают с получением 5,8 гтвердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичноепятно, Я 0,70,Масс-спектроскопия (ГАВ) дляСззРз 9 йз 06 ВВг;Вычислено: +Н: 674,30Найдено: 674,30.П р и м е р 3. Вос - (О)РЬе-Рго-ИН -СН(С Нг)зйз) В 02-С 10 Н 16.Продукт примера 2, Вос-(О)РЬе - РгоЙН - СН(СН 2)зВДВ 02 - С 10 Н 16 (4,4 г, . 6,54ммоль) растворяют в 7 мл диметилформамида (ДМР) и аэид натрия (0,919 г, 14,1 ммоль)прибавляют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100 С в течение3 ч. Прибавляют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой инасыщенным водным раствором хлористогонатрия. Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия,фильтруют и упаривают. Получают 4,1 гтвердого продукта. Указанный продукт хроматографируют на колонке 2,5 х 50 см из1 Нв метаноле. Фракции, содержащиецелевой продукт, объединяют, оставшуюсяжидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол;хлороформ (1 9) показывает единичное пятно, В 10;76.Элементный анализ для СззН 46 К 606 В,(%Вычислено: С 62,35, Н 7,63, М 13,33, В1,70,Найдено: С 63,63, Н 8,02, 1 ч 11,58, В 1,80.Масс-спектроскопия (РАВ) дляСззН 461 чб 06 ВВычислено: Н: 637,39Найдено: 637,49,П р и м е р 4, Вос-(О)РЬе - Рго - 1 чН -СН(СН 2)зМН 2)ВО 2 - С 1 оН 16Бензолсульфокислота.Азид примера 3 (8,80 г, 13,8 ммоль) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют нэустановке Парра при давлении 40 фун 5 10 ъбензолсульфокислота В ос-(О) Рпе-Рго - бороАгд - С 1 оН 16 х бензолсульфокислотэ,15 В ос - (О) Р пе-Р го - бороАгд - С 1 оН 1 Ф убензосульфокислоту, полученную в приме 55 20 25 30 40 45 50 тов/дюйм (2,812 кг/смг) в присутсгвии 0,50 г 10 оь палладиевой черни и бензолсульфокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль), Через чэс катализатор удаляют и после упаривания раствора получают 9,9 г требуемого продукта, оф-ТСХ в системе растворителей метанол:вода (85:15) показывает пятно в Уф-области, Й 1 0,91 и пятно. позитивное к нингидрину, ВГ 0.52.П р и м е р 5, Вос - (О)Р 11 е - Рго-ИНСН(СН 2)зч Н - С(И Н)1 чНгВ 02-С 1 оН 16 у ре 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100 С в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл), Ход реакции регулируют оф- ТСХ в системе растворителей метанол: воды (85:15), где наблюдается исчезновение нингидринового пятна из исходного материала амина (Я 1 0,54) и появление красителя Яа 1 адцсЫ на полученном продукте (И 0- 0,13), Указанный продукт можно обнару- . жить после нагревания с. обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышается. Через 7 дней; когда амин нельзя обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50 об.оь пассивным упариванием. Затем реакционный раствор фильтруют,сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см колонке с 1 Нв метаноле, Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и после упэривания получают 3,7 г требуемого продукта, Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетат:гексан свыходом 0,89 г вещества, э остаток (1,2 г)получают порошкованием простым эфиромв виде твердого продукта.Масс-спектроскопия (ГАВ) дляС 34 Н 53 116065 В;Вычислено: Н: 653,42Найдено, 653,38,Элементный анализ дляС 40 Н 59 И 6095 ВНго, (.