Способ выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) (11) 1 К 37/22 ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯПРИ ГКНТ СССР КОМИТЕТ ОТКРЫТИЯ й ПАТЕЙ Джеимсадлей С (щ) д В 1 орЬуз. Иэобрете ожет быт к медицин е относит з клето ощение спцелевого изоб ения -соба и повыш качест фики за- олюбилиа вых ентраПрепаратирозом светопрело иным обра- (ф при 25 С ных конценевиныпричферованные трис-оснонные опис ции мочеви 1. Солюбил ия бычье Б), эксляющие тела ействию раз Пример о И-метионилсом прессированного Собранные кле ая их два разаатотропина (МВв Е.Со 11,тки разрывают,через гомогениэ двергают возаций водного вора моч , Все заб 00 ммоль опусор зных значения створы содерж ИСАНИЕ ИЗ(72) Лерри Эндрю Бэнтл,лиэм Митчелл, Стифен Бри Грант Тсуъеши Шимамото(56) Агс 1 с, оГ В 1 осЬеш.1970 ф т 138 р 338-346 использовано для выделения соматотропного белкЕ.Со 11,продукта.На фиг. и 2 приведены г висимости общего количества . эированного белка от концен мочевины; на фиг.3 - график мономера в зависимости от к(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СОМАТОТРОПНОГОБЕЛКА ИЗ СВЕТОПРЕЛОМЛЯЮЩИХ ТЕЛ КЛЕТОК .ХОЗЯИНА(57) Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина. Цель -упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет сохранения его нативных свойств, Для этогосолюбилизацию белка проводят 4,5-10 Мествором мочевины или диметилсульфо в ,на при рН 9-2, и 4-25 С, а натурацию осуществляют в водном растворе2-5 М мочевины при указанных значениях рН и температуры, причем вторуюоперацию проводят в присутствии мягкого окислителя. 4 табл. типа Мапсоп-Саи 11 п Ьощо яеп 1 яег, Раствор гомогената подвергают низкоскоростному центрифугированию, в резуль-.тате чего светопреломляющие тела, содержащие МВБ, осаждаются. Надосадочную жидкость выбрасывают, повторно .свзвешивают светопреломляющие тела,промывают и снова центрифугируют нх.Опять выбрасывают надосадочную жидкость и получают преперат светопреломляющих тел,1542402 КонцоитроЧия а%мы Р Составитель А.Агуреевактор И.Дербак Техред М.Моргентал Корректор Т.Пал при ГКНТ ССС Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,я 0 3: Заказ 1463 Тираж 539ВНИИПИ Государственного комитета113035, Москва,Подписное о изобретениям и открытия 35, Раушская наб., д. 4/5вания, Регулирование значения рН осуществляют добавлением НС 1. Конечная концентрация светопреломляющих тел составляет 4 мг/мл раствора. Степень растворения определяют спектрофотометрически, принимая светопреломляющие тела полностью белковыми и используя коэффициент экстинкции Е = = 0,68 при 277 нм в длине пути 10 1 см в качестве показателя концентрации белка 1 мг/мл. Исходную концентрацию определяют спектрофотометрически для полностью растворенной пробы. 15Результаты описанного опыта представлены графически (фиг.1). Эти данные подтверждают, что регулировка значения рН с обеспечением щелочных условий существенно увеличивает степень солюбилизации. П р и м е р 2. Проводят аналогично примеру 1, но температуру выдержиовают на уровне 4 С и значение рН регулируют и в сторону кислой и в сторону щелочной реакции. Все забуферованные растворы содержат 100 ммольтрис-основания. Регулирование значения рН в сторону кислой реакции осу ществляют добавлением уксусной кислоРезультаты этого опыта представлены графически (фиг.2). Сравнение данных фиг.1 и 2 показывает, что