Способ получения эндонуклеазы рестрикции

(9) (5)5 С 12 й ИСАНИ ОБРЕ Е ТОРСК СВИДЕТЕЛЬ СТ Изобр биотехнол эндонукле сы Хапйоп) зовано в ге биологии.Цель и биохимии и ба полученияиз биомасбыть исполь- олекулярной тение относится к гии, касается спосо зы рестрикции ХЬа опаз Ьадг и может нной инженерии и м 0,35 0,4вания смтечениелевую фсобираюгепаринс бд Ь 4 Од обретения - упеменным повылевого продуктосуществляют оцесода и ние п са с одновр качества цеСпособ м ющим обра зом.БиомаВ(АТультразвукдобавляютэтиленгликном буфконцентра7;ь, декстр К мощью ге нату ь поли- осфатечной ликоля рации ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) Майстренко В.Ф, и др. Метод выделения высокоочищенной рестриктазы ХЬа. -Биотехнология, 1986,М 1, 26-30.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ХВА(57) Изобретение относится к биохимии ибиотехнологии, касается способа полученияэндонуклеазы рестрикции ХЬаиз биомассы клеток Хапйогпопаз Ьадг штамм ВКПМВ(АТСС 11672) и может быть использовано в генной инженерии и молекулярной ссу клеток Х,Ьабг штамм СС 11672) разрушают с по а, затем к клеточному гомо концентрированную смес оля и декстрана в калий-ф ере, рН 7,4 до кон ции в смеси полиэтиленг ана 2 и МаС до концент биологии. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением выхода и качества целевого продукта. Для этого биомассу Хапйогпопаз Ьабг разрушают ультразвуком, полученный клеточный гомогенат фракционируют в двухфазной системе, содержащей 77 ь-ный полиэтиленгликоль и 2 ф-ный декстран в присутствии 0,35-0,42 М йаС, хроматографическую очистку препарата осуществляют на гепаринсефарозе путем нанесения фермента на аффинный сорбент, уравновешанный 10 мМ трис-НС буфером с рН 7,2 с последующим концентрированием целевого продукта диализом против 50 -ного раствора глицерина. Выход эндонуклеазы рестрикции ХВа 1 составляет 12-15 тыс.ед,/г биомассы, Препарат свободен от и римесей неспецифических эндо- и энзонуклеаз. 2 М, После тщательного перемешиесл центрифугируют при 100009 в 20 мин, верхнюю полиэтиленгликоазу, содержащую целевой продукт, т, разбавляют буфером, приливают ефарозу, предварительно уравною 10 мМ трис-НС, рН 7,2 и этой ей набивают колонку(нанесение в ), проводят элюцию белков линейиентом концентрации чаС от 0 до фере. Фракции, содержащие эндоХЬасобирают и концентрируют против 500-ного раствора глицефере.д фермента из 10 г клеток состав 150 тыс,ед.акт. Хранится препарат 2)С в течение 6 мес беэ снижения ти. Свободен от значительных приспецифических эндонуклеаз: обрасуспензи "обьеме ным град 0,6 Мвбу нуклеазу диэлизом рина в буВыхо ляет 120- при - 20(+ активнос месей неботка ДНК фага Т 7 50-кратным избытком фермента в течение 20 ч (1000-кратный избыток) при 37 С не изменяет специфической картины гидролиза.Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1, Все операции по очистке фермента проводят при 4.+4 С.Активность рестриктазы ХЬа 1 тестируют методом гидролиэа ДНК фага Т 7 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в 0,8 -ном агарозном геле. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для постоянного специфического гидролиза 1 мкг ДНК фага Т 7 втечение 1 ч 37 +.1 ОС.10 г замороженной биомассы Х.