Способ выделения внутриклеточной аминопептидазы

(11) 6143.13 Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет 51) М. Кл, С 07( фА 6 Д К 02 8 Государственный номнтеСовета Инннстров СССРпо делам нзобретеннйн открытнй Опубликовано 05.07,78.Бюллетень25Дата опубликования описания ч, 06. 8,53) УДК 577.15.Авторызобретеии Р. К. Вайткявнчюс, Л. К. Чяпене, Г. Б, Масюи Л. М. Антоненкова нтут биохимии АН Литовской СС(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ АМИНОПЕПТИДАЗЫ ИЗ Васеейцв енЬ 66 е ся к области энзимолоению внутриклеточных ь использовано в ферческой промышленносИзобретение относит а именно к выделментов, и может бы ной и микробиолег багии фе ме кле 6 в и фу. ляют ония ской елка,до а с7 и,8 -качестве соличтительно исполь бромистый.имер. Биомассу В внеклеточных пр 4 М МаС клеток для разрушен нмл гомогената в течение 20 мвешенных частиц,одят до 6,5, охла алкилтри метиламмония зуют цетилтриметилампредп моний ас 1 пз зпЫз отделяимесей, взвесь промыобрабатывают ультрая клеток. Полученные центрифугируют при ин для удаления круппри помоци 2 М МаОН ждант до 4 С и добав тых 0,0 звуком 7470 . 4000 хд ных вза рН дов ти.Известен способ выделения внутриклеточных ферментов, например аминопептидазы, включаюгций отделение клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток, центрифугирование оставшейся массы на высокоскоростной центрифуге, осаждение ферментов суль-. фатом аммония, диализ и выделение ферментов методом адсорбции прн рН 5,8 - 6,5 11.Однако этот способ трудоемкий, поскольку затруднено центрифугирование, а диализ занимает около 60 ч, выход ферментов низкий,Целью изобретения является повышение выхода выделяемой внутриклеточной аминопептилазы.Поставленная цель достигается тем, что в полученный после центрифугнрования экстракт добавляют соль или смесь солей алкилтриметиламмония с числом атомов углерода в алифатической цепи от О до 6 по 0,4 - 0,5 г наг белка, экстракт подвергают повторному центрифугированию и в надосадочную жидкость добавляют наг белка по 0,07 - О,З г ненонного детергента с гидрофильно-липофильнылансом 2 - 17.Предлагаемый способ выделения внутрточной аминопептидазы из Васцз зпзаключается в отделении клеток от культуной жидкости, разрушении клеток, центргировани и экстракта, в который доба всоль или смесь солей алкилтриметиламмс числом атомов углерода в алифатичеОцепи от 10 до 6 по 0,4 - 0,5. г наг бповторном центрифугировании экстрактабавлении в надосадочную .жидкость набелка по 0,07 - 0,3 г неионного детергенгидрофильно-липофильным балансом 12 -адсорбции целевого продукта нри рНЙ 6,5.В643 Формула изобретения Составитель Г. КонноваТекред О. Луговая Корректор С. Патрушева Тираж 559 Годписное Редактор Т. ШаргановаЗаказ 3641/24 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретениИ и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал П 1 П Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4ляют при перемешивании 58 г цетнлтриметнламмония бромистого, предварительно растворенного в 200 мл теплой дистиллированной воды, Смесь перемешивают 10 мин, оставляют на 30 мин при 4 С и центрифугируют при 4000 х 11 в течение 30 мян. Полученную прозрачную надосадочную "жидкость коричневого цвета фильтруют. Получают 4950 мл фнльтрата, содержащего 118 г белка и 25800 Е аминопептидазнои активности (удельная активность 0,22 Е/мг).К фильтрату добавляют 200 мл 5%-ного раствора синтанола ДСО. 5150 мл полученного раствора пропускают двумя порциями по 2575 мл через две колонки диаметром 70 мм н высотой 210 мм, заполненных диэтиламиноэтилцеллюлозой, уравновешенной фосфатным буфером, рН которого 6,5 и ионная сила 0,02 М, содержащим О,ОЗ.М ИаС. После сорбцин каждую колонку промывают 3 л фосфатного буфера, содержащего 0,05 М ИаС 1, а аминопептидазу элюируют фосфатным буфером, содержа. щим 0,2 М ИаС 1. Получают 1618 мл активного элюата, содержащего 3,.1 г белка и 18160 Е аммиопептидазной активности (удельная активность 5;9 Цмг. Виход по активности 70,4%.Вместо цетилтриметиламмоиия бромистого можно использовать соли илн смеси солей алкилтриметидаммония с числом атомов углерода в алифатической цепи от 1 О до 16, а вместо синтанола ДС 1 О. - другие неионные детергенты с гидрофильно-лнпофнльным балансом 12 - 17;Активность аминопепгндазы определяют по расщеплению 0,5 мл раствора лейцнл-нафтиламида при 37 С в 0,05 М цитратвероналовом буфере ГрН 8,), содержащем 0,045 М кобаль. та азотнокислого. Количество образующегося 2-нафтиламина определяют с помощью красителя Гранатового прочного ГБЦ. За единицу активности (Е) принимают количество фермента, расщепляющего за 1 минмкмоль лейцил-нафтнламида. Концентрацию белка определяют биуретовым методом,По сравнению с известным способом выход увеличивается на 30 - 40%. 1. Способ выделения внутриклеточной аминопептидазы из Вас 1 цз зцЬ 1 з, включающий отделение клеток от культуральной жидкости, разрушение клеток, центрифугирование экстракта и выделение аминопептидазы при рН 5,8 - 6,5, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, в полученный после центрифугнрования экстракт добавляют соль или смесь солей алкилтрнметиламмония с числом у атомов углерода в алифатнческой цепи от 10до 16 по 0,4 - 0,5 г на 1 г белка, экстракт подвергают повторному центрифугированию и в надосадочную жидкость добавляют на 1 г белка по 0,0 - 0,3 г неионного детергента с гидрофильио-липофильным балансом 12 - 17, :5 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вкачестве соли алкилтриметнламмония использу, ют цетнлтриметнламмоний бромистый. Источники информации,ерикятые во внимание при экспертизе:1. Я. Мпапщга, Я. Ма 1 зшвшга, Т. Рава. во 1 о, Х. Гцсцво 1 о, Еп 1 гасе 1 цаг Рер 1 Ыазе оЕ Васцз зцЫзэ, 1. Арг. Во. Спет,533, 653, 1969.