при постоянной концентрации раствора мочевины,и данном значении рН степень солюбилизации при пониженных температурахо(4 С) выше, чем при комнатной температуре (25 С), 40П р и м е р А (сравнительный). Содержащие МВБ светопреломляющие тела приготавливают согласно примеру 1, Светопреломляющие тела смешивают с 10 М раствором мочевины без регулиро вания значения рН, так что окончательная концентрация тел составляет около 5,0 мг/мл. Затем смешивают раствор и в целях установления равновесияОвыдерживают его при 4 С в течение ночи. Затем спектрофотометрическим способом определяют степень солюбилизации, которая составляет всего лишь около 2,9 мг/мл. Исходную концентрацию светопреломления тел определяют путем добаВления достаточного количества раствора мОчевины в целях полного их растворения и спектрофотометрического измерения полностью раство-,ренного раствора. Затем исходную концентрацию соответственно понижают,П р и ме р Б (сравнительный). Содержащие МВБ светопреломляющие телаФ приготавливают согласно примеру 1. Затем смешивают с 8,0 М водным раствором мочевины без регулирования значения рН, так что окончательная концентрация тел составляет около, 5,0 мг/мл, Раствор затем смешивают и в целях установления равновесияоего выдерживают при 4 С в течение ночи. Спектрофотометрическим спосо-бом определяют степень солюбилизации, которая составляет около 2,4 мг/мл. Исходную концентрацию светопреломляющих тел определяют путем добавления достаточного количества раствора мочевины в целях полного их растворения и спектрофотометрического измерения полностью растворенного раствора. Затем исходную концентрацию соответственно понижают.П р и м е р 3. Светопреломляющие тела, содержащие МВБ и приготовленные, аналогично примеру 1, смешивают с небуферованным водным 4,5 М раствором мочевины так, что концентрация светопреломляющих тел составляет около 66 мг/мл. Значение рН раствора с помощью разбавленного раствора едкого натра повышают от 7 до 11. Осветлившийся раствор показывает полную солюбилизацию. Определенная по примеру 1 спектрофотометрическим анализом концентрация светопреломляющих тел составляет бб мг/мл.П р и м е р 4. Содержащие МВБ светопреломляющие тела, полученные по примеру 1, солюбилизируют в водном 7,5 М растворе мочевины, содержащем 100 ммоль триса при значении рН 10,5, Концентрацию мочевины поддерживают на разных уровнях, добавляют 100 ммоль триса, и выдерживают общую концентрацию белка около 1 мг/мл, определенФную спектрофотометрическим анализом полностью растворенной пробы, добав.ляя определенное количество соответствующего раствора мочевины. Затем растворенный МВБ окисляют, подвергая раствор воздействию воздуха и перемешивая его в течение суток. Результаты представлены графически (фиг.З). Выход мономера МВБ указан в виде весовых процентов общего содержания МВБ.Оптимальная натурация достигается02 окисляют кислородом воздуха в течение ночи с перемешиванием. Данные БЖХ-анализа показывают, что оптимальный выход мономера МРЯ достигается при концентрации мочевины 3 М.П р и м е р 8. Аналогично примеру 7 солюбилизируют МРБ при 4 С в водном 7,5 М растворе мочевины со значением рН 11, отрегулированном добавкой 90 ммоль триса. При этом приготавливают растворы трех разных концентраций (20,40 и 80 мг (мокрого) шарика на 1 мл указанного раствора мочевины); Пробы растворов разбавляют 90 ммоль триса и/или мочевиной в целях получения 3 М концентрации мочевины и концентраций МРЯ 1 мг/мл, Разбавленные растворы МРБ с перемешиванием подверо гают воздействию воздуха при 4 С .