Способ получения цитидин-5″-дифосфатхолина

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИЛЕТЕЛЬСТВУ Ьщч(51) Ы. Кл. С 12 1) 13/00 Росу(тарствеиный комитетСовета Министров СССРоо (телам и.и 1 бретеиийи открытий(45 Лата опубликования описания 2) Авторы изобретени В.К.Кайсала, С.Э,Ансберга и В.П.Кау Заявитель 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТИДИН-ДИФОСФАТХОДИН лью изоб выхо атения является повытидин-дифосфатхолиорослей вводят /мл. Аденозин и 1,б-дифосетственно в 10-30 мг/мл. ледующим обзеленых воде 0,05 - 0,1 мрную кислотувводят соот7-8 мг/мл исуществляют Экстракт в количеств-5-трифосфо фатфруктозу количествах Способ о разом. Биомассу мик тительно дрожже фатном буфере и 2-4 дней для ос вания. Ферментных шает отщепление ных веществ (ну лисахаридов), 0 и тем- очисткой оорганизмов, предпочвыдерживают в фоси -20 оС в течение обождення и активирокомплексов, что улуч ферментов от балластлеиновых кислот и постногод цитиолина),ствиеа ингибирует а мплекс Изобретение относится к техникеполучения биологически активных веществ, а именно цитидин-дифосфат(холина, используемого в качестве посредника в биосинтеэе Фосфолипидовмикробиологической промышленности,также в качестве эффективного лекарства при лечении болезней голов-,ного мозга в медицине.Известен способ получения цитиди-5 -дифосфатхолина путем биологического фосфорилирования фосфорилирующсмеси, состоящей из биомассы микроорганизмов, предпочтительно дрожжейпроизводного холина, источника сахара, сульфата магния, фосфатного буфера и воды при рН равном 7,пературе 30 дС с последующейцелевого продукта (13 .Указанный способ является наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату.Основным недостатком извеспособа является низкий выходин-дифосфатхолина (ЦДФ-хравный всего лишь 50, вследприменения в среде биосинтезтора-глюкозы, которая ингибитивные центры ферментного ко,шение д цина,Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения цитидин-дифосфатхолина перед фосфорилированием смеси биомассу микроорганизмов выдерживают в фосфатном буферепри -20 С в течение 2-4 дней, приэтом в состав Фосфорилирующей смесидополнительно вводят экстракт зеленых(водорослей и аденозин-трифосфорную кислоту, а в качестве источникасахара используют 1,б-дифосфатфруктозу,1528 5 1 О 15 формула изобретения 25 30 35 40 45 50 Составитель А.БражниковаРедактор Н.Самедова Техред М.Борисова Корректор А,Кравченко Заказ 6287/26 Тираж 526 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3 63В среду биосинтеза, содержащую выдержанную в фосфатном буфере и оттаявшую биомассу микроорганизмов, производный холина, источник сахара, сульфат магния,Фосфатный буфер и вОду,дополнительно вводят экстракт зеленых водорослей 0,05-0,1 мг/мл и аденозин-трифосфорную кислоту 7-:8 мг/млВ качестве источника сахара используют 1,б-дифосфатфруктозу 1030 мг/мл,Фосфорилирование фосфорилирующейсмеси проводят при рН,0 и 30 С споследующей очисткой целевого продукта.В качестве биомассы микроорганизмов используют пивные дрожжи 5 асспоосщсеа сеечмае.Экстракт зеленых водорослей используют в качестве источника Фосфорилирующих ферментов, необходимых дляпревращения цитидин-монофосфата в/цитидин-дифосфорную кислоту, ааденозин-трифосфорную кислоту - вкачестве источника макроэнергии и ввиде макрознергетических фосфатныхсвязей в . затравкой - началом цепипревращений, необходимых для синтезацитидин-дифосфатхолина.Введение в смесь 1,б-дифосфатфруктозы является необходимым дляобразования цитидин-дифосфатхолинав Ферментных процессах, так как этовещество является конечной формойпревращения сахаров в гликолитическом цикле.П р и м е р 1. Предварительно высушенные пивные дрожжи 5 ассИагатусезсегечеае 100 мг (влага30) суспендируют в 10 мл фосфатного буферакалия и выдерживают 2 дня при -20 С,Суспензию оттаивают при комнатнойтемпературе и добавляют, мг/мл:ЦМф - Ма- 7,38; холин; 1,6-дифосфатфруктоза - 20; М 604 2 НО 2,96;АТФ - 4; и 3 мл экстракта зеленыхводорослей. Общий объем реакционнойсмеси дистиллированной водой доводятдо 30 мл и культивируют 4 ч при+30 дС.фЦитидин-дифосфатхолин очищаютна ионообменной смоле известным методом. Выход составляет 80.П р и м е р 2, Подготовку биомассы дрожжей проводят согласно примеру 1. Добавляют 10 мг/мл 1,6-дифосфатфруктозы. Выход составляет 80,Добавляют 30 мг/мл 1,6-ДФФ.Выход составляет 79.П р и м е р 3. Подготовку биомассы дрожжей проводят согласно примеру 1. В смесь биосинтеза добавляютб мг/мл АТФ. Выход составляет 80.В, смесь биосинтеза добавляют8 мг/мл АТф. Выход составляет 82,П р и м е р 4. Биомассу дрожжейвыдерживают при -20 С 4 дня. Составсреды, температура и длительностьбиосинтеза, как в примере 1. Выходсоставляет 80. Технико-экономический эффект предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в повышении выхода целевого продукта цитидин-дифосфатхолина на 30. 1, Способ получения цитидин-дифосфатхолина путем биологического фосфорилирования фосфорилирующей смеси, состоящей из биомассы микроорганизмов, предпочтительно дрожжей, производного холина, источника сахара, сульфата магния, фосфатного буФера и воды при рН равном 7,0 и температуре 30 С с последующей очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю,щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода, перед фосфорилированием смеси биомассу микроорганизмов выдерживают в фосфатном буфере при -200 С в течение 2-4 дней, при этом в состав фосФорилирующей смеси дополнительно вводят экстракт зеленых водорослей и аденозин-трифосфорную кислоту, а в качестве источника сахара используют 1,б-дифосфатфруктозу.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что экстракт зеленых водорослей. вводят в количестве 0,05- О, 1 мг/мл.3. Способ по п,1, о т л и ч а ю -1 щ и й с я тем, что аденозин-трифосфорную кислоту и 1,б-дифосфатфруктозу вводят соответственно в количествах 7-8 мг/мл и 10-30 мг/мл.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент США 9 3684652,кл,195-28, 1972.