Способ получения гибридного полипептида, содержащего нв а

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО НВзАд (57) Использование: генетическая инженерия, получение бифункциональных антигенов, клонирование генов, которые кодируют эти антигены в дрожжах. Сущность изобретения: гибридные полипептиды, содержащие НВзАд, получают в результате культивирования штаммов ЯассЬагогпусез сегечзае 1044 С или ДС 5, трансформированных плазмидами рЮТ 12573 или рйТ 12574, выделяют и очищают целевой продукт. 7 табл,иль Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению бифункциональных антигенов, клонированию генов, которые кодируют зти антигены в дрожжах.Известен способ приготовления гибридного полипептида НВзАд-Негрез симплексвирус гликопротеин Д (НЯЧ-дО) при экспрессии последовательности, кодирующей гибрид НЯЧ-Рге 32-3 белок, в дрожжах,Наиболее близким к изобретению является способ получения гибридного полипептида, содержащего Н ВзАд, заключающийся в том, что осуществляют конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующед слитый полипептид; трансформацию полученными ДН К штаммов Яасс 1 агоп 1 усе сегензае, выделение и очистку целевого продукта.Способ заключается вна ДНК последовательносповтсряющийся эпитоп ц ного белка (СЯ) Развоб 0 в 1 асрагнов и восемь кодонов СЯ кодирующей последовательности Рге 32 белка встраивают в вектор, экспрессирующийся в дрожжах, причем он состоит из репликона или последовательности Рге 32-Я белка и соответствующей регуляторной области. Оба вектора экспрессии, а именно один, содержащий последователь- Ь ность из 64 кодонов, и другой, содержащий 0 СЯ последовательность из 8 кодонов, каж- СО дый трансформируют в клетки дрожжей-ре- 9 ципиентов и анализируют экстракты таких трансформированных клеток на наличие НВзАд эпитопов и СЯ эпитопов на той же молекуле. 6 дНовые последовательности, кодирующие Рге 32 и Рге 32 - 3 белок НВЧ, получают из аб 9/ субтипа НВЧ. который был выделен из плазмиды рВТ 10616. Последовательности, кодирующие Рге 32-3 белок, извлекают с помощью традиционных процедур рекомбинантной ДН К из плазмиды рВТ 10616, Рге Я 2 область последовательностей характеритом, что 64 кодоти, кодирующей иркумсиорозоитГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР20 1746887 После электроблоттинга протеинов нанитроцеллюлозном фильтре полученные фильтры предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37 С с 3 желатина в рВЯ.5 Фильтр инкубируют с моноклональными анживают, что имеются изменения четырех пар оснований, которые приводят к изменению трех аминокислот при сравнении с другим вирусом адЯ 2 серотипа. Аланиновый остаток вместо треонинового остатка в положении 45, фенилаланин вместо лейцина в положении 34 и сериновый остаток вместо изолейцинового остатка в положении 11.П р и м е р 19. Дрожжи (Я.сегечэае) штамм ДС 5 с 1 г или 10 Я 44 С с 1 г 0, содержащие плазмиду рйТ 12660 или плазмиду. . рй 1 Т 12363 (пример 16) выращивают в селективной среде (200 мл УМВ + 80 мкг/мл гистидина ДС 5 сг ипи УЙВ/10 Я 44 Ссг иод фазе), Клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 50 мМ натрийфосфата, рН 8,0 с содержанием 0,5 Твин(попиэтиленсорбитанмонолаурат, 1 мМ РМЯ 1= (фенилметилсульфонилфторид) и 2,5; изопропанола, Клетки разрушают, пропуская дважды через пресс давлением 20000 пси (1,38 х 10 Па). Эту суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 30000 д, Определяют полную концентрацию протеина в надосадочной жидкости (неочищенные клетки в экстракте) с применением бычьей сыворотки в качестве стандарта. Наличие материала, связанного с НВзАд, определяют с помощью набора для радиоиммунного анализа (АОЯВ А). Полученные результаты указывают, что рй 1 Т 12660 экспрессирует полипептид, обладающий антигенной активностью НВздд.В радиоиммунном анализе неочищен. ные клеточные экстракты из рй Т 12660 дают положительную реакцию, тогда как неочищенные клеточные экстракты из рй Т 12363 не дают положительной реакции.Вышеприведенные результаты показывают, что дрожжевые клетки, содержащие рй 1 Т 12660, экспрессируют НВвАдАОЯВ 1 А активности в неочищенных клеточных экстрактах даны в табл.4.П р и м е р 20. Дрожжи, трансформированные рй 1 Т 22660, выращивают в селектив ной среде, либо в колбах Эрпенмейера, либо в ферментерах в 1 од фазе и собирают центрифугированием. 10 15 20 25 30 35 40 50 К клеткам (0,1 г) добавляют вначале 20 мкг 40 мМ РМЯР в изопропаноле, а затем 200 мкл образца буфера дпя электрофореза на ЯОЯ-полиакрипамидном геле (0,125 М трис-НС 1, рН 6,8, содержащий 200/, глицерина, 4 БОЯ, 6 М мочевины и 10 2-меркаптоэтанола), Образцы вращают и аликвоты 2-20 мкл разбавляют далее в образце буфера до конечного объема 40 мкл, инкубируют в течение 5 мин при 100 С и обрабатывают электрофоретическ и,тителэми к НВаАд и наличие связывания определяют последовательным инкубированием с биотинированным овечьим анти- мышиным 1 д (разбавление 1/250 в РВЯ, содержащем 1 желатина), стептавидинбиотилированным комплексом пероксидаэы хрена (разбавление 1/400 в РВЯ, содержащем 16 желатина) и, наконец, 30 мкл Н 202 и НВР-реагентом проявления цвета, содержащим 4-хлор-нафтол, 30 мг в 10 мл метанола промывают РВЯ, содержащим 0,10(, Твин. Иммуноблот дает 4 полосы протеина,связанные с Я-протеином определенного молекулярного веса 33, 30, 28 и 25 М. Основную часть связанного с Я материала обнаруживают в полосе протеина 33 И. Наименьшая детектируемая полоса протеина мигрирует медленнее, чем Я протеин синтезированный в дрожжах. П р и м е р 21, Измельчают дрожжевые клетки в присутствии буфера (200 мМ трис, 3 М йаС 1, 10 мМ ЕДТАа, 10 мМ этиленгликоль-бис (бета-аминоэтиловый эфир) й, й, й, й-тетрауксусной кислоты (ЕОТА), 4 мМ РМЯЕ 100 изопропанола) с последующим центрифугированием в течение 45 мин при 30000.д.Клеточные экстракты рйТ 12660 частично очищают от клеточного экстракта ультрафильтрацией, СЯС равновесным центрифугированием и гидроксиапатитной хроматоГрафией 4 полосы протеина Я-связанного материала детектируют на этих стадиях очистки анализом Вестерн-блат, очищают на этих стадиях очистки. Иммуноб,потный анализ АОЯВ 1 А положительных СЯС фракций после равновесного центрифугирования показывает, что четыре Я-связанныеполосы присутствуют в тех же относительныхсоотношениях в каждой фракции. П р и м е р 22. Сывороточный альбуминчеловека полимеризуют глутаральдегидной обработкой и очищают, Очищенные клеточные лизаты рй)Т 122660 разделяют электрофорезом на акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозный фильтр последовательно инкубируют с РНЯ А (15 мкг) мл в РВЯ, содержащем 1 желатина), антисывороткой кролика к альбумину человека, биотинированным анти-кроличьим 1 д обезьяны (1/250 разбавление в РВЯ, содержащем 1 желатина), стрепавидин-биотинированногопероксидаэой хрена (1/400 разбавление в РВ 8, содержащем 1% желатина) и, наконец, Н 202 и 4-хлор-нафтол.Две самые крупные 8-связанные протеиновые полосы (33 М и 30 И) подвергают взаимодействию с рН 8 А, а две самые меленькие (28 и 25 Еб) не дают реакции.П р и м е р 23. Синтезируют петид со следующей формулой: ЙН 2-Ме 1 61 ц-ТгрАзпег-ТЬг-А 1 а-Рпе-Нзп-А аец - 61 п-Азр - Рго-Агц-На - Агцуец-Туг-.е и-Рго - А 1 а, 61 у - Суз - СООН. Кроликов иммунизируют подкожно 100 мкг коньюгата (что соответствует 20 мкг пептида) в полном адъюванте Фрейнда, повторно иммунизируют на 8 и 15 день следующими 10 мкг конъюгата в полном адьюванте Фрейнда, а на 28, 69 и 149 день 100 мкг конъюгата в РВ 8. За выработкой титра антител следят, отбирая образцы крови через определенные промежутки времени, и проверяют разбавление сыворотки инкубированием на синтетическом полипептиде, фиксированном на твердой фазе. Связанные антитела детектируют иодированным протеином А. Сыворотку используют после 100-кратного разбавления или после частичной очистки 196, 196 частично очищают осаждением 1 ча 2804 (120 мг на 1 мл сыворотки), повторно суспендируют в РВ 8 и переосаждают 14% йа 2804. Повторно суспендированный 1 ц раствор обессоли.вают, пропуская через РО 10 колонку,Определение реакционной способности протеинов в иммуноблотах осуществляют с помощью биотинированного анти-кроличьего 1 ц обезьяны. стрепатавидин-биотинированной пероксидазы хрена и Н 202 и 4-хлор-нафтолом,Протеины из частично очищенных препаратов рй 1 Т 12660 выделяют электрофорезом на 808 полиакриламидном геле и переносят на нитроцелл юлозу. Иммуноблот показал, что две более крупные полосы протеина (33 И и 30 Кб) реагируют с антителами.