Реагент для определения аденозин-5-трифосфата

ООЗ СОВЕТСНИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИХЕСПУБЛИН 19) (11) ОСУДАРСТНЕННЫЙ НПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН МИТЕТ СССР Й И ОТНРЫТИ ОБРЕТЕ ВИДЕТЕЛЬСТ ающии т люцифер полисаха ванном бр вностью ( Ц ОПИ САНИК АВТОРСКОМ(71) Московский ордена Ленина, орде"на Октябрьской Революции и орденаТрудового Красного Знамени государ"ственный университет им. М.В.Ло .моносова(56) 1. Вегдгпеуег Н, МеЬос 1 з оГЕму(па 1 с Апа 1 уз 1 з, М.,). Асас. Ргезв,1974.2. 1.ипди А., Белуге)оз 1С 1.1 п, СЬеп)., Аста, 1978, м. 87,199-209,3. Авторское свидетельство СССРпо заявке М 3298668/28-13,кл. С 12 И 9/02, 1981.: (5") (57) 1РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯАДЕНОЗИН"ТРИФОСфАТА, включающийлюциферазу, выделенную из светляков, .люциферин, соль магния, буфер, стабилизатор и воду, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повыщения стабильности, он содержит лю-циферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, в качестве буфера - смесь трис-(оксиметил)-ами." нометана и уксусной кислоты, в ка" честве стабилизатора -.смесь этилен диаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом, в качестве соли магния " сульфат магния, при следующем соотношении компонентов, мас.ь:Иммобилизованная наполисахаридном носителе люцифераза 0,067-0,670 Люциферин о,аог-о,015 Сульфат магния 0,48-0,72 Уксусная кислота 0,02-0,04 трис-(Оксиметил)- -аминометан 0,08-0,16 Этилендиа т т а-ацетат на 6 ДитиотреиВода2, Реаген мин е ртрия 0,03-0.,0тол0,05-0,1Остальноет по и. 1, о т л и "с я тем, что он содезу, иммобилизованнуюидном носителе, активмцианом, с удельной а104-1 10) Е/мг,0,3.3 0,68 0,1310415Изобретение относится к биохимии и касается состава для количественного определения аденозин-трифосфата (АТФ) на основе иммобилизованной люциферазы светляков. 5АТФ является одним из наиболее важных метаболитов, количественное определение которого необходимо для целей медицинской диагностики и для анализа загрязнений окружающей 10 среды.Известен реагент основе двухком" понентной ферментной системы, включа" ющей фосфоглицвраткиназу и глицеральдегидфосфатазу. Определение АТФ ве дется спектрофотометрически по ско" рости накопления никотинамидадениндинуклеотида (,НАД), Чувствительность анализа не превышает 1-50 мкИ Я .Наиболее близким к предлагаемому 20 является реагент на основе раствори" мой люциферазы, выделенной из светля" ков, содержащий люциферин, ацетат магния, буфер - смесь имидазола и уксусной кислоты, стабилизатор " смесь 25 этилендиаминтетраацетата натрия 1 ЭДТР) и ацетилцистеина, бычий сывороточный альбумин., воду при следующем соотношении компонентов, мас,Ф:Люцифераза светляков 0,002Люциферин 0,013Ацетат магния 0,47Бычий сывороточныйальбуминИмидазолУксусная кислота35Этилендиаминтетраацетат натрия 0,03Ацетилцистеин ,24Вода остальное 12Анализ основан на регистрацииинтенсивности биолюминесценции, возникающей при ферментативном окислении кислородом воздуха люциферина в 4присутствии АТФ и солей магния, Ин 45тенсивяость свечения пропорциональна концентрации АТФ в анализируемомобразце. Достоинством метода является возможность определения АТФ вприсутствии других метаболитов (специфичность), а также высокая чувствительность анализа (10 И), зна-вчительно превышающая чувствительность,достигаемую другими методами,Приведенная композиция позволяетполучить свечение, которое, достигнув максимума, остается постояннымв течение нескольких минут. Устой 68 зчивость свечения во времени обесяе"чивает высокую точность определенияи создает предпосылки для автоматизации анализа,Недостатком состава являетсяего невысокая стабильность, В лйофи=",лизованном состоянии при 4 фС реагентв течение недели полностью теряетсвою Ферментативную активность, Поэтому для достижения предельной чувствительности определения необходимо использовать свежеприготовленныйраствор реагента и перед каждым измерением заново строить калибровочный график: концентрация АТФ- интенсивность свечения Это приводит.и значительным потерям дефицитногофермента.Цель изобретения - повышение ста"бильности реагента для определенияАТФ,Поставленная. цель достигаетсятем, что реагент для определенияаденозин-трифосфата, включающийлюциферазу, выделенную из светляков,люциферин, соль магния, буфер, стабилизатор и воду содержит люциферазусветляков, иммобилизованную на полисахаридном носителе в качестве буфера - смесь трис"(оксиметил)-амино".