в течение 56 ч. БЖХ-анализ показывает средний выход мономера МРБ, равный 69 мас.7.,П р и м е р 9. Проводят аналогично примеру 8, но солюбилизацию и на-; турацию осуществляют в присутствии 0,1 ммоль 1,4-дитиотрейтола. БЖХ-анализ показывает средний выход мономера МРБ, равный 66 мас.7,.П р и м е р 1 О. Три варианта ВСН: А 1 а , А 1 а Ч и МесЧа 1 дб, экспрессируют в Е.Со 11 по известным .приемам. Отдельные варианты ВСН солюбилизируют и подвергают натурации аналогично примеру 1.Содержащие соответствующие варианты ВСН светопреломляющие тела выделяют аналогично примеру 1. Затем взвешивают в воде около 300 г (в мокром состоянии) тел с получением 1 л взвеси. Последнюю добавляют к 5 л 9 М мочевины и 108 ммоль триса, в результате чего получают солюбилиэирующий раствор, включающий соответствующий вариант ВСН в 7,5 М мочевины и 90 ммоль триса при значении рН 0,5 и 4 С. После перемешивания в течениеонескольких минут солюбилизацию завершают. Затем медленно добавляют 4 л холодной воды с получением предназна-ченного для натурации раствора, содержащего соответствующий вариант ВСН в 4,5 М мочевины и 54 ммоль - триса призначении рН 10,5 и при 4 С. Раствор перемешивают и соответствующий ВСН окисляют, подвергают раствор воздействию воздуха в течение 48 ч. Растворы с окисленными вариантами ВСН подвергают БЖХ-анализу, который для 5 15424при концентрации мочевины около 4,5 М(фиг.3).П р и м е р 5. Согласно примеру 4содержащие МВБ светопреломляющие те 5ла солюбилизируют в водном 7,5 М растворе мочевины с содержанием100 ммоль триса и со значением рН10,5. После солюбилизации раствор разбавляют 100 ммоль триса до концентрации мочевины 4,5 М, после чего значение рН доводят до значений в пределахот 10,5 до 85. Затем отдельные растворы окисляют кислородом воздуха сперемешиванием в течение суток. Содер жанне мономера и олигомера определяютпо данным БЖХ. Хотя результаты указы-:,вают на то, что зависимость эффективности натурации от значения рН в течение процесса окисления относительно 20ровная, но тенденция к увеличению эффективности по мере повышения значения рН наблюдается. Кроме того, процесс катализируемого основанием окисления протекает тем быстрее, чем бо-ь 25лее выражена щелочная реакция раствора,П р и м е р 6. К 850 мл водного5,3 М раствора мочевины при 4 С добавляют 150 мл полученного по примеру 1 препарата светопреломляющих тел.Значение рН полученного 4,5 М раствора мочевины 50 мас.7.-ного раствораедкого натра доводят до 11. Тела полностью растворяются, в результате чего получается общая концентрация МВЯоколо 12,4 мг/мл. Затем раствор переомешивают при 4 С в течение ночи в целях окисления МВБ. В соответствии сданными БЖХ-анализа окисленного раствора в результате получают выход мономера МВЯ, равный 80 мас.7,П р и м е р 7. Свиной Я-метионилсоматотропин (МРЯ) экспрессируют в.Е.Со 1 ь После выделения содержащих 45МРБ светопреломляющих тел по описанному методу. последние солюбилизируютопри 4 С в 7,5 М растворе мочевины созначением рН 11,0, отрегулированномдобавкой 90 ммоль триса. Затем на1 м полученного раствора мочевины растворяют шарик светопреломляющего те,ла весом 113 мг (в мокром состоянии).