П р и м е р 24, Частично очищенный препарат диссоциируют с помощью 808 и протеины разделяют электрофорезом на акриламидном геле. После переноса протеинов на нитроцеллюлозу полученные мембраны инкубируют с десятикратно разбавленным гамма-глобулином гепатит В, содержащим 1% желатина. Связывание антител определяют последовательным инкубированием с помощью биотинированного античеловеческого 1 ц овцы (1/250 разбавление в РВ 8, содержащим 1% желатина), стрептавидин-биотинированной пероксидазы хренаи наконец, Н 202 и 4-хлор-нафтолом.Две наиболее крупные протеиновые полосы (33 и 30 Мб полосы) подвергают взаимодействию с антителами человека, две наименьшие (28 и 25 Мб полосы) нв дают реакции. 8 протеин, полученный из частиц из дрожжевых клеток, содержащих рй 1 Т 12363, не взаимодействует с этими человеческими антителами,0062 опм - 0,2. Туникамицин добавляют до конечной концентрации 10 р г/мл и культу, ры инкубиоуют в течение 3 мин при 30 С, 45 Затем добавляют 20 рл С 1 8-метионина(1000 С 1/ммоль) на 1 мл смеси и культуры инкубируют еще в течение 15 мин. Меченую клеточную культуру в количестве 2 мл, обра. ботанную или необработанную туникамицином, центрифугируют в микрофуге и 50 спрессованные клетки повторно.суспендируют в 40 р 1808, после чего их разрушают путем перемешивания в смесителе е течение 2 мин в присутствии 0,3 г стеклянных шариков (диаметр 0,45-0,50 мм). Проводят иммунное осаждение. Лизат нагревают в течение 3 мин при 100 С, разбавляют 0,5 мл РВ 8, содержащей 1 х Трито 10 П р и м е р 25. Рге 82-8 протеин изчастично очищенных препаратов частиц изрй 1 Т 12660, содержащих 108 44 С с 1 г клетки,разделяют электрофоретически и переносятна нйтроцеллюлозу, Прогоняют на геле 815 протеин, очищенный из дрожжей, содержащих рй 1 Т 12363 и НВзАц частиц из сыворотки инфицированных людей. 1/2нитроцеллюлоэного фильтра инкубируют в50 мкг/мл конканавалина А в 10 мМ трис рН20 7,5, 150 мМ йаС 1. 1 мМ СаС 12, 1 мМ МпС 12,0;05% Твини затем 30 мкг/мл пероксидазы хрена в 10 мМ трис рН 7,5, 150 мМ йаС0,05% Твини, наконец, Н 202 и 4-хлорнафтола.25 Между инкубациями фильтр промывают10 мМ трис рН 7,5, 150 мМ йаС 1, 0,05Твин. Другую половину нитроцеллюлозного фильтра инкубируют с моноклональным антителом 6.30 Полоса 33 И протеина реагирует с коканавалин Й-пероксидазными реагентами, хотя ни одна из полос протеина 30, 28, 25 Ииз дрожжных клеток, содержащихрй 1 Т 12363, не реагирует. В присутствии 0,135 М метил-альфа-О-маннопиранозида связывания конкавалина А с 33 Мб протеином непроисходит,П р и м е р 26. Клетки, содержащие срйТ 12660 и рй 1 Т 12377, выращивают в се 40 лективной среде (УИВ + 80 г/мл гистидинана Х 100, 0,5% деоксихолата 0,1% ЗРЯ и снова нагревают в течение 1 мин при 100 С.К кипящему экстракту добавляют 25 мл 10%-ной суспензии предварительно промытого иммунопреципитина и систему инкубируют е течение 30 мин при 0 С. Полученную смесь осветляют центрифугироеанием в течение 5 мин на микрофуге. К верхнему слою жидкости добавляют 2,5 мл моноклонального антитела 6 специфичного к 5 протеину полученную смесь инкубируют е течение 1 ч при 0 С Затем добавляют еще одну порцию (25 мл) иммунопреципитина и полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 0 С. Имунные комплексы собирают центрифугированием (5 мин в микрофуге) и промывают РВИ, содержащей 2 М мочевины, РВЗ, содержащей 1% 2-меркаптоэтанола, и наконец РВЯ. Окончательно промытые гранулы повторно суспендируют в буферном растворе.Образцы, содержащие 10 срв подвер гают электрофорезу через 12,5% ЗРЯ полиакриламидный гель, После электрофореза гели фиксируют в 40%-ном метанольном растворе 10%-ной уксусной кислоты, обрабатывают для флюорографии, сушат на фильтроеальной бумаге в вакууме и подвергают флюорографии с использованием пленки приС,В результате показано, что дрожжевые клетки, содержащие рВТ 12660. синтезируют 33 Ы протеин в отсутствии туникамицина и ЗО ко протеин в присутствии туникамицина. Обе полосы отсутствуют в соответствующих образцах клеток, содержащих рйТ 12377.Полученные результаты показывают что 33 ко рге 32 - Б протеин, экспрессированный в дрожжевых штаммах 065 с 1 гнесет олигосахаридную часть, й-гликозидно-связанную с аспарагином.П р и м е р 27, Олигосахаридная структура,Сырые клеточные экстракты клеток, содержащие рй 1 Т 12660 или частично очищенные препараты; содержащие рге Я 2-3 частицы из таких экстрактов, обрабатывают эндо-й-.ацетилклюкозаминидазой иэ Ятгерчовусез рПса 10 з.Частично очищенные частицы (50 мл, 450 мг/мл протеина) кипятят в течение 3 мин при 100 С л е присутствии 0,1% додецилсульфата натрия, разбавляют 10 раз 100 М натрий-цитрата с рН 5 и к 240 мл такой смеси добавляют 2,4 мл андо Н (74 мг/мл). Образцы, содержащие и не содержащие андо Н, инкубируют в течение 2 ч при 37 С, Анализ образцов, обработанных и не обработанных эндо Н, осуществляют с помощьюЮЯ-поликриламидного гель-электрофореза и иммуноокрашивания с детекцией моно; клональным антителом 6 к протеину В, позволил установить исчезновение полосы, соответствующей 33 Ю и появление полосы 31 Мб в ходе обработки андо Н, Полоса 31 И продолжает реагировать с конканаеалин А- пероксидазными реагентами. Положение других полос (30, 28 и 25 М) не изменяется в ходе обработки эндо Н, Аналогичные результаты получают и при более длительной инкубации или при более высоких концентрациях андо Н,5 10 П р и м е р 28. Сырой дрожжевой экс 15.тракт, содержащий рге 82 3 частицы, готовят измельчением дрожжевых клеток в присутствии эквивалентного весового количества экстракционного буфера, представ 20 ляющего собой 50 вМ фосфата натрия с рН 8,1 4 вМ ЕДТА, 1,0% Таина, 4 вМ РМЗЕ и 10% изопропанола или 200 вМ трис-НС с рН 9,0, З.О М йаС, 10 вМ ЕДТА, 10 вМ ЕОТА (этиленгликоль-бис-(бета)-аминоэтиловый эфир й, й, й, й -тетрауксусной кислоты), 1% Таина, 4 вМ РМЯЕ и 10% изопропанола,Устанавливают рК гомогената, равным 8,0 или 9,0 соответственно, и после этого его центрифугируют е течение 45 мин при 25 30 30000 хд.К 500 мл сырого дрожжевого экстрактас рН 7,2 добавляют 10 г коллоидного оксидакремния. в течение ночи при 4 С и затем центрифугируют с низкой скоростью вращения, Гранулы трижды промывают 150 мл 0,15 М раствора йаС в течение 1/4 ч и затем периодически элюируют 250 мл 10 вМ пирофосфатного буффера (рН 9,3), содержащего 2% Твина, причем реакцию проводят в тече- . ние 3 ч при 37 С. Десорбат, представляющий собой желтоватый, ярко опалесцирующий 40 раствор, пропускают через 50 мл колонку с фенилборонатной агарозой, уравновешенную 10 вМ раствором пирофосфатного буфера с рН 9,0. Объемная скорость 15 мл/ч.Колонку дополнительно промывают 2 объемами уравновешивающего буфера и затем элюируют е обратном направлении 100 вМ сорбита е 50 вМ трис (рН 7,2) при объемной скорости 15 мл/ч. Элюирован-. ные целевые фракции сливают и после установления рН 8,1 пропускают через колонку с ДЕАЕ-фрактогель ТИК, уравновешенную 50 вМ раствором трис с рН 8,2, Частицы элюируют тем же буфером, содержащим 75 вМ ИаС 1. После этой стадии удаляют остав 35 Коллоидную суспензию перемешиваютП р и м е р 29. Аэросил-десорбат в количестве 50 мл пропускают через 5 мл.колонкус чечевичной агарозой, уравновешеннойуравновешивающим буфером, (трис-буфер)в количестве 10 аМ (рН. 7,2), 0,14 МйаС и0,3 Твина. Колонку промывают двумя объемами уравновешивающего буфера 10 гпМ(рН 7,2) и затем элюируют сахаром, обладающим специфичностью на чечевицу, такимкак 0,5 М альфа-метилманнопиранозид вуравновешивающем буфере.Результаты материального балансапредставлены в табл.6, . 3В результате исследования устанавливают, что гибридные частицы содержат 5-50мкг Твинана 100 мкг протеина,П р и м е р ЗО. Иммуногенность частиц,полученных из экстрактов клеток. содержащих рйТ 12660, изучают на двух штаммахмышей. Ва 1 Ь/с (Н 2-б) и йМЮ (Н 2-0), Перединъекцией частицы адсорбируют на А (ОН)3и мыцам (5 мышей на группу) внутрибрюшинно вводят по 0.3 мкг 11 А реагирующего 4материала. Через 1 мес после иммунизациимышей умертвляют, спускают кровь и сыворотку мышей одной группы сливают. Титрантител к 8-белку в полученных препаратах .определяют с использованием набора 4АОЯАВ (Аббот Лабс) и стандарта ВНО, антитела к регпептиду определяют с использованием анализа в твердой фазе (В 1 А),согласно которому синтетический рге 82пептид абсорбируют на пластмассе и связанные антитела определяют с помощьюанти-мышиного 19 О кодона, меченого иэотопом 1, Результаты, приведенные в табл,7,доказывают, что экстракты дрожжевых клеток, содержащие рЮТ 12660, индуцируют 5антирге 82 антитела в обоих штаммахмышей, причем у мышей штамма йМй 1 индуцируются более высокие титры анти-рге82 антител, чем у мышей штамма ВэЬ/с.