метана и уксусной кислоты, в качестве стабилизатора - смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом, в. качестве соли магниясульфат магния, при следующем сост"ношении компонентов, мас,Ф: .Иммобилизованная наполисахаридном носителе люцифераза 01067"0,670Люциферин 0,002-0,015Сульфат магния :.9,48-0 .72Уксусная кислота 0,02-0,04трис-(Оксиметил)- ,-аминометан 0,08-0,16Этилендиаминтетраацетат натрия 0,03-0,06Дитиотреитол 0,05-0,1Вода ОстальноеВ отличие от состава, принятогоза прототип, предлагаемый реагентсодержит люциферазу светляков, иммобилизованнуюковалентно на нерастворимом полисахаридном носителе.Удельная активность препаратаиммобилизованной люциферазы должнабыть в пределах 3 ф 10 ф;10 Е за 1 мгпрепарата иммобилизованного ферменна (Е - международная единица актив-.1041 0,130,0060,60 Предел обнаружения АТФ с исполь" зованием предлагаемого реагента 10 И. 55П р и и е р 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе. люциферазы, иммобилизованной на 3ности, 1 Е - количество фермента,которое катализирует превращение1 мкмоль субстрата в 1 мин), Приактивности меньше 3 10 Е/мг уменьша. ется чувствительность анализа. Препарат с активностью более 10 Е/мг:зиспользовать. нецелесообразно из-занепроизводительного расхода фериента при приготовлении иммобилизованного препарата. Кроме того, исполь Озование фермента с активностью вы". ше 10 Е на 1 мг иммобилизованногофермента не приводит к повышениючувствительности определения,В качестве буфера вместо имидазолацетата предлагаемый составвключает трис-(оксиметил)-аминоме."тан - ацетатный буфер, а вместо.стабилизирующей смеси этилендиаминтетраацетата (ЭДТА ) и ацетилцистеина 20смесь ЭДТА с дитиотреитолом. Допол. нительное стабилизирующее влияниеоказывает и вводимый в смесь сульфатмагния за счет повышения ионной силы. 25Реагент получают добавлением к кон.центрированнай суспензии иммобилизованной люциферазы в трис-(оксиметил)-аминометан-ацетатном буфере растворов люциферина, сульфата магния,ЭДТА, дитиотреитола в том же буфере.Реагент обладает повышенной стабильностью. Период его полуинактивации .при 4 С 40-50 дней, В лиофили 0зованном состоянии реагент хранится35при 4 вС без значительной потери ферментативной активности в течениегода, Стабильность полученного состава в несколько раз превышает стабиль"40ность индивидуального препарата иммобилизованной люциферазы.Наблюдаемый эффект являетсяследствием совместного присутствияв составе реагента иммобилизованно- .45го фермента, смеси ЭДТА с дитиотреитолом, трис-(оксиметил) -аминометан-ацетатного буфера и сульфата магния,При этом смесь ЭДТА с дитиотреитолоине оказывает заметного стабилизирующего влияния на растворимый фермент,. 568 4сефарозе, ультрадексе, ультрагеле,активированных бромцианом.а, К 2 мл суспензии люциферазы,иммобилизованной ковалентно на ультрагеле по известному методу 31 сконцентрацией 10 иг/мл и активностью3 10 Е на 1 мг препарата иимобилизо 4ванного фермента: в 0,01 И т рис- (оксиметил)-аминометан-ацетатнои буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 мг/млдитиотреитола, добавляют 4 мл раствора люциферина с концентрацией0,54 мМ и 24 мл 50 мМ раствора сульфата магния в том же буфере. Получают реагент при следующем соотно- .шении компонентов, мас.4:Иммобилизованнаялюцифераза светляков 0,067Люциферин 0,002Сульфат магния 0,48трис-(Оксиметил)- -аминометан Этилендиаминтетраацетатнатрия 0,03Уксусная кислота 0,02Дитиотреитол 0,05Вода Остальноеб, К 4 мл суспензии люциферазы,иммобилизованной ковалентно на уль"традексе, с концентрацией 1 Омг/мли активностью 610 4 Е на 1 мг иимоби.лизованного фермента в 0,015 И трис-(оксиметил)-аминометан-ацетатноибуфере, содержащем 1,5 мИ ЭДТА и0,7 мг/мл дитиотреитола, добавляют4 мл раствора люциферина с концен-трацией 1,6 мИ и 22 мл 67 мИ раствора сульфата магния в том же буфере.Получают реагент, имеющий следующийсостав, мас.Ф:Иммобилизованнаялюцифераза светляковЛюциферинСульфат магниятрис-(Оксиметил)- -аминометан,0,12Этилендиаминтетраацетат натрия 0,045Уксусная кислота 0,03Дитиотреитол 0,07Вода . Остальноев, К 20 мл суспензии люциферазы,иммобилизованной ковалентно на сефарозе, с концентрацией 10 иг/или активностью 10 Е на 1 мг иммобилизованного фермента, в 0,02 М трис,П р и м е р 3. Испытание стабиль. ности реагента.