Способ тестирования рестриктаз s и s из микроорганизмов рода sтrертомyсеs

(5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) Журавлева Л,ИОрешкин Е.Н, Влияние условий культивирования и ультразвукового разрушения биомассы Ягертогпусеэ асЬгопчацепез АТСС 12767 на выход эндонуклеаз рестрикции.Прикл. биохимия и микробиология, 1985, т. 21, йг 3, с. 401 - 406.(54) СПОСОБ ТЕСТИРОВАНИЯ РЕСТРИКТАЗ ЯАС 11 И ЯЯТ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА ЯТВЕРТОМУСЕЯ Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаэ Яас 11 и Яэто11 в микроорганизмах рода Ясгертогпусез и может быть использовано в молекулярно- биологических и биотехнологических исследованиях.Цель изобретения - повышение специфичности тестирования.Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и подвергают гидродинамическому разрушению ультразвуком, Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55 С в течение 10 - 15 мин, После охлаждения до 4-6 С экстракт освобождают от дебриса, а надосадок содержит рестриктазу Яас 11 или ее изошизомер Яэт 11, Активность ферментов на 1 г влажных клеток составила не ме(57) Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, касается способов тестирования рестриктаз Яас 11 и Язт 11 рода Ятгертогпусеэ и может быть использовано в молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях, Целью изобретения является повышение специфичности тестирования. Способ заключается в том, что клетки микроорганизмов вносят в охлажденный буфер и разрушают ультразвуком. Экстракт разрушенных клеток прогревают при 50-55 С в течение 10 - 15 мин. После охлаждения до 4-6 С экстракт, содержащий рестриктазу Яас 1 или Яэ 111, освобождают от дебриса. Активность ферментов на 1 г влажных клеток составляет не менее 6000 единиц для рестриктазы Яас ф 11 и не менее 10000 единиц для рестриктазы Яз 111, 1 табл. нее 6000 ед. для рестриктазы Яас 11 и не менее 10000 ед, для Язт 11, Экстракт разрушенных клеток микроорганизма-продуцента нескольких экдонуклеаз рестрикции подвергают термообработке при 50-55 С, в результате повышается точность определения целевой рестриктазы (Яас 11 и Яв 111) эа счет освобождения клеточного экстракта от сопутствующих термолабильных ферментов, Термообработка клеточного экстракта позволяет также облегчить селекцию по целевому продукту, а из нескольких продуцентов выбрать наиболее активный.В таблице приведена зависимость точности тестирования рестриктаэ от режима термообработки клеток.Как видно иэ таблицы, оптимальной для тестирования рестриктаз Яас 11 и Яы 11 является обработка клеточного экстракта при1634714 Активность рестриктазы Яас И в грубо очищенном экстракте клеток составила 6000 ед. в 1 г влажной биомассы или 90900 ед. в 1 г сухого мицелия. Яз 11+ Яы И); (+) - наличие одной рестриктазы (Яас И или Яы И);(О) - инактивация обеих рестриктаз. Составитель В.ВарламовРедактор М.Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор И.Эрдейи Заказ 733 Тираж 362 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский кбмбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 50-55 С. При температуре ниже 50 С сохраняется картина рестрикции, характерная для двух эндонуклеаэ рестрикции (Яас 1 + Яас И или Язс - Язт И), при 60 С и выше инактивируются,Способ иллюстрируется следующими и римерами.П р и м е р 1. Один грамм биомассы Я,асЬготоцепез АТСС 12767 суспендируют в 4 мл трис- буфера рН 7,5, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ йаС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДНТ на резонансной частоте в диапазоне 22 кГц в течение 4-6 мин. Экстракт разрушенных клеток прогревают 15 мин при 50 С и центрифугируют 30 мин при 18000 об/мин, Активность рестриктазы Яас И в полученном супернатанте тестируют методом гидролиэа ДНК фага А с 1857 с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в горизонтальном блоке агароэы. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое в течение 1 ч полностью специфически расщепляет 1 мкг ДНК,Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис-буфер рН 7,56 мМ М 9 Сг. 6 мМ КС 1, 6 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мкг ДН К А с 1857 в 40 мкл смеси и 2-10 мкл грубого экстракта клеток. Разделение полученных фрагментов проводят в 0,1 М йа-боратном буфере рН 8,2, содержащем 2 мМ ЭДТА, в 1 агарозном геле. Окрашенные этидий-бромидом (1 мкг/л) гели просматривают в УФ-свете,П р и м е р 2. Тестирование рестриктазыЯы 11 в грубоочищенном экстракте клеток Я.зсап 1 огд АТСС 29415 проводят аналогично примеру 1, Активность рестриктазы Яы И 5 составила 10000 ед. в 1 г влажных клеток или150500 ед, в 1 г сухого мицелия.П р и м е р 3. Тестирование рестриктаэыЯз И проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушен ных клегок Ямап 1 огб не подвергают термообработке, Активность рестриктазы Язт И в грубом клеточном экстракте не определяется, гестируется суммарная активность двух рестриктаз из-за присутствия рестриктазы 15 Язв,П р и м е р 4. Тестирование рестриктазыЯэт И проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что клеточный экстракт прогревают 10 мин при 55 С. Активность 20 фермента составляет 10000 ед. в 1 г влажных клеток.П р и м е р 5. Тестирование рестриктаэыЯм И проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что экстракт разрушен ных клеток прогревают 12 мин при 52 С.Активность рестриктазы Язт И в грубо очищенном препарате клеточного экстракта Я,мап 1 огд составляет 10500 ед. в 1 г влажных клеток.30 Формула изобретения Способ тестирования рестриктаз Яас 11и Яэт из микроорганизмов рода Я 1 гер 1 отусез, предусматривающий получе ние грубого экстракта путем разрушенияклеток ультразвуком, центрифугирование с получением супернатанта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения специфичности тестирования, экстракт разрушенных 40 клеток микроорганизмов подвергают термообработке при 50-55 С в течение 10-15 мин.