Титр антител к 3 белку, полученный у мышей шиеся нуклеиновые кислоты (до содержания1 мкг/20 мкг протеина).Результаты материального баланса представлены в табл.5.Готовят материал, очищенный от экстрактов дрожжевых клеток, содержащих р 81 Т 12660, с последующим разновесным центрифугированием в присутствии СЯС 1, после чего этот материал подвергают исследованию на.электронном микроскопе после окрашивания его ацетатом уранила. В результате такого исследования обнаруживают наличие структур дискретных частиц с диаметром 19 мкм и установлено, что содержание таких гибридных частиц составляет 5 - 20 мкг.Твинана 100 мкг протеина. штамма Ва 1 Ь/с или йМВ 1 в 2-3 раза выше,чем титр, полученный при более высокойдозировке из дрожжевых клеток, содержащих рй 1 Т 12363.5 Результаты по изучению иммуногенности, относящиеся к частицам Рге 32-3 суммированы в табл.7.Титр представляет собой разбавление,обеспечивающее значительное связывание10 антитела (в 2,5 раза превышающее значение, полученное на отрицательной контрольной сыворотке).П р и м е р 31. Первая стадия представляет собой слияние ТДНЗ промоторного15 участка сете Бнч-термннааьним участкомНВЧ генома. Исходное вещество представляет собой плазмиду рЮТ 12792, содержащую фрагмент йсо 1 - ХЬа 1 размером 495 Ьр с31-Рге 32 кодирующей последовательно 20 стью за исключением последнего аспарагинового кодона.Оба фрагмента йсо-ХЬа 1, содержащиеся на рЮТ 12792 и рй 1 Т 12793, получают иэДНК рге 31-рге 82 штамма. вируса гепатита5 В (серотип Оба); клонированного на плазмиде рй 1 Т 10616.рЮТ 12792 в количестве 52 мкг гидролиэуют в присутствии йсо и ХЬа 1 эндонуклеази обрабатывают нуклеазой фасоли с тем,0 чтобы устранить 5 ответвления. Обработанный и очищенный 495 Ьр йсо 1-ХЬа 1 фрагмент в количестве 600 и г (2 пмоль)лигатируют с 170 и г (0,02 пмоль) рйТ 12314.вектора, предварительно линеаризованно 5 го с помощью ВаеН 1 и Яаа эндонуклеаз, иобрабатывают нуклеазой фасоли рй 1 Т 12314содержат полный 2 микронный фрагментЯ,сегеч 1 з 1 ае и ТДНЗ промотор, отделенный. от АРСЗ терминатора ВааН 1-Ягпа 1-ЕсоЮ0 линкером,ВавН 1 ЕсойЯааАТООАТСССССООААТСрТДНз 1 АВСз5 Лигировэнную смесь используют длятрансформации Е,со ММ 294, Отбираютшесть трансформэнтов, содержащих плэзмиду, в которой фрагмент 81-рге 82 вставлен в правильной ориентации. Получают0 плазмиду рйТ 12843 (афСледующая стадия заключается эовнедрении в каждую из плазмид рЮТ 12843(а.) 8 кодирующего участка с целью перестройки всего рге 81-82-8 гена.5 Эту операцию проводят следующим об.разом.Каждую из плэзмид рй 1 Т 12843 (эЛ) гидролизуют в присутствии рестриктаз ВэеН 1.и Яай. ВаеН 1 сайт помещают в начало рге82 участка, тогда как сайт ЯаИ помещаюттрансформант проявляет родственный протеин в.23 К,П р и м е р 32, Готовят черые клеточныеэкстракты из дрожжевого штамма 10 Я 44 Ссго, содержащие рВ 1 Т 12845, рВ 1 Т 12660 или 40рВ 1 Т 12377, и дрожжевого штамма ДС 5 с 1 гоЭкстракты из штамма 105 44 С с 1 г, содержащие рВ 1 Т 12843 и рЮТ 12660, показываютсильную антигенную активность НВзАц, которая отсутствует у экстрактов из штамма 4510 Я 44 С сго, содержащего рВ 1 Т 12377, илиштамма ДС 5 с 1 г, содержащего рВ 1 Т 12363,Центрифугирование сырых клеточныхэкстрактов из 10 Я 44 С с 1 г клеток, содержащих рВ 1 Т 12845, и измерение НВзАц антигенной активности методами АУЯ ЮА в СЯС 1фракциях позволило обнаружить антиген сполосой около гЬо = 1,2 г/см; АктивностьСЯС 1 фракций в отношении связывания срге Я 1 антителами испытывают с помощью анализа Е 1 ЯА, После того, как антиген свяжетсяс твердо-фазным анти-НВзАц, его инкубируют в присутствии моноклонального антитела МА 18/7, которое далее детектируют с помощью биотинированного антимыпосле АРБУЗ терминатора в рВВ 327. Самый крупный фрагмент ВаглН 1-Яа 11(10,400 Ьр) в количестве 80 и г 0,012 ммоль), очищенный от плазмид рВ 1 Т 12843 (аФ), лигируют с 300 и г (О;11 пмоль) фрагмента ВатН 1-Яэ 1 из рВТ 12660 4800 Ьр, фрагмент ВапН 1-ЯаИ рВ 1 Т 12660 содержит часть рге Я 2-Я кодирующей последовательности, за которой следует АР 6-терминаторные последовательности иЕУ 2 дрожжевая последовательность, После лигирования и трансформации штамма Е.со 1 ММ 294 каждой из плазмид рВ 1 Т 12843 (аЛ) отбирают клоны, содержащие плазмиды, названные рВТ 12845 (а.,Л). Такие плазмиды рВ 1 Т 12845 (аЛ) используют для трансформации Я.сегечз 1 ае штамма 10 Я 44 С сго, Скрининг культур, выросших из индивидуальных клонов трансформацией дрожжей, проводят путем испытания сырых клеточных экстрактов в наборе АУЯ ЮА. Сырые клеточные экстракты готовят путем разрушения дрожжевых клеток, ресуспендированных в РВЯ, содержащей 0,5 О/о Таина, 2 мМ РМЯР и 5 О изопропанола, Испытывают по одному трансформанту из каждой из шести отдельных трансформаций в присутствии рВ 1 Т 12845 (аЛ), Пять из шести испытанных трансформантов дают положительную реакцию при испытании АУЯВ 1 АОбразцы сырых экстрактов подвергают иммунологическому исследованию. Четыре из пяти трансформантов с положительной реакцией при испытании АУЯ ЮА обнаруживают Я-родственный протеин 39 К. Один 5 10 15 20 253035 шиного 1 ц, стрепдавидин-биотинированного комплекса пероксидазы хрена и.хромоге-,на,Полученные результаты показывают,что рге Я 1-рге Я 2-протеин, продуцированный в 10 Я 44 С сг клетках, содержащихрВ 1 Т 12845, скапливается в частицы, аналогично частицам НВзАц, полученным из сыворотки,П р и м е р 33, Анализируют НВзАцродственные протеиновые мономеры, экспрессированные в клетках, содержащихр В 1 Т 12845.Миграцию и иммунную реакционноспособность клеточных протеинов сравниваютс протеинами из НВзАц частиц, очищенныхот человеческой сыворотки.Для анализа протеинов используют трииммунореагента; - моноклональное антитело к Я эпитопу, - поливалентную антисыворотку кролика и рге Я 2 пептида,моноклональное антитело МА 18/7, специфичное к рге Я 1 эпитопу.Анализ иммуно-блотингом показал наличие среди клеточных протеинов клеток10 Я 44 С рВТ 12845 двух протеинов, специфически реагирующих со всеси тремя иммунореагентами, описанными выше,Устанавливают, что молекулярный вес двухтаких протеинов составляет 38.000 и 45.000дальтонов, рге Я 1 - рге Я 2-Я протеин весом38000 дальтонов мигрирует несколько быстрее, чем р 39 рге Я 1-рге Я 2-Я протеин изНВЗАц частиц.Данные результаты показывают, чтодрожжевые клетки, содержащие рВ 1 Т 12845,экспрессируют два протеина весом 38 и 45М, несущие рге Я 1, рге Я 2, а также Я-эпитопы.П р и м е р 34, Дрожжевые клетки, содержащие рЮТ 12845, разрушают стеклянными шариками, взятыми в эквивалентномвесе (диаметр 0,45 - 0,50 мм), в равном весе10 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,4),содержащего 2. ЯОЯ и 8 мМ ЕДТА, в результате перемешивания в смесителе.После центрифугирования верхнийслой в течение 4 мин нагревают при 100 С,Жидкость из нагретого верхнего слоя вколичестве 10 мкл разбавляют 40 мкл 25 мМнатрийцитратного буфера (рН 5,0) и добавляют 2 мкл ЕпбоН (74 мкг/мл). Образцы,содержащие и не содержащие добавленныйЕпсоН, инкубируют в течение 2,5 ч при 37 ОС.Обработанные и не обработанныеЕпбоН образцы анализируют методом электрофореза на ЯОЯ-полиакриламидном гелеи осуществляют иммуно-блотинг,Пятно анализируют с помощью моноклонального антитела 6 МА 18/7.В соответствии с анализом методом иммуно-блотинга, как в случае моноклонального антитела 6, так и моноклонального антитела МА 18/7, наблюдают исчезновение полосы, соответствующей 45 И и появление полосы 41 Мб в ходе обработки ЕпбоН, Обработка .ЕпбоН не оказывает влияния на миграцию полосы 38 И. Эти результаты показывают, что рге 81 рге 82-8 протеины с молекулярным весом 1045 Мб несут й-гликозидносвязанную олигосахаридную цепь высоко-маннозного типа.П ри м е р 35. Клетки дрожжевого штамма 108 44 С с 1 г, содержащие рЯ 1 Т 12845,Клетки (20 мл культуры) метят в.течение 60 мин в С ЗН-меченой миристиновой кислоты и затем собирают центрифугированием. Полученные клетки промывают 20 холодной Н 20, ресуспендируют в 100 мл 3 мМ трис-НС 1 (рН 7,4), содержащего 3 мМ(ДТТ), 1 808 и 1.мМ РМ 8 Е, и разрушают 100 мг стеклянны: шариков в результатешести 30-секундных стадий. интенсивного 25 перемешивания в смесителе, причем перед каждой стадией проводят охлаждение льдом, Осколки удаляют путем центрифуги-,рования в течение 1 мин на центрифуге.Экстракт в количестве 20 мкл обрабатывают 30 в течение 3,5 ч при комнатной температуре 7 мкл свежеприготовленного 4 М гидроксиламина, 20 М глицина рН 10.. Образцы, .