Затем пробы разбавляют 90 ммоль трисаи/или мочевиной в целях получения раствора мочевины концентрацией 4,5;3,0 и 2,0 М с концентрацией МРБ4 мг/мл, считая на вес мокрого шарика светопреломляющих тел. Потом пробывсех трех вариантов ВОН показываетвыход мономера 60-70 мас. .П р и м е р 11. Структурную гомологию соматотропинового белка, полученного описанным образом, и соматотропина, вырабатываемого гипофизом,определяют методом С 1 гсц 1 аг йхсЬгошзш. Сравнивают МВБ и вариант А 1 а,соматотропина ВОН с бычьим соматотро- Опином. Пробы растворяют в растворе50 ммоль бикарбоната натрия при значении рН 9,5 и анализируют нх описанным приемом,Данные этого анализа показывают, 5что полученный описанным образом рекомбинантный соматотропин после натурации имеет свою нативную конформациюСпектральные данные приведены в 20табл. 1 и 2. П р и м е р 12. Содержащие МВБ светопреломляющие тела приготавливают 1аналогично примеру 1 и смешивают с 25 небуферованным 1,0 М водным раство- . ром мочевины при 4 С. Добавкой гидро- окиси натрия доводят значение рН до 12,1 и выдерживают его на этом уровне. Осветление раствора говорит о за вершении солюбилизации, Концентрацию светопреломляющих тел определяют аналогично примеру 1 методом спектрофотометрического анализа, которая составляет около 10 мг/мл.П ри м е р 13. Содержащие МВБ светопреломляющие тела приготавливают аналогично примеру 1. Затем их растворяют в 3,0 М раствора диметилсульфона при 28 С (рН 11,8) при концентрации МВБ 2 мг/мл, В результате окисления кислородом воздуха растворенного МВБ получают продукт, который (судя по степени межмолекулярной связи),только незначительно отличаются от продукта, полученного с применением 4,5 М раствора мочевины со значе- нием рН 11,3 (50 ммоль триса) приСолюбилиэованные и натурированные описанным образом соматотропины затем . очищаютсяпо стандартным хроматографическим йриемам. Биоактивность соматотропинов показана положительной реакцией, вызванной ими в испытаниях, основанных на росте крыс (гас аго 7 гЬ Ьхоазву).При этом биоактивность гетерологового саматотропина определяют относительно известного количества соматотропинавого материала (например, бычьего или свиного гипофизарного соматотропина), устанавливая взаимосвязь между увеличением в весе крыс, подвергнутых гипофизэктомии, и разными количествами введенного в их организм испытуемого материала. Наклон регрессии увеличения в весе тела в сравнении с дозами введенного специфического соматотропинового материала сравнивают с известным стандартным материалом (например, гипофизарным) и подсчитывают относительную биоактивность гетерологового соматотропинового материала вед./мг гормона роста.Бычий И-метионилсоматотропин, солюбилиэированный и натурированный по предлагаемому методу, очищают, а затем вводят в организм молочных коров, Молочные коровы, которым введен подобный препарат, продуцируют на 10- 40 мас.больше молока, чем контрольные животные.Выражение соматотропин" включает соматотропины млекопитающих, например человеческий, овечий, свиной и бычий соматотропины, и другие соматотропины, например птичий, а также системы, включающие аналоги и гомологи встречающегося в природе белка, проявляющего саматотропиноподобную биоактив-. ность, например пролактин и лактоген (НР 1,) .