В таблице указаны значения пери; ода полуинактивации реагента, в том числе в лиофилизованном состоянии. Для сравнения приводится аналогичный показатель для известного реагента на основе растворимой люцифера 1 мг/мл дитиотреитола, добавляютмл раствора люциферина с концентрацией 3,9 мМ и 6 мл 0,3 М раствора сульфата магния в том же буфере. Получают реагент, имеющий следующий состав, мас.Ф:Иммобилиэованнаялюцифераза светляков 0,67Люциферин 0,015Сульфат магния 072трис-(4 ксиметил)- -аминометан 0,16Этилендиаминтетраацетат натрия 0,06Уксусная кислота О.,ой5Дитиотреитол 0,1Вода ОстальноеП р и м е .р 2. Приготовление. реагента для определения АТФ на основе люциферазы, иммобилизованной на целлофановой пленке.К 1,0 мл 002 М трис-(.оксиметил)- -аминометан-ацетатного буфера содержащего 2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл дитиотреитола, добавляют 0,2 мл раствора25 люциферина с концентрацией 1,5 мМи 0,2 мл 0,4 М раствора сульфата магния в том же буфереВ полученный раст-вор опускают целлюлозную пленку с иммобилиэованной на ней известным З 0 методом 31 люциферазой- массой 7 мг и площадью 25 мм с активностью 3 10"Е на 1 мг иммобилизованного фермента;Получают следующйй состав реагента, мас.3: 35Иммобилиэованнаялюцифераза светляков 0,5Люциферин 0,006Сульфат магния 0,69трис-(Оксиметил)- 40-аминометан 0,16Этилендиаминтетраацетат натрия 0,06Уксусная кислота О,ОЙДитиотреитал 0,1 45Вода ОстальноеИзменение площади взятой целлюлозной пленки позволяет варьировать содержание фермента в прелах, приведенных в формуле изобретения.Реагент по способу ПОлупериод инактивации, дни в воднойсуспензии в лиофи- лизованном состоянии Предлагаемому попримерам1 а 150 150 50 150 50 50 Фирмы 1.КВ(прототип) Иммобилизованнойлюциферазы 30 20 П р и и е р Ч Методика опреде-. ления АТФ.1 мл реагента, полученного как описано в примере 1 или 2, вводят в цилиндрическую кювету объемом 3 мл и диаметром 1 см., которую затем помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал. Затем с помощью шприца быстро вводят 0,5 мл раствора АТФ с известной концентрацией, не прерывая. регистрации свечения, Разность между величиной сигнала интенсивности биолюминесценции в присутствии и в отсутствие АТФ является ве. личиной, пропорциональной концентрации АТФ. Опыты повторяют для растворов АТФ с концентрациями АТФ зы светляков и индивидуального препарата люциферазы, иммобилизованной на сефароэе. Для оценки периодамиполуинактивации определяется изменение уровня ферментативной активности образца по интенсивностй свечения, возникающего при добавлениив образец стандартного количестваАТФ (пример Й). Цифры, указанные внижеследующей таблице, показывают,что стабильность предлагаемого реагента по крайней мере в 25 раз превышает стабильность состава - прототипа и в 2,5 раза превышает стабильность индивидуального препаратаиммобилиэованной люциферазы.,Редактор 8.Ковтун . .Техред ИГайду . КорректорС.Шекмар еВВ В еееее еееееееее е ЕЕВ ееЕЕе ее Заказ 7065/26 Тираж 23 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5ВеВ Е Е еФилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 в том же диапазоне, в которомпредеполагается проводить измерения. Прямая пропорциональность между интенсивностью биолюминесценции и концентрацией АТФ наблюдается в диапа" 5зоне от 10 .И до 10"И АТФ. На основеполученных данных строят график заевисимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. При ра"боте с образцами с концентрациейОАТФ 106-10 И рекомендуется предпочтительно испрльзовать реагент, описанный в примере 1 а или 2, 8 конценетрацией 10 -10 1 И " реагент, описанный в примере 16, с концентрацией 15АТФ 10-10 М - реагент, описанныйв примере 1 в. Концентрацию АТФ в нв.,известном образце определяют по,.интенсивности свечения, возникающегопри добавлений 0,5 мл неизвестного 2 О 6 о, .8образца АТФ к 1,4,мл реагента, ис" пользуя калибровочный график, полученный, как описано выше. Предел обнаружения концентрации АТФ ука- . занным методом составляет 1 ф.10"И.Предлагаемый реагент для опреде" ления АТФ может быть использован в научных целях для изучения процессов, связанных с превращениями АТФ, а также в целях медицинской диагностики. С помощью этого препарата по уровню креатинфосфокиназы в крови можно проводить раннюю диагностику инфаркта миокарда и ряда других заболеваний, экспресс-анализ на чувствительность микроорганизмов к ан" тибиотикам. Определение уровня АТФ в водоемах позволяет фсудить об их биологической продуктивности и уровне загрязненности.