Способ разделения эритроцитов на строму и гемоглобин

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Соеэ СоветсннкСфцнапнстнчасннкРесяубянн(53)М. Кл. 6 01 И 33/48 с присоединением заявки М -Реудерстваай квиктет ВСВР ав ааааи евбрвтеей и аткриткаДата опубликования описания 30,06,82(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ НА ГЕМОГЛОБИН И СТРОМУ1Изобретение относится к биохимии, а именно к исследованию крови.Известен способ разделения зритроцитов на строму и гемоглобин путем гемолиза эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофизическим методом 1 1.Однако способ не обеспечивает высокого выхода целевых продуктов.Цель изобретения - увеличение вы 10 хода целевых продуктов.Поставленная цель достигается тем, что в способе разделения эритроцитов на гемоглобин и строму путем гемолиза эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофизическим методом гемолиэ ведут при рН 6,1-6,5, а гемоглобин отделяют от стромы ионообменной хроматографи" ей. 20Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Разделение эритро" цитов на строму и гемоглобин осуществляют пропусканием гемолиэирован ных эритроцитов через слой молекулярного сита, помещенного в сосуд, имеющего катионообменные группировки, связывающие гемоглобин в слабокислой среде. Иэоэлектрическая точка гемоглобина рН=6,8, а изоэлектрическая точка стромы эритроцитов рН=5,8,по" этому при рН 6,1-6,5 строма приобретает отрицательный заряд, а гемоглобин положительный. В этих усло" виях гемоглобин прочно связывается с катионообменными группами моле" кулярного сита, а строка остается в окружающей среде. Последующая операция заключается в промывании содержимого сосуда укаэанным выше буфе" ром до отрицательной реакции промы" вных вод на белок.В первых порциях оттекающей жидкости получают взвесь стромы эрит" роцитов, полностью свободной от гемоглобина. После отмывания стромы в сосуд вносят йа-Фосфатный буферс0066 ф 5 0 5 26 25 30 Формула изобретения 35 40 45 ВНИИПИ Заказ 4659/66 Тираж 887 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3 94рН 7,4, которым снимают гемоглобинс молекулярного сита, и последующимотмыванием в этом же буфере получают раствор гемоглобина, полностьюлишенный остатков стромы, 2 мл отмытых от плазмы эритроцитов гемолизируют в 8 мл 10 мосм йа-ФосфатногобуФера рН 6,3. 10 мл гемолиэата помещают в сосуд, имеющий в нижнейчасти сетчатый Фильтр иэ инертногоматериала и сливное отверстие с краном, заполненный 2 г СИ-Сефадекса,набухшего в 10 мосм натрий-Фосфатном буфере рН 6,3 в течение 10 ч. Содержимое сосуда тащательно перемевивабт. Затеи открывают кран и про"Изводят промывание содержимого сосуда укаэанным выше буфером. Собираютфракции по 50 мл. В каждой фракцииопределяют концентрацию стромальногобелка,Наибольшую концентрацию стромынаходят в 2-4 фракциях. фракции, содержащие строму, объединяют и под-вергают однократному центрифугированию при 6000 об/мин в течение20 мин. Получают 2,8 мл взвеси стромы с концентрацией по белку 1,8 мг/мли отрицательной реакцией на гемоглобин (определяют цианатным методом ). Выход стромы составляет 003.Содержимое сосуда промывают до отрицательной реакции на белок ( 8 фракция), затем производят смзну буфера.,Дальнейшее промывание производят310 мосм Фосфатным буФером рН 7,4.При этом снимают адсорбированный насефадексе гемоглобин. Концентрациюгемоглобина определяют фотометрическим методом.Наибольшую концентрацию гемоглобина находят в 9-12 Фракциях, Этифракции объединяют. Концентрация гемоглобина в объединенном растворесоставляет 2,7 мг/мл, а выход в че"тырех фракциях по гемоглобину 903от нанесенного на сефадекс. В последующих Фракциях.3-15 определяютнезначительное количество гемоглобинаОбщий выход по гемоглобину составляет96.П р и и е р 2. 2 мл отмытых отплазмы эритроцитов гемолиэируют в 8 мл 1 О мосм йа-фосфатного буфера рН 6,1 и приводят в соприкосновение с 2 г См-сефадекса, набухшего в этом же буфере.Далее троизводят операции согласно примеру 1, Получают 2,5 мл стромы с концентрацией по белку 1,9 мг/мл. Выход стромы составляет 983. В объединенных фракциях, содержащих гемоглобин, концентрация гемоглобина составляет 2,6 мг/мл, а выход по гемоглобину в 4-х фракциях -881. Общий выход по гемоглобину составляет 96.П Р и м е р 3. 2 мл отмытых от плазмы эритроцитов гемолиэируют в 8 мл,10 мосм йа-фосфатного буфера рН 6,5 и разделяют иа 2 г СМ-сефадекса, набухшего в этом же буфере. Далее производят операции согласно приме" РУПолучают 2,6 мл стромы с концентрацией )о белку 1,8 мг/мл. Выход стромь составляет 1003, Концентрация гемоглобина в объединенных фракциях составляет 2,8 мг/мл, а выход по гемоглобину - 93,3, Общий выход по гемоглобину 97,53.Использование изобретения позволит получить высокоочищенные препа/раты стромы и гемоглобина, необходимые при получении лекарственных препаратов иэ крови,Способ разделения эритроцитов на гемоглобин и строму путем гемолиэа эритроцитов с последующим отделением гемоглобина от стромы биофи" зическим методом, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевых продуктов, гемолиз ведут при рН 6,1-6,5 а гемоглобин отделяют от стромы ионообменной хроматографией,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Физико-биохимические и цитометрические методы исследования эритроцитов. Барнаул, Алтайское книжное издательство, 1976, с.62-64,