Способ получения трет-бутилоксикарбонил-лейцин-энкефалина

.1 ИОАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ВТОРСИОМУ Сви-13 21) 4449327/ 22) 27.06.88 46) 30.08.90 1 стит т тых ег о 5оорга етение относится к бхимии, а именно к фесинтезу пептидов, иользовано в практикезаданной последоватенсации пептидных фрсле для получения биных пептидов.изобретения - упроцесса получе з рмен ожет нич еск тивном нтеэа ности быть исп пептидов или конд гментов, логичесом ак Це к скорение и ния целевог рощениепродуктСпоснии для б з ся в использова цин-энкефалина эфира трет-бузилглицина (Вос ) в качестве а синтез лицинрбоннлСн СОС глик олилгтилоксик ти ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНВЦТИЯПРИ ГКНТ СССР(7 ) Ин у химии поверхностиАН УССР(56) КЬпзе 1 п 1 я 1 су Уц. 1 еСа 1,ОрС 1 ш 1 га 1 оп оГ епгуше сага 1 угедрертЫо яуп 1 Ьея 1 я 1 п а "Ъаег-юахпсп 1 яе 1 Ь 1 е" огдап 1 с яо 1 чепг, ЬурЬяс яуяйетп. - ТегаЬедгоп. 1984,чо 1. 40, Р 21, р. 4425-4432.СЫ - Ниед Юоп 8 еС а 1. ЕпгушеяупгЬея 1 я о 2 ор 1 оЫ рерЫея.сЬеш. е Во 1 рйуя. Аса. 1979,чо 1. 576, У 1, р. 247-249,) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕТ-БУТИЛОКСИВОНИЛ-ЛЕЙЦИН-ЭНКЕФАЛИНА(57) Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к ферментативному синтезу пептидов, и можетбыть использовано для получения пептидов заданной последовательностиЦель изобретения - ускорение и упрощение получения целевого продукта,Способ получения трет-бутилоксикарбонил-лейцин-энкефалина заключаетсяв синтезе этого пептида из гликолилглииилсвого эфира трет-бутилоксикарбонилтироэилглицина (М-защищенныйаминокомпонент) и глицилфенилаланиллейцина (аминокомпонент) путем пропускания водной смеси этих соединение через колонку с иммобилизованнымна кремнеземе папаином с последующимвыделением из раствора полученногопентапептида, Способ позволяет ускорить процесс (в 140 раз) и упроститьего. 1 табл. И-защищенного карбоксильного компонента и глицилфенилаланиллейцина(НС 1 у РЬе Ьец ОН) в качестве аминногокомпонента, Оба компонента растворяют в водном буферном растворе, азатем пропускают через колонку с иммобилизованным на кремнеземе папаине,При пропускании раствора двух пептидных компонентов через иммебилизоваиный папаин между ними образуется пептидная связь и конечный продукт выделяется обычными способами из пропущенного через колонку раствора, Использование гликолипглициновых эфиров позволяет проводить реакцию в водныхрастворах, а также ускорить процесс, 1585332Ускорение и упрощение процесса достигается также за счет применения нммобилизованного папаина, через который пропускается в проточном режиме смесь исходных компонентов.Применение предлагаемого способа позволяет значительно ускорить процесс (5-1 0 мин вместо. 24 ч). Упрощение процесса достигается заменой 10 водно-органических растворов на водные, понижением температуры до комнатной, а также возникновением возможности многократного. использования иммобилизованного фермента и простотой отделения этого катализатора от реакционной смеси.П р и м е р 1. Используется проточный реактор объемом 1,2 см , содержащий 400 мг иммобилизованного на 20 органокремнеземе папаина. Исходные компоненты растворяют в 1 М Ма-карбонатном буфере (рН 9,5), Проточный реактор с иммобилизованным папаином ,промывают буфером, после чего через 25 колонку пропускают раствор, содержащий исходные компоненты синтеза (ВосТуг С 1 УОСН СО С 1 УОН, НГ 1.