Вычислено: С 57,95, Н 7,43, М 10,14, В1,30Найдено: С 57,20, Н 7,14, И 10,94, В 1,01,П р и м е р 6. Н - (О)Рпе-Рго-бороАгд -С 10 Н 162 НС 1,Продукт примера 5, Вос - (О)Рпе-Рго -боро Агд-С 10 Н ы,бензолсульфокислота (1.17 г,1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с 5 мл 4 н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре,Полученный продукт осаждают при добэвлении простого эфира, выделяют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт растворяют в 10 мл воды и наносят на анионно-обменную колонку 5 мл с Вио-ВАОА 6 Х 8 (С-форма, ВО-ЙАОСо., ВсЬпопб, СА) с последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 г).Масс-спектроскопия (РАВ) для С 29 Н 45 чб 04 В.Вычислено:+Н: 553,37Найдено: 553,40 и 538,40 (не идентифицирован).Элементный анализ Н-(0)Р 1 е - Рго - бороАгд-С 10 Н 1 б 1 ВЯА,ТРА:Найдено; 553,4П р и м е р ы 7 и 8. Ас-(0)Р 1 е-Рго - бороАгд-С 1 оН 1 б Н С (пример 7)Ас-(0)Рпе - Рго - бороАгд - ОН,НС (пример 8).В ос-(О) Ре-Рго-бороАгд-С 1 оН 1 бк хбензосульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль) подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (ТРА) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре, Избыток ТРА удаляют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта. Указанный продукт (0,70 г, 0,91 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл диоксана и 1 мл воды, Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5 ммоль) и бикарбонат натрия (0,42 г, 5 ммоль) прибавляют к реакционному раствору, Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют этилацетат (50 мл) и воду (5 мл). Образовавшиеся фазы разделяют и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и удаления растворителя упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества.Полученную пробу растворяют в 4 мл ледяной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же наносят нэ колонку с 15 мл ЯР-сефадекса (Н -форма) и уравновешивают 20%-ым раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ой уксусной кислоты до 100 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н.хлористоводородной кислоты, Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0,17 н. НС, содержат й-ацетиловый пептид(0.29 г) в виде смеси из свободной бароновой кислоты и сложного пинандиолового эфира.Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту разделяют хроматографией на 2,5 х 100 см колонке, содержащейНв метаноле. Размер фракций составляет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракциях 41 - 43, в то время как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракциях 45 - 129.Масс-спектроскопия (РАВ) (пример 7): Ас-(0)РЬе - Рго - бороАгд - С 1 оНб дл я Сз 1 Н 47 йб 05 В: 10 Вычислено+Н: 595,33Найдено: 595,33Масс-спектроскопия (РАВ) (пример 8) 15 Ас - (0)РЬе - Рго - бороАгд - ОН,НС для С 21 Нзз 605;Вычислено+Н: 449,60Найдено; 579,24 - 581,24.Последние данные нельзя объяснить 20 Тем не менее данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускания для пинандиоловой группы, например как синг- леты метильных групп при дельта 0,85 (ЗН),1,30 (ЗН) и 1,36 (ЗН), не наблюдались, В качестве дополнительного доказательства 25 этой структуры образец продукта свободной бароновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитическую пробу (20 мг) обрабатывают двухкратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл 30 метанола в течение 5 мин, Растворитель упаривают, а избыток пинандиола удаляют порошкованием простым эфиром указанного образца с выходом требуемого продукта(26 мг). 