обработанные и не обрабо 35 танные гидроксиламином, подвергают электрофореэу на 808 полиакриламидном геле. Образцы, не обработанные гидроксиламином, подвергают анализу методом иммуноблотинга в присутствии моноклонального 40 антитела, распознающего 8 эпитоп. Методом -флюорографии устанавливают, что меченая полоса, соответствующая 38 Мб, присутствует лищь в клеточном экстракте дрожжевых клеток, содержащих .рЯ 1 Т 12845. Меченых полос, специфичных 45 для экстрактов иэ клеток,.содержащих рй 1 Т 1 2550. не обнаруживают,. Эти результаты показывают, что рге 8182-8 протеин весом 38 Мб содержит кова лентно-связанную миристиновую кислоту, 50присутствующую в амидной связи. Как пра-. вило, миристат ковалентно связывается с протеинами путем амидной связи с аминотерминальным глицином, Этот факт позволяет предположить, что инициирующий кодон для Мес удален из рге 81 рге 82-8 протеина и что 61 у остаток в положении 2 доступен для ациллировэния миристиновойкислотой. рЯ 1 Т 12660, или рЯ 1 Т 12377, выращивают в 15УйВ до значения ОД 62 о нм порядка 0,4; П р и м е р 36. Плазмида рЯТ 12793 содержит рге 81-рге 82 кодирующую последовательность на йсо 1-ХЬа 1 фрагменте размером в 495 Ьр, ДНК плазмиды рЯ 1 Т 12793 гидролизуют в присутствии эндонуклеазы йсо 1, обрабатывают Т 4 ДНК полимеразой для заполнения липких концов и далее гидролизуют в присутствии ХЬа эндонуклеазы, Фрагмент йсо IТ 4 ДНК полимераза/ХЬа очищают злектрофорезом на полиакриламидном геле и электроэлюированием и встраивают в вектор рУС 12, предварительно обработанный Згпа 1 и ХЬа 1 зндонуклеэзами, ЕДинственный Взт Х сайт присутствует на й-конце рге 81 кодирующего участка.Экзогенные кодирующие последовательности ДНК могут быть введены путем гидролиза рЯ 1 ТХ и ее производных эндонуклеазами Взт Х и ВавН 1 или Есой или Рзс 1 и встраивание этой кодирующей последовательности между этими сайтами, в результате чего происходит удаление большей части рге 81 кодирующего участка и й-терминальной части рге 82 последовательности, После получения таких конструкций они могут быть рекомбинированы в другие плазмиды, содержащие остаток рге 81-.рге 82 последовательностей, необходимых для сохранения и репликации в Е.соН и 8.сегеч 1 сае.Из таких геномных клонов НУ вируса получают различные субфрагменты, как рге 82-8 ДНК .кодирующие последовательности. Такие гибридные частицы служат ос. новной вакцины для защиты людей от инфицирующего агента Н 1 У.Исходный материал представляет собой плазмиду рВН 10-Я 2. содержащую ге- . ном Н 1 У изолята ВН 10. 3108 Ьр 8 аП-ХЬо фрагмент ДНК вирусного происхождения вырезают из рВН 10-Я 2 и клонируют между 8 аП и ХЬо сайтами плазмиды рУС 18 и получают плазмиды рЮТ 12901.ДНК рЯ 1 Т 12901 гидролизуют эндонуклеазами В 91 и МЬоП и фрагмент размером 117 Ьр выделяют электрофорезом на акриламидном геле и электроэлюированием. ДНК фрагмента обрабатывают нуклеазой фасоли с целью удаления однонитевых от" ветвлений и лигатируют с ДНК рЯ 1 Т 10911, которую переваривают эндонуклеазой ВавН и обрабатывают нуклеазой фасоли. Из лигировэнной смеси выделяют плазмиду рй 1 Т 12893, в которой фрагмент В 911-МЬоИ, размером в 117 Ьр иэ рйТ 12901 встраивают на рЯ 1 Т 10911; Определяют нуклеотидную последовательность ТДНЗ протомора, ели. того с фрагментом НТ 1 УИ 89 И-МЬоП размером 117 Ьр. Устанавливают, что такая последовательность имеет вид:5 АТССАССАООАСАТАТСАСССА 3,31 1746887 5 10 15 20 25 30 35 5 6 АТСТС 6 АСА 66 ССС 6 АА 66 ААТА 6 АА 6 АА 6 АА 66 Т 66 А 6 А 6 А 6 А 3 3 А 6 СТ 6 ТСС 666 СТТССТТАТСТТСТТСТТССАССТСТСТСТ 5 5 6 АСА 6 А 6 А 6 А 6 АТСССС 6 3 3 СТ 6 ТСТСТ 6 ТСТА 6666 ССТАС 5 45 где первый АТ 6 кодон представляет собой фрагмент ТНДЗ промоторного участка рйТ 10911, а вторая группа представляет собой внутренний АТ 6 кодо С 7 пептидного фрагмента, Второй АТ 6 кодон перекрывает Т 6 А терминальный кодон. Такой кодон терминации находится в той же рамке считывания, что и первый АТ 6 кодон. Определение последовательности ДНК 3 участка на рйТ 12893 позволила установить правильную последовательность слияния, обработанную нуклеазой фасоли МЬо конца НТУ/П фрагмента с рге 52 последовательностью на рйТ 10911,Затем ДНК рйТ 12893 обрабатывают в присутствии Нпб И эндонуклеазы и выделяют фрагмент размером 3250 Ьр, который очищают электрофорезом на агарозагепе и электроэлюированием. Затем фрагмент Нпб П размером 3250 Ьр вставляют в Нпб П сайт плазмиды УЕр 13 с целью получения . рйТ 12894, ДНК плазмиды используют для трансформации клеток дрожжевых штаммов ДС 5 и 105 44 С. Транскрипция и трансляция в дрожжевых клетках С 7 слитого -рге 32 - Я белка ДН К. на рйТ 12894 приводит в результате к синтезу пептида на 5 остатков, начинающегося с ТДНЗ кодона, а также С 7 - рге 52-слитого пептида, начинающегося на втором внутреннем АТ 6 кодоне С 7 последовательности, Такое слияние содержит 38 аминокислотных остатков С 7 пептида вместо 45 остатков Этот фрагмент имеет 5 В 9 ЕП и 3 ВагпН однонитевые концы. Примерно 20 г двухни. тевого фрагмента и 300 и г ДНК плазмиды рйТ 10911, обработанной ВатН смешива. ют и лигируют. Идентифицируют лазмидурйТ 12898, выделяют ее и внедряют в нее фрагмент. размером. 60 Ьр на сайте ВааН рйТ 10911 ДНК рйТ 12899 гидролизуют с Нпб П эндонуклеазой и Нпб П фрагмент размером 3200 Ьр очищают электрофорезом на агарозовом геле и электроэлюированием, Нпб П фрагмент вставляют на Нпб И сайт УЕр 13, получают плазмиду рйТ 12900. Затем ДНК плазмиды рйТ 12900 используют для трансформации дрожжевых штаммов ДС 5 и 105 44 С.П р и м е р 38. Дрожжевые штаммы ДС 5 или 105 44 С, содержащие УЕр 13, рйТ 10912,интактивного В 9 П-МЬоП - обработанногонуклеазой фасоли С 7 фрагмента. ДНК рйТ 12901 гидролизуют в присутствии эндонуклеаз НЬа и Нпб И, выделяют фрагмент размером 230 Ьр. Этот фрагмент очищают электрофорезом на акриламидном геле и электроэлюированием и обрабатывают ДНК полимеразой с целью заполнения однонитевых ответвлений. Обработанный таким образом фрагмент вновь лигируют с ДНК рйТ 10911, которую обрабатывают ВатН и нуклеазой фасоли, Из лигированной смеси идентифицируют плазмиду рйТ 12897, в которую встраивают фрагмент НУ ДНК размером 230 Ьр в правильной рамке считывания с целью слияния с рге 82 последовательностью рйТ 10911. Затем ДНК плазмиды рйТ 12897 гидролизуют с Нпб П эндонуклеазой и фрагмент размером 3365 Ьр, содержащий ТДНЗ промотор, НУ-рге 52 - 3, АР 63 терминатор, очищают электрофорезом на агарозовом геле и электроэлюированием. Такой 365 Ьр фрагмент лигируют с плазмидой УЕр 13 гидролизованной с Нпб И эндонуклеазой и получают рйТ 12898. ДНК плазмиды (рйТ 12898) используют дпя трансформации клеток дрож-. жевых штаммов ДС 5 и 105 44 С,Фрагмент синтетической ДНК размером 60 Ьр, синтезируют традиционными способами в виде двух единичных нитей, которые затем подвергают совместной ренатурации: рйТ 12894 или рйТ 12898, выращивают в жидкой среде, не содержащей лейцина (УчВ + 80 мкгlмл гистидина или УМВ) и клеточные протеины анализируют методом40 иммуноблотинга, используя в качестве первого антитела моноклональное антитело к эпитопу НВзА 9 человека. рйТ 12894, рйТ 12363 несет Я ген НВЧ, слитый с ТДНЗ промотором в виде фрагмента Нпб П размером 2900 Ьр из рйТ 12322, внедренного в дрожжевую векторную плазмиду, идентичную рйТ 12377, и продуцирует НВзАд под контролем ТДНЗ промотора, Методом иммуно-блотинга обнаруживают полосу,50.родственную 3 протеину с молекулярным весом порядка 32 И среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС 5 или 105 44 С, трансформи34 33 1746887 Таблица 1 блица 2 рованных с помощью рйТ 12894. Полоса. относящаяся к Я протеину с молекулярным весом порядка 45 Ю присутствует среди общих клеточных протеинов из дрожжевых штаммов ДС 5 или 105 44 С, содержащих рйТ 12898, тогда как полоса, относящаяся к протеину 8 молекулярного веса порядка 29 И, присутствует среди клеточных протеинов иэ дрожжевого штамма ДС 5, содержащего рйТ 10912,Готовят сырые клеточные экстракты из дрожжевого штамма ДС 5. содержащие или рйТ 12363, рйТ 10912 или рВТ 12894. Измеряют концентрацию протеина и активность по АУЯ 8 А. Осуществляют анализ этих экстрактов методом иммуноблотинга.СЗС центрифугирование сырых экстрактов и измерение НВэАд антигенности методом АУЯ ВА в СЗС фракциях позволяет обнаружить антиген, соответствующий полосе около гЬо = 1,2 г/см . Этот результатзподтверждают методом иммуно-блотингаСЯС фракций,Дрожжевые клетки штаммов ДС 5 и 105 44 С, трансформированные или рйТ 12894или рйТ 12898, синтезируют слитый протеин с молекулярным весом порядка 32 и 45Ю оба из которых несут Я этитоп.