у РЬе Ьец ОН)Объем пропускаемого раствора 5 мл, содержание компонентов по 0,5 ммоль. Скорость прокачивания растворенных субстратов выбирается так, что карбоксильный компонент полностью гидролиэуется иммобилиэованным ферментом эа время протекания раство ра через проточный реактор, составляет 1 мл/мин. Раствор, содержащий конечные продукты, собирают на выходе проточного реактора и выделяют синтезированный пентапептид следующим образом. К собранному на выходе раствору добавляют 103-ный водный раствод КНЯО и экстрагируют пентапептид в этилацетат. Органический слой отделяют от водного и упаривают. Очистку ко нечного продукта осуществляют на колонке с силикагелем в системе толуол - диоксан - гексан - трифторэтанол - уксусная кислота, 50:40,.15: ф 5:1(А). Полученный продукт выдерживают несколько. часов в вакууме над КОН. Чистоту продукта проверяют с использованием тонкослойной хроматографии в системе (А), сравнивая с химически синтезированным Вос-Ьеи-энкифалином. На хроматограммах по. 55 бочные пятна отсутствуют, подвижность пентапептида в системе (А) составляет И0,13. Аминокислотный анализ конечного продукта показалидентичность аминокислотного сос"тава Ьеи-энкефалину. Выход Вос-Ьец-энкефалином составляет 533, времясинтеза 5-10 мин, температура 20 С,П р и м е р 2. Синтез проводятв тех же условиях, что и в примере 1, с тем лишь отличием, что содержание компонентов, ммоль карбоксильный 0,5, аминокомпонент 1,5.Скорость прокачивания раствора компонента 0,85 мл/мин, Выход конечного продукта 727.,Использование избытка .одного иэкомпонентов ведет к увеличению выхода. Увеличение скорости прокачивания карбоксильного и аминокомпонентов через проточный реактор ведет к значительному количеству непрореагировавшего карбоксильногокомпонента. Уменьшение скоростипрокачивания ведет к уменьшению выхода конечного продукта, Конкретныезначения концентраций. компонентови скорость пропускания через колонку не имеют существенного значенияпотому, что при любых реально воз"можных концентрациях исходных компонентов достигается положительныйэффект, а скорость пропускания раствора через колонку зависит от геометрических размеров колонки и массыдемобилизованного фермента.В таблице приведена сравнительнаяхарактеристика условий синтеза ивыхода соединений, полученных попредлагаемому и известному способам.Таким образом, из данных таблицы видно, что способ обеспечивает ускорение и упрощение процесса, Несмотря на то, что выход конечного продукта приблизительно одинаков, предлагаемой способ выгодно отличаетсяот известного: существенно сокращается время синтеза (в 140 раз), реакция протекает при комнатной температуре в водной среде, Использованиеиммобилизованного фермента дает возможность работать с ним многократнои в непрерывном режиме,Формула изобретенияСпособ получения трет-бутилоксикарбонил - лейцин-энкефалина, включающий растворение И-защищенного карбоксильного и аминного пептидных компонентов в растворителе, инкубацию смеСпособ Конечный продукт Условия синтеза й, С Раствооритель Времясинтеза Фермент Выход,7.ВосТугС 1 УС 1 УРЬеЬеи ОМ 5-0 мин 20 Водный Иммоби- До 70 раствор лизо- ванный Предлагаемый папаинВодно- Раствооргани- римыйческая фермент Иэвест- ВосТ 7 г(Вт 1)С 1 у РЬеЬец 24 чный ОТМВ 37 смесь Составитель В, МуронецТехред Л.сердюкова Корректор С. ШевкунРедактор Н. Киштулинец Заказ 2304 Тираа 481 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР13035, Москва, 3-35Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Уагород, ул. Гагарина,10 5 1585332 6си в присутствии папаина для обра" глициновый эфир трет-бутилоксикарбоэования пептидной связи и последую" нилтирозилглицина, в качестве аминщее выделение целевого продукта, ного компонента - глицилфенилаланило т л и ч а ю щ и й с я тем, что, лейцин, растворение ведут в водном с целью ускорения и упрощения процес- буферном растворе, а инкубацжо с паса получения целевого продукта, в панком проводят путем пропускания качестве М-защищенного карбоксильно- смеси через колонку с иммобилизованго компонента используют гликолил- ным на кремнеземе папаином.