35 Масс-спектроскопия (РАВ) (найдено:595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой, предполагаемой для этерифицированного продукта, и почти идентичны пинандиоловаму продукту примера 7,П р и м е р 9, Ас-РЬе-бороАгдС 10 Н 1 бНС.По методике, описанной в примере 2,40 ТРА, который связывают с НН 2 -СН(СН 2)ЗВгВ 02 С 1 оН 1 бНС (продукт примера 1,а, 1 г, 2,73 ммоль), растворенного в 10 мл охлажденного ТНР с выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т,пл. 50 106,5 - 109 С).55 Элементный анализ дляС 25 Н 36 И 204 ВГВ, %:Вычислено: С 57, 81, Н 7.00, М 5,40, Вг15,40, В 2,08Найдено: С 58,33, Н 7,33, й 4,76, Вг14,18, В 1,80,получают Ас - Рпе - МН-СНСН 2)ЗВгВ 02 - 45 С 1 оН 1 б, Затем получают смешанный ангидрид Ас-РЬе-ОН (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 млМасс-спектроскопия (ГАВ) дляС 25 Н 36 Й 204 В гв:Вычислено +Н; 519,20Найдено: 519,23.Ас-РЬе - М Н-СН(СН 2)зйзВ 02-С 1 ОН 16получают при обработке Ас-РЬе - МН -СН(СН 2)зВгВ 02 - С 1 оН 16 (3,22 г, 6,20 ммоль)натрийазидом по методике, описанной впримере 3. Полученный продукт(3,03 г) хроматографируют на колонке с .Н, Фракции, содержащие требуемый продукт,объединяют и упаривают, Осадок порошкуют гексаном с выходом 2;21 г указанногоазида.Бен зол сул ь фон ат Ас - . Р Ье - бо роОгп -С 1 оН 16 получают из указанного азида Ас -РЬе-ЙН-СН(СН 2)зйзВ 02-С 1 оН 16 (2,21 г,4,59 ммоль) по методике примера 4 за исключением того, что гидрирование осуществляют при атмосферном давлении, Послефильтрования и упаривания растворителяпутем порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 г),. Ас - Р Ь е - б о р о А г 9 - С 1 оН 16 ххбензолсульфонат получают путем обработки соединения Ас-РЬе - бороОгд - С 1 ОН 16 бензолсульфокислота (2 г, 3,26 ммоль) 10 млраствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле,Реакцию гуанидирования осуществляют пометодике примера 5 за исключением того,. что реакционное время составляет 3 дня, ареакционная смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта,Указанная смесь требует дополнительнойочистки, которую по всей вероятности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далееконцентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из 1 Нв метаноле.Ф.ракции, содержащие требуемый продукт,обнаруженные при помощи подкрашиваю. щего агента ЯаКа 9 осЫ, объединяют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученныйпродукт (1,2 г) растворяют в 6 мл уксуснойкислоты, разбавляют 30 мл воды и получаютраствор молочного цвета, Этот раствор наносят на колонку объемом 30 мл с ЯР-Сефадексом С("Н-форма), доведенную доравновесного состояния 20%-ым воднымраствором уксусной кислоты. Далее колонкупромывают 240 мл 20%-ой уксусной кислотыи устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ой уксусной кислоты до 250 мл 20%-ой уксусной кислоты,содержащей 0,30 н, соляной кислоты. Фракции, элюированные из колонки в интервалеот 0,12 до 0,16 н. соляной кислоты, объединяют с выходом 0,42 г требуемого пептида ввиде смеси свободной борной кислоты исложного эфира пинандиола, Указанную30 выделяют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после высушиванияв вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилпроизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) растворяют 35 в 40 мл ТНГ и прибавляют к продукту взаимодействия пинакона 4-бром-хлорбутилбороната и гексаметилдисилизана, приготовленных в 20 ммольной концентрации, при -78 С. Затем реакционную смесь нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удаляют путем упаривания, Осадок растворяют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ым 40 45 раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натрия и после концентрирования получают требуемый 50 продукт продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г, т.