формул а и зоб рете н ия10, Способ получения гибридного полипептида, содержащего НВзАд, предусматривающий конструирование рекомбинантныхплазмидных ДНК, кодирующих слитый полипейгид, трансформацию полученными15 ДНК штаммов ЯассЬагогпусеэ сегечэае,выделение и очистку целевого продукта, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что конструируютрекомбинантную плазмидную ДНКрйТ 12573, или рйТ 12574, трансформируют20 штаммы Я.сегечэае 1044 С или ДС 5.Глико 3 илирован недостаточно для удерживания на колон 35 3746887 36 Таблица 3 аблица лица 5 абли+я+Анти-рге 5 2 антителаДоза Я- родственного антигена, мкг Вводимые препараты ВаЬ/с ВаЬ с ММЙ 1404 . 748 2 4 0 0 7191163 1,71,55 0 120 2418 3344 0,3 Т, 2660Определение осуществляют с использованием АУЯ 8 АОпределение осуществляют с использованием набора АЧЗ АВ.Определение осуществляют с применением радиационно-иммунологического анализа в твердой фазе и синтетического рге 8 2 пептида, адсорбированного на пластмассе. Редактор Н.Гунько Заказ 2406 ТиражПодписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101. Частица дрожжей, управляемая рйТ 2363 Частица дрожжей, управляемая рйТ 2363+ синтетический рге 8 2 пептид: 0,08 мкгСинтетический рге 8 2 пептид:0,08 мкгрге 2-8 частица дрожжей, управляемая Я Составитель Н.КузенковаТехред М.Моргентал Корректор О.Кундрикзуется следующей аминокислотной последовательностью; хоМеР 61 п-Тгр-Азп-Бег-ТЬг-Аа-РЬе - Нз - 618-А 1 а.ецп-Азр-Рго-Аг 9-.а-А Г 9-61 у.ец-Туг-Р пе-Р го-А 1 ауу-Яего -Бег-Зегу-ТЬг-Ча 1-Азп-Рго-Аа-РгР Азп-Ие - А 1 а-Яег-Н 1 з-Ие-Яег-Зег-Зег-бег - Аа -Аг 9-ТЬгу-Аз р-Рго-Ча 1-ТЬг-Азп.Функциональным производным Рге 82-3 согласно предлагаемому способу является производное, у которого аминокислота аланин (6 СТ) в положении 45 модифицирована с помощью сайт-специфического мутагенеза на треонин (АСТ),Рекомбинантная плазмидная ДНК состоит из последовательности, кодирующей Рге 32 и Рге 32-3 белок, лигированной с регуляторной областью.П р и м е р 1, Конструкция плазмиды рй 1 Т 10167,В качестве исходного материала используют плазмиду рбу, содержащую фрагмент 2.1 кЬ Н 1 бп 111 дрожжевой ДНК, кодирующий ген ТО НЗ, клонированный на рВй 322. Фрагмент Н 1 пб 1 И дрожжевой ДНК клонируют в рВй 322, в которой сайт Есойразрушают и получают рй 1 Т 10164.ДНК рй 1 Т 10164 очищают путем центрифугирования в градиенте С С 1-этилбромид, 150 мкг рйТ 10164 ДНК обрабатывают 75 единицами эндонуклеазы ХЬа, экстрагируют фенолом и эфиром, осаждают этанолом в ДНК, ресуспендируют в 0,01 М трометамин-НО-буфере при концентрации 1 мкг/мкл, 20 мкг ДНК, обработанной ХЬа 1, гидролизуют Ва 131 для удаления 61 п.о. ДНК между АТ 6 кодоном и сайтом ХЬа 1. Обработку Ва 131 осуществляют при 30 С в течение 1 - 3 мин в буфере, содержащем 600 ммоль хлористого натрия, 12 ммоль хлористого кальция, 12 ммоль хлористого магния, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕО ТА), 20 ммоль трометамин-НС 1, рН 3,1 с использованием одной единицы нуклеазы Ва 131 на 20 мкг ДНК в конечном реакционном объеме 200 мкл. Реакцию останавливают путем добавления этилен-бис(оксиэтиленэмтрило)тетрауксусной кислоты (Е 6 ТА) с получением конечной концентрации 20 ммоль и образцы экстрагируют эквимоляриыми объемами фенола, эфира и осаждают этанолом. Каждый образец ДНК ресуспендируют в 211,мкл 10 мМ буфера трометамин-НС 1, рН 7,5.Степень гидролиза Ва 131 измеряют путем обработки 2,5 мкг образца ДНК эндонуклеаэой Нра 1 и путем сравнения размера фрагмента Нра 1-ХЬа 1 с фрагментом 335 Ьр Н ра 1-ХЬа 1 из рйТ 10164, Двухминутный гидролиз Ва 31 удаляет 41-88 нуклеотидов изфрагмента ХЬа 1-Нра плазмиды рйТ 101645 мкг ДНК обрабатывают эндонуклеаэой ВавН, проводят экстракцию фенолом5 и осаждение этанолом. Эту ДНК обрабатывают 5 единицами, Т 4 полимеразы в присутствии дезоксинуклеотида трифосфатов длятого, чтобы заполнить ВавН 1 и Ва 131 концы, экстрагируют фенолом и извлекают10 осаждением этанолом. 2,3 мкг этой ДНК обрабатывают 5 ед. Т 4 ДНК лигазы и половинусшитой ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е.соИ К 12 штаммаММ 294. 1 мл трансформированной популя 15 ции Е,соИ разбавляют в 350 мл -бульона с200 мкг/мл ампициллина и общую плаэмидуДНК очищают иэ полученной культуры,80 мкг этой плазмиды ДНК обрабатывают 75 ед. Н 1 пб И эндонуклеазы и 96 ед.20 ВавН эндонуклеаэы.Целевые фрагменты Н 1 пб И 1-ВавН 1, соответствующие размерам 1100-1000 Ьр, напрепаративном 1 ф -ном агароэном геле выделяют из геля в два среза, причем один25 соответствует ДНК с размером около 1070Ьр, другой - 1030 Ьр. ДН К извлекают из двухагарозных гелевых срезов с помощью циклов замораживания и оттаивания, после чего проводят центрифугирование агарозы с .30 высокой скоростью. Верхний слой жидкостиотфильтровывают с помощью фильтров иДН К извлекают с помощью двух циклов этанольного осаждения и ресуспендирования в20 мкл 0,01 М трометамин-НС буфера с рН35 7,5,Анализ агароэного геля электрофореэом и сравнение гидролизованной Нпб И- ХЬа 1 плазмиды рй 1 Т 10164 ДНК и сфрагментами из Н 1 пб 1 И Есой 1 фага АДНК40 показывает, что получают два различныхфрагмента Н 1 пб И 1-ВавН 1, один размером1070 Ьр, а другой размером около 1030 Ьр,в сравнении с 1120 Ьр Н 1 пб 1 И-ХЬа 1 фрагментом плазмиды рйТ 10164. Около 100 нг45 фрагмента 1030 Ьр Н 1 пб И 1-ВавН 1 лигируютс 200 нг плазмиды рОС 9, которую обрабатывают Н 1 пб И 1 и ВавН эндонуклеазами ищелочной фосфатазой. Полученную ДНК используют для трансформации клеток Е.со 1150 штамма 3 М 103 с селекцией на устойчивостьк ампициллину,Получают около 400 устойчивых к ампициллину колоний на 1 мл и 98 колоний ииспытывают в среде, содержащей Ха 1,55 Плазмиды из трансформированных колоний получают после амиплификацииплазмид путем добавления спектиномицина (150 мкг/мл) к растущим культурам,Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5%-ной акриламидном геле после40 препарат обрабатывают эндонуклеаэой ми Са 1, ДНК рйТ 10158 гидролизуют эндонук- об леазами Оа и НаИИ и фрагмент 1150 Ьр Н Са-На 11, несущзий область окончания ок транскрипции агд . гена. извлекают путем 55 ф препаративного электрофореза на агароз- фр ном геле и злектроэлюированием. Этот уч фрагмент лигируют с ДНК плазмиды рй 1 Т 10158, обработанной Есой 1, Т 4 ДНК (и полимеразой, С 1 а 1, и лигированную смесь ш гидролиза с АЧаИ и ВааНзндонуклеаэами и сравнивают с 450 Ьр фрагментом АЧаИХЬа 1, включающим промотор-й-концевую кодирующую область рйТ 10164, и с НраИ фрагментом ДНК плазмиды рВЯ 322. АЧаИ ВааН фрагмент присутствует в 35 из 36 плазмид, Три плазмиды выбирают для дальнейших исследований, Плаэмидную ДНК выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности СЯС 1-этил бромид и 25 мкг 10 ДНК гидролизуют Есой 1. Есой концы метят у-Р-АТР.П р и м е р 2. Конструкция векторной рй 1 Т 10172.1050 Ьр Н 1 п б 11-Ваа НТО НЗ ДН К 15 вставки иэ рй 1 Т 10167 клонируют на челночном векторе УЕр 13 и получают рекомбинантную плазмиду рй 1 Т 12059,ДНК плазмиды рй 1 Т 12159 гидролизуют ХЬа и ВааН эндонуклеазами и фрагмент 20 1650 Ьр лигируют с фрагментом ХЬа 1- ВааН 1, содержащим стимулятор агд на плаэмиде рй 1 Т 10774. Плазмида рй 1 Т 10774 включает репликон УЕр 13, из которого удалены сайты ВааН и ХЬо путем манипуля ции и ч 1 тго с фрагментом 1470 Ьа Нпб И 1-Ваа Н 1, включающим область стимулятора агд, ифрагментом 1150 Ьр ВааН 1-Н 1 пб И 1, включающим агд область окончания транскрипции. Замена стимулятора агд на 30 рйТ 10774 на стимулятор ТОНЗ дает плазмиду рй 1 Т 10172, которая содержит единственный сайт ВааН 1, расположенный при кодоне АТО стимулятора ТОНЗ и предшествует сигналу окончания транскрипции на 35 1150 Ьр ВааН 1-Н 1 пб И агд ДНК фрагменте. Чужеродную ДНК можно клонировать в этом сайте.П р и м е р 3. Фрагмент 1050 Ьр. Н 1 пб И 1-Есой из рй 1 Т 10167 и Н 1 пб И 1-ВааН ТОНЗ фрагмент, содержащий стимулятор, вместе с частью ВааН 1-Яаа-Есой полилинкера р.1 С 9 клонируют между сайтами Н 1 пб И и Есой плазмиды рВЯ 322. в которой предварительно удаляют сайт ВааН путем заполнения полимеразой Т 4 ДНК и лигируют.Плаэмидную ДН К рйТ 10158 обрабатывают эндонуклеазой Есой 1 и полимеразой Т 4 ДНК для заполнения Есой 1-концов, Этот 50 используют для трансформации клеток Е.соИ штамма ММ 294, Иэ трансформированных колоний выделяют плазмиду, в которой фрагмент Са 1-Нае окончания транскрипции агд вставлен между сайтами Са 1, сайт Есой заполнен и восстановлен. Плазмидную ДНК рйТ 10162 обрабатывают Есой и Рзт эндонуклеазами. смесь лигируют и используют для трансформации клеток Е.со 11 К 12 штамма ММ 294. Извлекают плазмиду рйТ 12208, в которой большой фрагмент 4630 Ьр Есой-Рзсиэ рй 1 Т 12176 лигируют с фрагментом 1930 Ьр Есой 1-Рзсиз рЮТ 10162, в котором агд область окончания сшивается со стимулятором ТОНЗ. Фрагмент 2200 Ьр Нпб И из рйТ 12208 клонируют в сайт Нпб И производной плазмиды рВЯ 322, в которой сайты Есой и ВааН удаляют путем заполнения полимеразой Т 4 ДНК.