Гетерологовые белки - это белки, которые обычно не вырабатываются клетками хозяина, Благодаря технологии рекомбинации ДНК стало возможно экспрессировать относительно большие количества гетерологовых белков из трансформированных клеток хозяина, Однако, эти посторонние белки часто замаскированы в нерастворимых светопреломляющих телах в цитоплазме клеток хозяина.Сложение - восстановление общей конформации белка, достаточной для осуществления окисления надлежащим .образом. Процесс сложения осуществляется путем сокращения денатурирующего действия мочевины, если необходимо, за счет понижения ее концентрации до нужного уровня для обеспечения взаимодействия последовательности аминокислот белка и достижения нативной вторичной и третичной струк- тур9 15424Окисление - образование внутримолекулярных дисульфидных связей в целях получения устойчивой нативной конформации, обеспечивающей требуемую биологическую активность.Мягкий окислитель - вещество, содействующее окислению сульфгидрильных групп для образования внутримолекулярных дисульфидных связей беэ окис ления других заместителей данного белка. Хотя можно пользоваться и.такимимягкими агентами, как перекись водорода, но вполне достаточно (и пред-. почтительно) использовать для этих 15 целей воздух.Биологическая активность - способность соматотропина к осуществлению его предполагаемой физиологической реакции 1 п чЫО, В случае отсутствия испытания на специфическом виде животного дп чЫО биологическую активность можно олределять путем проведения подходящих биологических испытаний, Подходящим биоиспытанием для со-. 25 матотропинов по предлагаемому способу является биоиспытание для опреде-. ления увеличения в весе у крыс. При этом испытании определяют биоактивность соматотропиновых препаратов по 30 сравнению с известными препаратами (например, экстрагированным нативным соматотропином), устанавливая связь между степенью увеличения в весе у крыс подвергнутых Гипофиээктомии и З 5 разными количествами введенного в организм крыс препарата.Соматотропины - это гормоны, выделяемые аденогипофизом (передней долей гипофиэа) и стимулирующие Рост скеле та и увеличение веса тела. Соматотропины обычно содержат 191 аминокислотных остатков и имеют мол.массу "22000 дальтон. Полная последовательность аминокислотных остатков установ лена для соматотропинов разных видов, в том числе людей и животных, например птиц (птичий соматотропин), овец 02 10(овечий соматотропин), свиней (свиной соматотропин), крупного рогатого скота (бычий соматотропин).В табл.З изображена первичная структура саматотропинов разных видоке животных, причем ВСН - бычий соматотропин, РСН - свиной соматотропин, ОСН - овечий соматотропин, АСН- птичий соматотропин, НСН - соматотропин человека; символ "Х" обозначает промежуток в последовательности и вставлен для иллюстрации расположения типовых соматотропинов, При нумерации аминокислотных остатков специфической последовательности эта вставка не принимается во внимание, например в ВСН позиция 126 представляет собой 1.еи (или Ча 1, как в случае аллельного варианта, использованного в примере 10).Табулированные относительнйе количества специфических аминокислот, основанные на описанных последовательностях, приведены в табл.4.