пл. 146,5 - 148 С), При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав,Элементный анализ дляС 21 Нз 2 М 204 ВгВ, %: Вычислено: С 53,98, Н 6,92, М 6,00, Вг 17,10, В 2,31. Найдено: С 54,54, Н 6,78, й 5,89, Вг16,46, В 3,40. 55 смесь растворяют в метаноле (10 мл) и для этерификации свободной бороновой кислоты прибавляют 80 г пинандиола, После переме шива ния в течение 30 мин 5 растворитель упаривают, а после порошкования осадка простым эфиром получают 0,28 г требуемого продукта,Элементный анализ для .С 26 Н 40 М 5048 КС 2 Н 20, %;10 Вычислено; С 54,78, Н 8,15, й 12,30, В1,90.Найдено: С 55,34, Н 7,83, М 11,66, В 1,99.Масс-спектроскопия (ГАВ) .дляС 26 Н 40 г 1504 В;15 Вычислено Н: 498,32Найдено; 498,31.П р и м е р 10. Ас - (РА)РЬе - (РА)-бороАг 9 - С 16 Н 12Промежуточное .соединение Ас (РЛ.)РЬе - (РА)-ЙН - СН-(СН 2)зВгВ 02-С 6 Н 12получают модифицираванием методов, описанных в примере 1 и 2, Хлорангидрид АсРЬе - ОН получают при взаимодействии Ас - РЬе - ОН (30 г, 0,145 моль) с пентахлори дом фосфористой кислоты (30 г, 0,144 моль)в 175 мл ТНГ при -10 С, Реакционную смесь перемешивают при 0 С приблизительно в течение 1 ч, затем разбавляют до объема 350 , мл охлажденным простым эфиром, продуктАлкилбромид превращают в соответст,33 г, 14.5 ммоль) по методике, описанной ввующий азид по методике примера 3, Про- примере 2, за исключением того, что не выдукт выкристаллизовывают из этилацетата полняют хроматографии на колонке с ЕН.(т.пл. 143-1440 С). Полученный продукт выкристаллизовываютЭлементный анализ для Сг 1 Нзгй 5 ОаВ 5 из этилацетатэ с выходом в первом погонеЖ: 2,47 г продукта (т.пл. 132 - 134 С) и 5,05 гВычислено; С 58,74, Н 7,53, й 16,31, В продукта(т.пл, 133 - 135 С) во втором погоне.2,53. При оф-ТСХ в системе метанол: вода (85;15)Найдено: С 58,85, Н 7,48, М 16,53, В 2,93. отмечено единичное пятно, В 1 0,29,Полученный азид превращают.в соль 10 ЗлементныйанализдляСз 7 Н 51 йз 06 ВгВ,бензолсульфокислоты Ас-(ОА)Рпе-(ОА)-бо- ф;роОгп-С 6 Н 1 г по методике примера 4 за иск- Вычислено; С 61,32, Н 7,11, М 5,80, Вглючением того, что гидрирование проводят 11,03.приатмосферномдавлении,. Найдено: С 61,21, Н 7,02, й 5.59, ВгАс-(0, .) Рпе-(0, 1.) боро О гп-С 6 Н 1 ггХ 15 10,22,хбензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль) Вос-(О)Рпе - Рпе-МН - СНСНг)зйз)ВОгподвергают взаимодействию с цианамидом -С 10 Н 16 получают при обработке соответству(О 20 г, О 476 ммоль) при 1000 С в 2 мл абсолют- ющего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) азиного этэнола в течение ночи, Раствор кон- дом натрия по методике, описанной вцентрируютипослепорошкованияпростым 20 примере 3, за исключением того, что дляэфиром получают 0,21 г белого вещества. очистки не нужно проводить хроматографи, При оф-ТСХ отмечено характерное положи-. ческого разделения на колонке с СН. Третельноеокрашиваниеполосыприиспользо-" буемый продукт элюируют из смесивании красителя ЯаКадцсЫ в случае растворителей этилацетат,гексан в виде гебороаргининовых пептидов(И 0-0.55) и ди ля и после выделенйя и промывания гекса. скретное пятно (ВТ 0,68), соответствующее ном получают 3 г требуемого продукта внепрореагированному исходному материа-,. первом погоне и 2,9 г во второй порциилу. Полученный продукт(81 мг) повторнооб-.: Бензолсульфонат Вос-(0)Рпе - Рпе - борабатывают 2 мл раствора цианамида (10 . роОгп-С 1 оН 16 получаютизуказанногоазйдамг 7 мл).