и лигированием. В обеих плазмидах рйТ 12208 и рй 1 Т 12290 фрагменты стимулятора ТОНЗ и агд окончания транскрипции разделены сайтами ВааН 1, Яаа и Есой 1, и области стимулятора и окончания транскрипции могут быть вырезаны .вместе на фрагменте 2200 Ьр Нпб,И.Сайт ВааНполезен для клонирования, так как он расположен при АТО кодоне гена ТОНЗ и может быть применен для слияния других генов со стимулятором ТОНЗ.П р и м е р 4, Конструкция плазмид рй 1 Т 10677, рй 1 Т 10909 и рй 1 Т 10158.а) рйТ 10677.ВаптН фрагмент 1372 Ьр клонированной НВзАд ДНК вырезают из рй 1 Т 10616 и лигируют с вектором РВЯ 327, обработанным эндонуклеазой ВааН 1. Этот фрагмент ВааН содержит часть области предшественника НВзАд. Получают плазмиду рй 1 Т 10677, которая имеет ВааН фрагмент НВЧ, вставленный в сайте ВааН 1 вектора в такой ориентации, что сайт ХЬа в НВЧ ДНК расположен близко к сайту ЯаИ вектора рВЯ 327,в) рй 1 Т 10909.Н 1 пб И фрагмент 3300 Ьр из плаэмиды рМС 200 клонируют в производную плаэмиды рВЯЗ 22, в которой Есой сайт удаляют путем заполнения полимеразой Т 4 ДНК, и повторным лигированием отбирают плаэду рйТ 10158, в которой Нпб 1 И имеет 3 ласть агдз гена, Фрагмент 1150 Ьр Са 1- аеИ 1 извлекают из рй 1 Т 10158, он создержит ончания транскрипции гена агд . Этот рагмент 1150 Ьр лигируют с С 1 а 1-Нрв 1агментом ДН К плазмиды рй 1 Т 10677. Полают плаэмиду рй 1 Т 10909,П р и м е р 5. Сайт ВааН рйТ 10167ример 1), расположенный в области предественника НВз Ад гена, иэ НВЧ вирусаабЮ серотипа, клонированного на рЯ 1 Т 10616, находится в одинаковой трансляционной рамке считывания. Источником НВЧ ДНК фрагмента является плазмида рЯ 1 Т 10909. Фрагмент 2085 Ьр ЕсоЯ 1-ВагпН 1 выделяют из рЯ 1 Т 10909 и встраивают в сайт ЕсоЯ и ВагпН 1 плазмиды рЯ 1 Т 10909 и получают плаэмиду рЯ 1 Т 10911, Фрагмент 3134 Ьр Нпб П 1 из рЯ 1 Т 10911, содержащий сигналы транскрипции дрожжевой ДНК и ДНК НВзАд, встраивают в челночный вектор УЕр 13 с получением плазмиды рЯ 1 Т 10912.П р и м е р 6. Сконструированы плазмиды, у которых удалены избыточные нуклеотиды из 5 конца фрагмента ДНК, кодирующего й-терминальную часть при родной НВзАд.1225 Ьр РпОО П фрагмент НВЧ ДНК из рЯ 1 Т 10616 и кодирующий НВзАд ген вырезают из этой плазмиды и лигируют с ЕсоЯ 1, фрагмент клонируют в ЕсоЯ 1 сайт вектора рАСУС 184 с получением рЯ 1 Т 10679, Получают 125 Ьр ЕсоЯ 1-ХЬа 1 фрагмент, который содержит терминальную область НВзАд предшественника. НВзАд АТО кодон и 90 Ьр -НВзАд кодирующую последовательность, Этот 125 Ьр ЕсоЯ 1-ХЬа 1 фрагмент встраивают в сайты ЕсоЯ 1 и ХЬа 1 рЯ 1 Т 10158. Полученнаяплазмида рЯ 1 Т 10903 содержит единственныйсайт ЕсоЯ 1, расположенный при стыке между ; агд ДНК и НВЧ ДНК и единственный сайт ХЮрасположенный в области стимулятора.150 мкг рЯ 1 Т 10903 плазмидной ДНК, которую получают с помощью центрифугирования в градиенте плотности СзС этиленбромида, обрабатывают 80 ед, эндонуклеазы ЕсоЯ 1, после чего экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и вновь суспендируют при концентрации 1 мкг на 1 мкл в 10 мМ буфере трометамин-НС 1 (рН 7,5).ДНК разделяют на три образца по 50 мкг и инкубируют в течение 50, 75 и 90 с с нуклеазой Ва 31 при 30 С, К 50 мкг ЕсоЯ 1 обработанной рЯ 1 Т 10903 ДНК, добавляют 2,5 ед.нуклеазы Ва 131 в конечном объеме из 500 мкл. Реакцию останавливают путем добавления ЕОТА к 20 мМ конечной концентрации, охлаждают на льду, экстрагируют эквивалентным объемом фенола и осаждают этанолом, Образцы ДНК, обработанные Ва 131, берут в 50 мкл 10 мМ буфера трометамин-НС 1 и 2,5 мкг дополнительно обрабатывают эндонуклеазой Взт ЕП, выделяют 285 Ьр фрагмент нуклеазой в течение 75 с при 30 С, уменьшает размер фрагмента,Есо Я 1-Вз 1 ЕП на 10-60 основных пар. Удаление на 29 основных пар из арпад П сайта удаляют весь НВзАд предшественник ДНК и НВзАд АТО кодон.5 мкг рЯ 1 Т 10903 ДНК обрабатывают втечение 75 с Ва 131, гидролизуют 8 ед. ХЬонуклеазы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Эту ДНК затем инкубируют с,5 ед, Т 4 ДНК полимераэы в присутствиидиоксинуклеотидтрифосфата для заполнения сайтов ХЬа и Ва 31, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом. Затем ДНК инкубируют с 5 ед. Т 4 ДНК лигазы в течение 16 ч при 16 С и смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.со 1 К 12 штамма ММ 294. Около 2000 колоний, устойчивых к ампициллину, на 1 мл извлекаютпосле посева, выделяют плазмиды из 47 индивидуальных колоний. О Одну плазмиду, содержащую фрагментХйо-ХЬа 1 размером 95-100 основных пар. 15 выбирают для исследований, ДНК этой плазмиды очищают с помощью центрифугирования с градиентом плотности СЗС 1-этиленбромид и 25 мкг такой ДНК гидролизуют 140 ед. эндонуклеазы ХЬа 1.Концы ХЬа метят у Р-АТР и меченую ДНК обрабатывают 15 ед, эндонуклеазы 20 Нпб П 1. Фрагмент 765 Ьр Н 1 пб П - ХЬа изолируют акриламидным гелевым электрофорезом и электроэлюированием, после че 25 го осаждают этанолом. Нуклеотидную последовательность вокруг сайта ХЬо 1 определяют последовательным анализом этого фрагмента от меченого конца ХЬа 1. Данные о последовательности показывают, что сайт 30 ХЬо расположен на первой основе второго Плазмиду рЯ 1 Т 12209 очищают центрифугированием с градиентом плотности смеси СЗ С 1-этилбромид и 50 мкг рЯТ 12209 ДНК гидролизуют с 90 ед, эндонуклеазы ВапН и 60 ед. ХЬо эндонуклеаэы для удаления 990 Ьр периферической ДНК между стимулятором ТОНЗ и НВзАд кодирующей областью и затем экстрагируют фенолом и осаждают зтанолом. 16 мкг этой ДНК инкукодона НВзАд кодирующей последовательности;ХЬо 1,35 СТСОАОААС,НВзАд нуклеотидов,П р и м е р 7. Плазмиду рЯТ 10911 используют в качестве носителя для дальнейших манипуляций. Плазмиду гидролизуют40 эндонуклеазами ВагпН и ХЬа 1, и этот фрагмент замещают на фрагмент 2275 ВавН 1- ХЬа 1 из плазмиды рйТ 10158, Получаютплазмиду рЯ 1 Т 12211.Плаэмиду рЯ 1 Т 12211 обрабатывают эн 45 донуклеазами ХЬо 1 и ХЬа 1, и удаляют фрагмент 1600 Ьр, Этот 94 Ьр фрагмент очищаютакриламидным гелевым электрофорезом,электроэлюируют соответствующий гелевый срез и извлекают ДНК этанолом для50 осаждения,1бируют в течение 30 мин при 30 С с 20 ед, Мунг Бин нуклеазы в объеме 125 мкл.Буфер, используемый для инкубирования, представляет собой 30 ммоль ацетатанатрия (рН 4,6), 250 ммоль хлористого на трия,.1 ммоль хлористого цинка и 5 глицерина. Реакцию останавливают добавлением додецилсульфата натрия с получением 0,2-ной конечной концентрации, проводят экстрагирование эквивалентным объе мом фенола, после чего осаждают этанолом.Аликвоту 0,5 мкг этого образца инкубируют 2 ед. Т 4 ДНК лигазы в течение 16 ч,при 16 С и затем проводят обработку 2 ед. эндонуклеазы ВагпН для разрушения каких-либо 15 векторных молекул. Зту смесь используют для трансформации клеток Е.со 1 К 12 штамма ММ 294, извлекают около 2000 устойчивых к ампициллину колоний.Четыре плазмиды берут для дальнейшего исследования. ДНК каждой плазмиды переваривают ХЬа 1 эндонуклеазой и метят у. Р-АТР, после чего гидролизуют эндонукзглеазами Н 1 пб И и выделяют меченый 1190 Ьр фрагмент Нпб.И - ХЬа 1 с помощью алек троэлюирования и этанольного осаждения с последующим акриламидным гелевым электрофорезом. Последовательность каждого . фра мгнта определяют методами химической модификации-Максама и Гильберта. 30 Две плазмиды имеют точную последовательность АТООАОААС для полноо слияния области стимулятора ТОНЗ с НВзАд геном.Одную из этих плазмид (рй 1 Т 12230).используют в дальнейших манипуляциях. ДН К этой 35 плазмиды (рйТ 12230) гидролизуют зндонуклеазами Н 1 пб И 1 и 300 Ьр фрагмент, содержащий НВзАд кодирующую последовательность, слитую-с ТОНЗ стимулятором, лигируют с челночным вектором УЕр 13, 40.Полученной плазмидой рй 1 Т 12265 трансформируют дрожжевой штамм ОС 5 (МАТа, 1 ец 2-3; 1 ео 2-112, Ьз 3, сап 1 - 11).П р и.м е р 8. 25 мкг ДНК рй 1 Т 12230 гидролизуют с эндонуклеазами Асс и Есой 1, 45 рй 1 Т 12230 содержит единичный сайт Асс 1, .