Формула и э О б р е т е н и яСпособ выделения соматотропного белка из светопреломляющих тел клеток хозяина, включающий проведение солюбилиэации с последующей натурацией и очисткой целевого продукта, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества целевого продукта за счет сохранения его нативных свойств, в качестве клеток хозяина используют бактерии Е.СО 1, солюбилиэацию проводят 4,5- 10 М раствором мочевины или диметилсульфона при РН 9-12,1 и температуре 4-25 С, а натурацию осуществляют в водном растворе 2 - 5 Ммочевины при РН 9 - -12,1 и. температуре 4-25 С, причем солюбилизацию проводят в присутствии ипи отсутствии восстанавливающего агента,-а натурацию - в присутствии.мягкого окислителя.1542402 Таблица 1 Данные по Уф и видимой области Параметры ГГипофиз МВБВариант А 1 а, М-12162 М-01203 2561190-20 278,5 278,2 278,215,042 + 4400,690 Ем .л/, ,осм 14,935+ 216 15,150+ 100 0,680 0,693 П р и м е ч а н и е. Ем - коэффициент экстинкции при 278 нм.4Ао - нормализованная абсорбция 1 мг/млюсмраствора в ячейке размером 1,0 смпри 278 нм.1 Таблица 2 Данные по А нм), полученные методом Сегси 1 аг с 11 сЬго 1 зв МВБ Вариант А 1 а14 1542402 Таблица 3 1 20РЬе-Рго" А 1 а-Ие 1-Бег-Ьеи" БегУ-Ьеи-РЬе-А 1 а.Авп-А а-Ча 1.Ьеи-АгВ-А 1 ап-Ндв.Ьец ВОН РСН ОСИ ееееееа"ге.Ргоеае-Беге ее ватага гав.-еетеаТуг-еее-агагает-геА 1 а те етееа е е ае еа АСН НОН еееЬецае аВСН РСН ОСН АгВТуг еееееееегаге.ееА 1 аттА 1 ае тее егеа аАСН НСН еее-е-еТЬгЬ уз РгоТЬг-С 1 уе ВОН РСН ОСН тАСН КОН еееБег-Азп-А 1.ецЬецеСее У ВСН РСН ООНВСН РСН ОСН АСН НСН гетегета-ееееаРЬее-гаагаее;тее"Туга".А 1 ае е е в аег еееАвп-БегАвраее.-е-.-АзрЬеце-АзрЬеи-К 1 в-Ьуз-ТЬги-ТЬ АСН НСН еее 11 е 1 ВОг-Туг-Ьеи-АгВ-Ча 1-ИейВСН С 1 уЬеи-Ьеи-Яег-Сув-РЛе АгВ-Ьуз"1.увРСН ОСН гетега.ее.еа-еА 1 а-а е ее е егагат-Ьув"аЧа 1"а"е-е-е-пузеееаее рЧа 1 РЬеааее 11 еЧа 1в е"а-е-еТугег-А90ув А е-И 1 аег-С Суз"АгВ-АгВ-РЬее 61 уи-А Ча 1 а 5 1 а-РЬеЕГае-г Авпе-Т Бегат 01 уЬге 1 у е"-е-ХаеБег-Ча 1 а-еее-ее-С ВСК РСН ОСК АСН КОН ВОН РОН ОСН АСН КСН ЬувС 1 пе-Рго"АгВ.Авр;-Иес.Н 1 в.АгВ ЭО 40аА 1 аАврТЬгРЬеЬувС 1 иРЬеС 1 иАгВТЬгТугеРгоС 1 иуС 1 пе е еа 61 п уг ее е е е ааАзраега- РЬеее.еге"-ТугпеегегееееС 1 ц-А 1 ае-еее.ее.еЬувС 1 иеее-е50 60БегеХ 11 еС 1 п"АзпТЛг-С 1 пЧа 1-А 1 аРЬеСув-РЬе.Яег-С 1 цТЬг 11 еРгоА 1 ае ег гаага те ее-еАвп-Ьув-еееБегеееА 1 аеееаггее.Туге е ее еа РЬеЬецее"гетеРгоеее"ТЬгБегЬеиееегеееааеагаБегеа- ТЬге70 ВО "ЬузАзп-С 1 цА 1 а-С 1 п-С 1 пЬувБег-АзрЬеи-С 1 ц-Ьеи-Ьеи-АгВ 11 еБегЬеце ее-еАвр-.е-ае-ееееатаАгВ-атаЧа 1-а-ае-ееРЬееееееееее ее-Авр"Азр- Иесу"РЬе гВ.С 1 иеееаТЬгт ееееа-гете-АзпеС 1 а тт90 100 1 п-Бег-ТгрЬец 01 уРгоЬец 61 п-РЬе-ЬеиБегАгВЧа 1-РЬеТЬгАзпБеге а ге т ае е е тете ге аег гееТЬгаеееЧа 1 еееТугегетега-Ьузе ееееаАвпее.еС 1 цтеееЧа 1 в -гееАгВБеге-.ееА 1 аеееееееее110 120Азр-АгВ-Хе-Ча 1-Туг-С 1 и-Ьуз-Ьеи-ЬувАзр-ЬеиС 1 и 61 иС 1 уе е г е е г е а е е 130 140 АгВц-Ьеци-Авру-ТЬг-Рго-АгВ-А 1 аупе-Ьеи-Ьуза-гаетеегагааБегагаее-еее-гагаЧа 1ег а а "гааге-е-тегагатАгВ-Бег"ее-аС 1 у-Ргое-Ьеце-ееАгВ С 1 уАгВ-гетега-е-аае-.Бегае-ТЬг.егРЬеееете150 160 РЬе-Азр.ТЛг-Азп-ИеС-АгВ-Бег-Авр-Авр-А 1 а-Ьеи-Ьеи-Ьув-Азп-Туга теа е а1542402 16 Табица 4 Соматотропин Аминокислота Аспарагиновая 10 10 10 Жспарагин 9 12 2 1 О ТреонинСерииГлютамино 18 13 14 13 12 вая 13 10 Глютамин Пролин ГлицинАланииВалинМетионин 17 Изолейцин 26 26 26 Лей цин Тирозин 13 13 Фенилаланин 13 13 14 13 13. 12 12 ГистидинЛизин .АргининТриптофанЦистеин Челове- Бычий ОвечийСвиной Птичийческий 13 1311 116 610 914 146 747 727 27