Способ определения активности карбоангидразы

)5 С 2 1/ ТЕНИЯ а ль- гии ерНкисГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ ССОР ИСАНИЕ ИЭ ТОРСНОМУ СвйДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСКАРБОАНГИДРАЗЫ(57) Изобретение относится к биомии, а именно к способу определедегидратирующей активности карбогидраэы (КА), и может быть испозовано в биотехнологии, Фиэиолорастений,и медицине. Цель иэобрения - повьппение чувствительностиспособа. Активность КА измеряютэлектрометрически, по изменениюв ходе реакции дегидратации угле Изобретение относится к биохимии, а именно к способу определения дегидратирующей активности карбоангидразы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, Физиологии растений, а также в медицине в диагностических целях.Цель изобретения - повышение чувствительности способа, достигается тем, что определение активности Фермента осуществляют электрометрически, регистрируя время образования продукта реакции по изменению рН иа 0,05-0,01 ед. в растворе с буФерной емкостью 0,002-0,01 М и концентрацией бикарбоиата 1-100 мМ. лоты. Система для определения активнос, А включает высокочувствительный рН-метр, самописец и компенсаторобеспечивающий соответствие всейшкалы рН-метра 0,05-0,2 ед, рН. Реакцию дегидратации углекислоты проводят в 20 мл 0,002-0,03 М или имидазольного, или вероналового буферасо значением рН 6,8-7,2. Реакциюинициируют быстрым введением раствора субстрата - бикарбоната натрия(1-100 мМ) в реакционную смесь, содержащую исследуемый образец. Приэтом происходит увеличение рН на0,01-0,05 ед, Регистрируется время,за которое происходит сдвиг рН на0,01 ед, Параллельно проводят измерения с инактивированным образцом ирассчитывают активность по формуле,приведенной в описании,П р и м е р 1. Для определения активности КА в реакции дегидратации углекислоты используют электрометрическую систему, В реакционную ячейку наливают 20 мл 0,002 М фосфатного буФера, рН 7,0, содержащего 0,1 мкг гомогенной КА, выделенной из листьев бобов (11), и 0,001 М З-меркаптоэтанола, Реакционную смесь перемешивают и термостатируют до установления посо тоянного рН и температуры (2 С) и течение 5 мин. Реакцию начинают введением 1 мМ (0,1 мл 0,2 М раствора) бикарбоната натрия при непрерывном перемешивании, Самописец вычерчивает кривую изменения рН но времени, Регистриру 1585333ют время изменения рН на 0,01 ед. (1), после чего самописец выключают. Реакционную смесь после завершения реакции выпивают, ячейку неоднократно промывают спиртом и бидистиллированной водой. Контроль или время некатализируемой реакции (1 ) дегидратации бикарбоната измеряют аналогично определению г;, однако реакционную смесь предварительно кипятят 3 мин на водяной бане и затем охлаждают до 2 РС, Полученные ,значения= О с и о = 20 с под 1 о к 1 ставляют в формулу А =- -мг15 белка, и, таким образ ом, получают величину активности КА, выраженную в условных единицах. Для расчета истинной дегидратирующей активности КА-А 1 необходимо знать значения ско ростей катализируемой (Ч ) и некаталиэируемой (Чо) реакций, что связано с определением точных концентраций водородных ионов Н 3 и Н 1,ко 25 торые вовлекаются в процесс дегидратации НСО-ионов. Для этого проводят титрование реакционной смеси, состоящей из всех компонентов, используемых для определения А, за исключением субстрата. Вместо субстрата в реакционную смесь добавляют 0,01-0,05 н, ЮаОН до получения соответствующего сдвига рН. С учетом времени (С . и Ср), эа которое происходят эти сдви 35 ги рН в процессе реакции, определяН 3 ют значения скоростей Ч = --- иГН 3Чоо 40Конечный результат - активность КА находят из разности скоростей (Ч-. Чо ), соотнесенной к количеству белка (мг белка) в реакционной смеси:Чк - ЧоА = ---и выражают в мкМ демг белкагидратированного бикарбоната эамин 1 мг белка (мкМ НСО/мин мг белка),Окончательное значение А полученное в результате данного измерения, равно 7,5 + 0,075 мкН/мин мг белка.П р н м е р 2. Ход определения активности КА аналогичен примеру 1, однако в качестве источника фермен 55 та используют 0,2 мл донорской крови человека, содержащей 0,2.мг белка разведением водой 1:400000, а реакцию начинают введением 5 мМ (0,5 мл 0,2 М раствора) бикарбоната натрия в имидозольный буфер с рН 7,1 и буферной емкостью 0,009 М, На экспериментальной кинетической кривой, записанной потенциометром .самописцем, Фиксируют сдвиг рН, равный 0,02 ед., и определяют соответствующее ему время реакции: г.= 8 с. Аналогичным образом измеряют время контроля С = = 34 с. С использованием полученных значений Чк и Ч и учетом количества белка в реакционной смеси рассчитывают А = (4,5 + 0,05) ед,/мг белка. Для определения истинного значения активности КА-А определяют точную1концентрацию протонов Н , соответствующую сдвигу рН 0,02 ед. Для этого реакционную смесь того же состава, как и использованную для нахождения А, титруют добавлением 0,02 мл 0,01 н, ИаОН, Полученная СН 3б10 к 10 М; соотнеся ее ко времени 1 к и Со, рассчитывают соответственно Ч = 18,8 к 0 М/мин и Чр = 8,8 10 М/мин, Принимая во внимание кон" центрацию белка в реакционной смеси (0,2 мг), по Формуле для нахождения А 1 определяют ее значение А(700,7) 10 М/мин мг белка,Формула изобретенияСпособ определения активности карбоангидразы путем добавления исследуемого образца к субстратно-буферной смеси и регистрации времени образования продукта реакции при параллель ном п ров едении тех же оп е раций с инактивированным образцом, последующим расчетом активности, о т личающийс я тем, что, сцелью повьппения чувствительности способа, используют буферный раствор с рН 7,0-7,2 и буферной емкостью 0,002-0,03 М, концентрацию бикарбоната натрия 1-100 мМ, при этом о времени образования продукта реакции судят по времени изменения рН на 0,05-, 0,01 ед.