в течение ночи по указанной методи-:. 30 (5,37 г, 7,82 ммоль) по методике, описаннойке и после порошкования простОм эфиром , в примере 4, с выходом 5,33. При оф-ТСХ вполучают.71 мгцелевогопродукта. .; смеси метанол:вода (85.15) отмечается инМасс-спектроскопия (ГАВ) длятенсивное положительное окрашивание ниСггН 378504 В: нгидрином, ВФ 0,42 и слабое пятно вВычислено+Н: 446,30. : 35 УФ-области, 0;92 (образование пятна в УФНайдено:446,23 и 404,19(соогветствую- области при ВГО;92 характерно для аминов.щий непрореагированному борорнитиново- или гуанидиновых соединейий, которые явму пептиду): .ляются солями бензолсульфокислоты).Следует иметь в виду, что методика по Масс-спектроскопия (ГАВ) дляпримеру 5 представляет собой наилучший 40 Сз 7 Н 5 зйа 06 В:способ получения бороаргининовых пепти- . .Вычислено+Н: 661;76,дов и отличается в том, что используют боль- . Найдено: 661,14.ший избыток цианамида и более Вос - (О) - Рпе - Рпе-бороАг 9-СюН 16 полпродолжительное время взаимодействия.: учают по методике, списанной в примере 5.П р и м е р 11. Вос-(0)Рпе-РЬе-бо Бороорнитиновыйпептид(4.83 г,5,90 ммоль)роАгя-С 1 оНМи бензолсульфонат.: . обрабатывают раствором цианамида (50Вос-(0)Рпе-Рпе - ОН получают по мето-мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в течедике, описанной для получения дипептида . ние 7 дней.ИзреакционнойсмесивыделяютВос-(О)Рйе-Рго - ОН в примере 2, После гид- порцию продукта, соответствующую 1 г исрирования сложного бензилового эфира 50 ходного материала, и нагревают отдельнополученный продукт выкристаллизовывают без обратного холодильника в течение ночииз смеси хлороформ гексан с выходом тре- с полным превращением эмина в гуанидинобуемого пептида (т.пл. 133 - 133,5 С). соединение, После хроматографии на колонЭлементныйанализдля СгзНгвйг 05, : ке с .Ни порошкования продуктаВычислено: С 66,96, Н 6,86, й 6,79. 55 простым эфиром получают 0.52 г требуемогоНайдено; С 66,75, Н 6,79, И 6,56. борнила,Вос-(О)РЬе-РЬе-МН-:НЦСЩВг 3 ВОг-С 10 Н 16 Элементный анализ для С 1 аН 61 И 609 ЯВ,получают путем смешивания Вос-(О)РЬе-РЬе-ОН (6 г, 14,5 ммоль) с МНг - Вычислено: С 61,38, Н 7,16, И 9,76, В10 30 насыщаемости раствора добавляют нужное 35 40 45 50 55 Найдено: С 59,69, Н 7,41, й 9,82, В 1.26, Масс-спектроскопия (ГАВ) для СЗ 8 Н 55 мбобв:Вычислено Н: 703,43Найдено: 703,49.П р и м е р 12. Н-(Р)РЬе-РЬе-бороАгц -С 10 Н 162 Н С.Бензолсульфонат Вос - (Р)РЬе-РЬе - бороАгд - С 10 Н 16, полученный по примеру 11 (0,59 г, 1,25 ммоль), деблокируют по методике примера 6 за исключением того, что пробу наносят на ионнообменную колонку в 20% этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ым раствором этанола. Продукт получают (0,424 г) в виде белого твердого вещества.Масс-спектроскопия (РАВ) . для СЗЗН 47 Й 604 В:Вычислено+Н: 603,38,Найдено; 603,41,П р и м е р 13. Бензолсульфат Ас - Аа - .уэ(Вас)-бароАгц-С 10 Н 16.