Ьас 1 гП ВКПМ Всуспендируют в 20 мл 10 мМ трис-НО, рН 7,9, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,01 М 2-меркаптоэтанола, добавляют тритон Хдо конечной концентрации 0,1% и обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц и амплитуде 17+ 2 мкм нескол ько раэ до исчезновения вязкости в биомассе, периодически охлаждая смесь для предотвращения нагревания смеси и инэктивации фермента. К клеточному гомогенату при постоянном перемешивании приливают 30 мл смеси, содержащей 21 полиэтиленгликоля и 6% декстрана, 7,88 мл 4 М раствора йаС (до конечной концентрации последних; полиэтиленгликоля 7%, декстрана 2, МаС 0,35 М) и 22,12 мл деиониэованной воды.Смесь продолжают перемешивать в течение 20 мин, затем центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин, Верхнюю фазу отбирают, разбавляют враза буфером 10 мМ трис-НС 1, рН 7,2, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10% глицерина (буфер А) и добавляют туда же 10 мл гепарин-сефарозы, предварительно уравновешенной буфером А.Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 20 мин и набивают в колонку (2,0 Х 15 см). Колонку промывают 100 мл 10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, содержащим 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 10 глицерина (буфер Б), фермент элюируют линейным градиентом концентрации йаС от 0 до О,б М в буфере Б. Общий объем градиента 100 мл, Скорость нанесения, промывки и элюции 15 мл/ч. Собирают фракции объемом по 3 мл и анализируют на активность ретриктазы ХЬа 1. Фракции, содержащие целевой продукт, которые элюируюТся в диапазоне кон 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 центрации йаС 0,3-0,4 М, объединяют(ч = 15мл), переносят в диализный мешок и диализуют против 200 мл 50 -ного глицерина в10 мМ трис-НС 1, рН 7,4, содержащим 0,1 мМЭДТА 0,5 М КС 1, 0,01 М 2-меркаптоэтанола(буфер С), Время диализа 14 - 17 ч.Выход фермента составляет 120 тыс. ед.акт. Концентрация фермента 24000 ед.акт,/мл,Пмученный препарат эндонуклеазы рестрикции ХЬахранят при -20 С в течениеб мес без снижения активности. Содержание примесей неспецифических нуклеаз впрепарате оценивали двумя способами: обработкой ДНК фага 17 избытками ферментав течение длительного времени и методомрестрикция-легирование-повторная рестрикция, Установлено, что при обработке 1мкг ДНК фага Т 7 50 ед,акт, препарата рестриктазы ХЬа 1 в течение 20 ч при 37 С неизменяется четкая специфическая картинагидролиза. Фрагменты, получаемые при обработке 1 мкг ДНК фага Т 7 30 ед, акт препарата ХЬа 1 в течение 17 ч при 37 С,лигируются ДНК-лигэзой фага Т 4 не менеечем на 90 и полностью специфически гидролизуются при обработке препаратом ХЬа .П р и м е р 2, Эндонуклеазу рестрикцииХЬа 1 выделяют из 10 г клеток аналогичнопримеру 1 за исключением того, что к клеточному гомогенату приливают 9,45 мл 4 МйаС до конечной концентрации 0,42 М) и20,55 мл деионизованной воды.Примеси неспецифических эндонуклеази фосфатаз в препарате не обнаруживаются.Формула изобретенияСпособ получения эндонуклеазы рестрикции ХЬа 1, предусматривающий разрушение клеток продуцента ХапйогпопазЬэдгП ультразвуком, фракционированиеклеточного гомогената в двухфазной системе, содержащей 7% полиэтиленгликоля и2% декстрана, в присутствии ИаС 1, хроматографическую очистку нэ сорбенте, уравновешенном буфером, и диализ против50%-ного раствора глицерина, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощенияпроцесса с одновременным повышениемвыхода и качества целевого продукта, в качестве продуцента используют штаммХапФовопэз ЬабгП ВКПМ, фракционирование клеточного гомогената проводятв присутствии 0,35-0,42 М йаС 1, хроматогрэфическую очистку фермента осуществляют на гепаринсефарозе, уравновешенной10 мМ трис-НС буфером рН 7,2.