расположенный в Я-ген кодирующей после- довательности за 7 нуклеотидами перед ТАА стоп-кодона. Проводят электрофорез гидролизацией ДНК на 1-ном агарозном 50 геле и извлекают векторный фрагмент 4200 Ьр из геля с помощью электроэлюирования и этанольного осаждения. Молекулы, связывающие искусственную ДН К, составленные из 12-член ного (12-тег) витка и 14-член ного (14-вег) линкера со следующими последовательностями синтезируют для вставки между Асс и Есой центрами рй 1 Т 12330:5 АТАСАТТААОО 3,12 вег. 3 ТОТАААТТОСТТАА 5,14 вег.100 пмоль синтетического 12 пег и 100пмоль синтетического 14 пег линкера смешивают вместе в конечном объеме 10-20мкл, нагревают при 70 С в течение 15 мин,медленно возвращают к комнатной температуре в течение 3 ч и обеспечивают обжигдвух витков вместе с их комплементарнымипоследовательностями. К этой отожженнойсмеси добавляют 0,15 пмоль (400 нг) 4200 ЬрАсс-Ессй фрагмента рй 1 Т 12230 10-кратноконцентрированного буфера для лигирования и.2 ед. Т 4 ДНК лигазы,Зту смесь инкубируют в течение 4 ч при16 С перед добавлением дополнительных 2.ед. Т 4 ДНК лигазы и затем инкубируют втечение ночи на льду. Смесь после лигирования используют для трансформации компетентных клеток штамма ММ 294.Выделяют плазмиды из 12 или более индивидуальных колоний,Плазмиду со вставкой Асс-Есой 1 гидролизуют,эндонуклеазами Есой и обрабаты-вают щелочной фосфатазой. Фрагмент 2650Ьр Нпб 111 рй 1 Т 10162,клонируют в сайтеНпб И рВй 327 векторной плазмиды, получают плазмиду рй 1 Т 12288.Из рйТ 12288 получают фрагмент 1180Ьр Есой 1, который несет агд. транскрипционную терминационную область. Зтот фрагмент клонируют в сайт Есой производнойрйТ 12230, которую обрабатывают щелочной фосфатазой.Выделяют 2900 Ьр. Н 1 пб И 1-фрагмент изрй 1 Т 12322.П р и м е р 9. Плазмида рйТ 12322 содержит 2900 Ьр Н 1 пб И фрагмент;со всеминеобходимыми сигналами для экспрессииНВзАд из ТОНЗ стимулятора, Этот фрагмент лигируют с челночным вектором длявведения в клетки дрожжей.ДНК челночного вектора УЕр 13 обрабатывают эндонуклеазой Н 1 пб И и щелочнойфосфатазой и используют в качестве реципиента для введения Н 1 пб И 1 фрагмента изрй 1 Т 12322. Получают плазмиду рй 1 Т 12329которая состоит из репликона УЕр 13 вместес 2900 Ьр Н 1 пб И 1 модульным фрагментом.П р и м е р 10. Плаэмиду ЧЧР 201 получают в результате введения Есой 1 фрагментаиз А аР 11 в вектор рОС 8. Фрагмент плазмиды 9/й 201, содержащий СЯ белковую кодирующую последовательность минус первый52 Ьр. очищают электроэлюировэнием из7,5-ного полиакриламидного электрофоретического геля. Зтот фрэгмент обрабатывают Зац ЗА. ВэвН Плазмиды рй 1 Т 10911,расположенный при АТО кодоне инициации, находится в фа 3 е с зац ЗА сайтами С 8Разпчобцпз 1 а 1 срагцв, ДНК плаэмидырЯТ 10911 обрабатывают с ВаеН эндонуклеазами, щелочной фосфатаэой. экстагируют фенолом и извлекают осаждениемэтанолом, 0,2 мкг этой ДНК смешивают с 0,2мкг Яац ЗА обработанного Яв 1-ЯЯа 1 СЯгена, обрабатывают Т 4 ДНК лигазой, и лигированную смесь используют для трансформации компетентных клеток Е.соИ К 12штамма ММ 294, Получают 32 плазмиды иэиндивидуальных трансформантных колоний после амплификации плаэмиды путем.добавления спектиномицина (300 мкг на 1мл) для выращивания культуры. Рекомбинантные плазмиды анализируют на 7,5 ном акриламидном электрофоретическомгеле, после гидролиза с эндонуклеазамиВапчН 1 и ХЬа 1,Н 1 пб 111 фрагменты рЯ 1 Т 12572 ирЯ 1 Т 12571, содержащие стимулятор ТО НЗ,СЯ-НВзАд гибридную кодирующую последовательность и агд область терминации,звновь клонируют в УЕр 13 и получают плазмиду рЯ 1 Т 12574 и рЯ 1 Т 12573,Плазмиды рЯ 1 Т 10912; рЯ 1 Т 12574 ирЯ 1 Т 12573 вводят в Я.сегеч 1 з 1 ае дрожжевойштамм ДС(а, 1 ец 2 - 3, 1 ец 2-112, Ыз 3, Сап1-) и в З,сегеч 1 з 1 ае дрожжевой штамм 10Я 44 С (рер 4-3, 1 ец 2-3, ец 2-112) трансформацией клеток. обработанных ацетатом лития.Плаэмидную ДНК рЯ 1 Т 12572 илирЯ 1 Т 12571 гидролизуют ВавН 1 эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатазой,1215 Ьр З 1 ц - ЯЯа 1 фрагмент плазмидыЮЯ 201 обрабатывают Зац ЗА эндонуклеазой и выделяют 192 Ьр и 24 Ьр фрагмент, Этифрагменты смешивают с рЯ 1 Т 12572 илирЯ 1 Т 12571 векторами, которые предвари. тельно обработаны ВааН, щелочной фосфатазой и ТН ДНК лигазой, трансформируют клетки Е.соИ К 12. Проводятскриннинг плазмид из трансформантныхколоний. Наличие ВаеН сайта на такихплазмидах подтверждает введение 192 Ьрили 24 Ьр Зац ЗА фрагмента в точной ориентации для слияния при АТО кодоне.Плаэмида рЯ 1 Т 12309 состоит из Ьр 2микронной ДНК последовательности издрожжей, клонированных в ЕсоЯ сайтеплазмидного вектора рВЯ 327, 6318 Ьр 2микронную ДНК последовательность получают иэ плазмиды рС И 9.2850 Ьр С 1 а 1 - ЯаИ фрагмент, содержащий ТО НЗ - агд и расположенные Мокупоследовательности рВЯ 322 из рЯТ 12290,клонируют в векторе рЯ 1 Т 12309 между сайтами Са а 1 и ЗаИ, Полученную плазмидурЯ 1 Т 12314 гидролизуют с ЗаИ эндонуклеазой и лигируют с 2218 Ьр Яа 1-ХЬо 1 фрагмен 10 15 рина, 4% ЯОЯ, 6 М мочевины и 10% 2-мерка птоэтанола. Пос-, е и н куб ирования в 30 течение 5 мин при 100 С образец делят по 35 40 желатиной в РВЯ. Фильтр последовательно промывают пять раз в течение 5. мин каждый . раз РВЗ, содержащим 0,1% Таееп, и одние 1 ч при комнатной температуре смесью 45 пяти моноклональных антител против СЯбелка в РВЯ 1 желатины, Другую половину пластины обрабатывают моноклональным антителом против НВзАд, Неру ТАЗ 12, в РВЯ, 1 ф желатина. Фильтровальные пла стины промывают 5 раэ в течение 5 минкаждый раэ с РВЯ, 0,1% Теини добавляют биотинированные антитела овцы к 16 мышцы в РВЗ 1 желатины в течение 1 ч при комнатной температуре, Пластины снова 20 25 том иэ УЕр 13, содержащего дрожжевой ец2 ген. Плаэмиду рЯ 1 Т 12544 получают из колоний, в которых плазмидную ДНК содержит 2218 Ьр За 1 1-ХЬо 1 фрагмент с 1 ец 2 геном, который введен в сайт ЯаИ,3328 Ьр Н 1 пб 1 И фрагмент рЯ 1 Т 12574, а также ДНК УЕр 13 клонируют на рВЯЗ 22 ЛВаеН 1 плазмиде и получают рЯ 1 Т 12608 2550 Ьр ВатН 1-Яа 1 фрагмент из рЯ 1 Т 12608, содержащий СЗ НВзАд, агд область терминации транскрипции рВЯ 322 последовательность, клонируют между Ваа Ни ЯаИ сайтами рЯ 1 Т 12544 и получают плазмиды рЯ 1 Т 12658.П р и м е р 11. Трансформируют дрожжевые (ЗассЬагогпусез сегеч 1 зае) штаммы ОС 5 и 10 Я 44 С каждой иэ плазмид рЯ 1 Т 10912, рЯ 1 Т 12573, рЯ 1 Т 12574 или рЯ 1 Т 12659, или плазмид рЯ 1 Т 12329, рЯ 1 Т 10172 и выращивают в жидкой среде с недостатком лейцина (ЧМВ или ЧИВ + 80 мкг/мл гистидина) с последующим сбором культуры в средней лог-фазе, Клетки в культуре 1 или 2 мл отбирают путем центрифугирования и суспендируют в 50 мкл 0,125 М трис-НО (рН 6,8), содержащих 20 глицеполам и обе половинки подвергают электрофореэу.через 12,5% разделяющий гель, 57 О слоистый гель согласно методу Лаемли.НВзАд и СЗ белковую последовательности идентифицирую с помощью методики иммуноокрашивания белка После нанесения белков на нитроцеллюлоэном фильтре фильтр предварительно инкубируют в течение 1 ч при 37 ОС с З,ну половину пластины обрабатывают в течепромывают РВЗ, 0.1 Твин, 5 раз в течение 5 мин каждый раз и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре с .комплексом стрептакидинбиотинсодержащей пероксидаэой хрена (НЯР), Пластиныснова промывают 3 раза по.5 мин;каждый510 15 20 ге. Отобранные фракции испытывают на присутствие НВзАд и СЯ антигенов.25 Анализ на иммуноокраску градиентных 30 40 трацией.50 Окончательно очищенный от клеточногоэкстракта 108 44 С рВ 1 Т 12574 дает один основной пик на колонке Н РЯС ТЗК(ЛКВ), который содержит антитела НВзАд и СЗ.Электрофорез на 808 полиакриламидном 55 геле с последующим окрашивэнием свребраз РВЯ, 0,1% Твин, и инкубируют с 30мкл Н 202 и НВР-содержащими 4-хлоролнафтола, 30 мг в 10 мл метанола, в 50 млРВЯ.Молекулярный вес антигенов оценивают с помощью предварительно окрашенныхбелковых маркеров, овальбумина, альфахимотрипсиногена, бета-лактоглобулина, лизоцима, цитохрома С(ВИЦ.Оба дрожжевых штамма ОС 5 и 108 44С, трансформированные с рВ 1 Т 12573,синтезируют антиген, реагирующий как санти-СЯ. так с анти-НВз Ад антителами, и ихмолекулярный вес составляет 30000 килодальтон (И), Оба дрожжевых штамма ОС 5 и108 44 С, трансформированные рВ 1 Т 12574или с рВ 1 Т 12658, синтезируют антиген,способный реагировать как с анти-СЯ, так ис анти-НВзАд антителами и молекулярный.вес белка составляет 3000 Кб,Эти результаты показывают, что гибридный белок ожидаемого молекулярноговеса, содержащий как СЯ, так и НВзАдпоследовательности, синтезируется в дрожжах,трансформированных плазмидой, содержащейСЯ кодирующую последовательность, слитую скодирующей последовательностью Рге 82 НВзАд,П р и м е р 12. Дрожжевые(ЯассЬагоаусез сегечзае) штаммы ОС 5 или10 8 44 С, соде ржа щие . ил и р В 1 Т 10172,рВТ 12329, рВТ 12573,или рВ 1 Т 12574, выращивают в селективной среде (200 мл ЧМВили ЧЙВ + 80 мкг/мл гистидина) до концалог-фазы. Клетки отбирают центрифугированием и вновь суспендируют в 10 мл 50 мМбуфера из фосфата натрия (рН 7,4), содержащего 0,5% Твин(полиоксиэти-.