Ас - Аауз(Вос) - ОН получают путем сопряженной реакции М-оксиянтарной кислоты имидоэфира Ас - Аа - ОН. полученного по методу Апбегэоп, с Н -уз(Вос) - ОН. К-оксикукцинимид Ас - Аа - ОН (6,25 г, 27,4 ммоль) растворяют в 30 мл диоксана и прибавляют к раствору Н -уз(Вос) - ОН (7,50 г, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состоящей из 30 мл 1 н. МаОН и триэтиламина (2,12 мд, 15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисляют соляной кислотой. Для получения требуемой количество сухого хлорида натрия. Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н, НС 1, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натрия. Рэстворитель удаляют путем упаривэния. После кристаллизации продукта из смеси этилацетат:гексан получают 7.,3 г требуемого продукта (т. пл. 86-89 С). Ас-А 1 а - 1 уб(Вос)-ЙН - СНСН 2)зВ г)ВО 2-СюН и йолучают по методике примера 2 зэ исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата, В продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракциях, отмечается единичное пятно при оф-ТСХ в смеси растворителей метанол:вода (85;15) при значении В 1 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, нэ которой после прибавления нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин.Ас - Аа - 1.уз(В ос) - К Н - С Н(С Н 2)зйз) В 02 -С 1 ОН 16 получают из соответствующего алкилбромида (1,95 г, 2,9 ммоль) по методике, описанной в примере 3, за исключением то 15 20 25 го, что очистку продукта осуществляют кристаллизацией его из зтилацетатэ, а не хроматографией наН, После кристаллизации неочищенного продукта (1,6 г) получают 0,55 г чистого продукта (т,пл.79 - 84 С) и 0,96 г осадка, Ниже представлен химический состав кристаллического продукта.Элементный анализ для СзоН 52 Й 707 В, %Вычислено: С 56,86, Н 8,29, й 15,48, В 1,71,Найдено: С 56,76, Н 8,26, М 15,89, В 1,65.Бензолсульфонат Ас-А 1 а- уэ(Вос)-бороОгп-С 10 Н 6 получают из соответствующего алкилазида (0,433 г, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4, После удаления катализатора и растворителя получают названный продукт(0,45 г) при порошковании простым эфиром,Масс-спектроскопия (ГАВ) для Сзо Н 54 К 507 В;Вычислено. Н: 608,42,Найдено: 608,49.Бензолсульфонат Ас - А 1 а -уз(Вос) - бороАгц - С 10 Н 16 получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, описанной в примере 5, Хроматографические фракции, содержащие требуемый продукт, порошкуют простым эфиром с выходом 0,83 г продукта в виде белого твердого вещества,Элементный анализ для СЗ 7 Н 62 ч 7010 ВЯ, %Вычислено: С 55,00, Н 7,75. й 12,14, В 1,34Найдено: С 54,09, Н 7,53, ч 12,22, В 1,34.П р и м е р 14, Ас-А 1 ауэ-бороАгд-СюН 16 хх 2 НС 1.Бензолсульфонат Аз - А 1 ауэ(Вос) - бороАгц - С 10 Н 16(0,200 г, 0,248 ммоль) деблокируют по методике примера 6. Послеионнообменной хроматографии, упаривания растворителя, просушивания в вакуумеи порошкования простым эфиром получают0,14 г требуемого продукта,Масс-спектроскопия (ЕАВ) дляС 26 Н 48 ч 705 В:Вычислено+Н: 550,39,Найдено: 550,42.П р и м е р 15. Бензолсульфонат Вос 1 ец - 6 у - 1 ец - А 1 а - бороАгд - С 10 Н 16,Вос -ец - Аа - ОВг получают по методике синтеза дипептидов, описанной в примере 2, Вос- ец - А 1 а - ОВг (23,7 г, 57,7 ммоль)растворяют в 40 мл безводной трифторуксусной кислоты, Через 15 мин удаля ют избыток трифторуксусной кислоты путемупаривания и после обработки голученного