ленсорбитанмонолаурат), 1 ммоль РМЯ(фенилметилсульфонилфторид) и 2,5% изопропанола, Клетки разрушают путемпропускания через французский пресс при 20000. Рз (1,38 х 10 Па). Суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 30000 хд.Измеряют общую концентрацию белка 4в верхнем слое жидкости (сырой клеточныйэкстракт) использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.Наличие НВзАд определяют с помощью радиоиммунного испытания. Наличие СЗ-по-.следовательностей в ЙВзАд частицахиспытывают в Е 1 ЯА тестах, Соответствующие разбавления образцов, которые испытываются (в РВЯ, содержащем 0;2 ВЗА),позволяет проводить реакцию (в течениеночи при комнатной температуре) в твердойфазе анти-НВзАд. Связанные НВзАд частицы инкубируют в течение 1 ч при 37 С1/10000 разбавлением (в РВЗ, содержащем0,1 ВЗА) смеси пяти моноклональных антител, причем первое антитело к СЯ белку, и затем инкубируют с 1/500 разбавлениями (в РВЯ, содержащем 0,1% ВЯА) биотин содержащего анти-мышиного 9 овцы в качестве второго антитела в течение 1 ч при 37 С, Инкубируют с 1/1000 разбавлением (в . РВЯ, содержащем 0,1% ВЯА) комплекса стрептавидин-биотинсодержащей пероксидазы хрена и хромоген в течение 30 мин при 37 С. Измеряют концентрацию белков и активность в сырых клеточных экстрактах. Плазмида рВ 1 Т 12574 показывает более чем в десять раз меньшую активность.Активность АОЯВ 1 А в сырых клеточных экстрактах приведена в табл.1.Опыт Е ЯА показывает, что рВ 1 Т 12573 и рВТ 12574 кодируют НВзАд и.СЯ зпитол,1 мл сырых клеточных экстрактов смешивают с 1.5 М СзС в 50 мМ растворе фосфата натрия (рН 7,4) и центриф 1 угируют в течение 40 ч при 40000 д в ультрацентрифуфракций подтверждает результаты В 1 А/Е 1 ЯА. НВзАд и/или СЗ-последовательности обнаруживают только в тех фракциях, которые не реагируют в испытаниях Р 1 А/Е 1 1 ЯА (табл,2),НВВА 9 и СЯ эпитопы, присутствующие в антигенах, связанных с иммобилизованными анти-НВзА 9 антителами приведены в табл,2;Эти результаты указывают, что гибридный протеин, получаемый при экспрессии рВ 1 Т 12573 и рВ 1 Т 12574, объединяется в частицы, подобные 22 нм частицам НВзАд при синтезе в клетках дрожжей. П р и м е р 13. Неочищенный клеточный экстракт дрожжевого штамма 108 44 С, содержащий рВ 1 Т 12574, осветляют осаждением полиэтиленгликолем (РЕО) 400 иконцентрируют ультрацентрифугированием. Дальнейшую очистку гибридных частиц проводят СзС 1 центрифугированием, гидроксиапатитной хроматографией и гель-фильром дает одну основную полосу молекуляр ного веса 37000 М. Данные электронной микроскопии после окрашивания уранилацетатом дают примерно такие же значенияразмеров и формы частиц, что и для НВвАд, полученным из дрожжей.Серые дрожжевые экстракты получают разрушением дрожжевых клеток в присутствии равного веса 50 мМ натрийфосфатного буфера для экстракции (рН 8,1), дополненного 4 мМ Ттгр 1 ех 111, 1 Твин;4 мМ РМЯР и 10 изопропанола, Клеточные осколкиудаляют центрифугированием при 11000 д в течение 90 мин, 50 мл отцентрифугированного экстракта доводят до рН 7,2 1 н. уксусной кислотой и перемешивают в течение ночи при 4 С в присутствии 10 г коллоидной двуокиси кремния, Затем суспензию центрифугируют при 3,500 д в течение 1 ч и полученный осадок промывают. трижды 150 мл 0,15 М йаС 1, дополненного 2 мМ РМЯР и 5 мМ ЕДТА в течение 15 мин. Элюируют 250 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 9,5), содержащего 2 фТвинпри 370 С в течение 3 ч, К десорбату добавляют по каплям 1 М раствор СаС 12 до окончательной концентрации 30 мМ СаС 12 и устанавливают рН = 7. Полученный раствор оставляют на ночь при 4 С и центрифугируют при 6500 д в течение 15 мин, Надосадочную жидкость подвергают диализу (2 х 51 х 10 мМ трис-НС 1, рН 7,1) при 4 С и затем разбавляют 4 раза диализным буфером.После добавления 30 мМ СаС 12 и 1 М йаС разбавленный раствор антигена с рН 7,1 пропускают над колонкой 150 мл с фенил-сефарозой. уравновешенной тем же СаС 12(йаС 1, содержащим трис-буфер со скоростью потока 30 см/ч. Последовательно колонку промывают равновесным буфером до тех пор пока 00280 нм (оптическая плотность) не снижается до О, и элюируют с той же самой скоростью потока 6 М мочевины в 10 мМ трис-НС рН 9,В другом варианте деалиэованный и разбавленный в четыре раза раствор анти- гена дополняют 20 МНдп Я 04 (рН 7) и пропускают над 150 мл колонкой с фенилсефарозой, уравновешенной в 10 мМ трисНС 1, рН 7,1 20 (ИН 4)2 Я 04 со скоростью потока 30 см/ч, После промывания колонки уравновешивающим буфером колонку элюируют с той же самой скоростью потока 10 мМ трис-НС 1 рН 7,1,Собирают антигенположительные фракции и в заключение центрифугируют с одним или двумя подходящими СзС градиентами плотности при 4 С и 245000 д в течение 65 ч. Очищенные гибридные СЯ-НВвАд частицы имеют плавучую плотность 1,23 г/см .П р и м е р 14, Гибридные частицы, выделенные из Я.зегечзае штамма 10 Я 44 С рр 12574, инокулируют лабораторным20 25 зированные животные служат в качестве контроля,Для определения реакции антител сыворотку, полученную от мышей, собирают для каждой группы, тогда как выворотку от морских свинок и кроликов анализируют индивидуально, Анти-СЯ-антитела тритры измеряют анализом Е 11 ЯА, используя рекомбинантный СЯ протеин й 32 тет 32 в качестве антигена. Анти-Н ВзАд титры опреде 30 ляют, используя.АОЯ АВ набор и ЮНО для сравнения Ни у морских свинок, ни у мышей не вырабатываются антитела к НВзАд, несмотря на повторные иньекции. Напротив, оба 35 вида животных вырабатывают анти-СЯ антитела, и это усиливается при повторах. Поглощение 1,0 .в анализе Е 1.1 ЯА достигают при сывороточных разбавлениях в 1600 раз (мыши) и 9000 раз (морские свинки). Иммуногенность гибридных частиц не воэрастатет при адсорбции на гидроокиси алюминия,Кролики вырабатывают антитела, как к СЯ, так и к НВзАд. Обратные титры при 40 поглощении 1,0 в анти-СЯЕ 1.1 ЯА анализе дают значения между 800 и 3200 мо/1 мл Анти-НВзАд титры, полученные для гибридных частиц, адсорбированных на гидроокиси алюминия, находятся между 4000 и 20000 45 мо 1/мл, тогда как для кроликов, иммунизи 50 рованных Нерта Чах, титры имеют значенияот 10 до 10 мц 1/мл. Адсорбирование гибридных частиц на алюминийгидроксиде повышает иммунную реакцию (табл.3). 55 СЯР реакционная способность и процент ингибирования вторжения спорозоитов1 Я 1) Нер 62-А 16 гептомы клеток дана в табл.3.П р и м е р 15. Вакцину получают следующим образом. К буферированному водноживотным в чистом виде или с адъювантом алюминий гидроксидом.Мышей штамма С 57 В 1/6 (6-8 недель),морских свинок и кроликов иммунизуют 5 подкожно и внутрибрюшинно в 1, 21 и 49дни, Кровь отбирают на 7, 28, 56 и 84 день.Кровь. оставляют до свертывания при 4 С в течение ночи, а полученную сыворотку выделяют и хранят при -70 С до применения.10 Кролики (2 группы по 2 кролика в каждой) получают 10 мкг гибридного СЯ - НВвАд протеина в дозах по 1,0 мл с добавлением или без добавления гидроокиси алюминия при каждой иммунизации. В качестве конт роля 2 к)оликов иммунизируют 10 мкг Нерата Чах ВМыши и морские свинки в руппах по 5 животных получают по 1 и 5 мкг гибридного протеина соответственно, в дозах по 0,5 мл при каждой иммунизации, Неиммуниму раствору 3-ной гидроокиси алюминия (10 мМ раствор фосфата, 150 мМ ЙаС 1, рН 6,8. стерилизовано фильтрованием) добавляют полученные частицы в аналогичном буфере при перемешивании до конечной концентрации 100 мкг/мг полипептида и 0,5 мг/мл алюминия (А ), рН поддерживаютз6,8, Смесь оставляют на ночь при температуре около 0 С. Добавляют ТЫтегзо 1 до конечной концентрации 0,005, Проверяют и устанавливают рН при 6,8. П р и м е р 1.6, Плазмиду рй 1 Т 12290 модифицируют введением ВавН 1-Есой синтетического адапторного фрагмента, кодирующего Й-терминальные аминокислоты рге Я 2 участка между ТОНЗ промоторными АРОЗ терминаторными фрагментами.Плазмиду рйТ 12290 расщепляют В а в Н 1 и Есой 1 ферментами и дефосфорилируют щелочной фосфатазой. 20 пмоль фосфорилированного синтетического адаптера:О и ТгрВащН 15 ОАТС САО ТОО 3 ЕсоЮ3 ОТС АССТТАА 5 связывают с 0,1 пмоль ВавН 1-Есой фрагментом дефосфорилированной плаэмиды рй 1 Т 12290, используя 1 ед. (о) Т 4 лигазы, и используют для трансформации Е,соИ штамма ММ 294. Один трансформант, содержащий целевую плазмиду с синтетическим адаптором, включенным между ВаглН и Есой сайтами, идентифицируют.30 пмоль (120 мкг) рй Т 12621 ДНК обрабатывают 1200 ВатН 1, После удаления рестрикционного фермента экстракцией фенолом плазмиду осаждают этанолом и ресуспендируют в соответствующем буфере для обработки ВааН 1 нити и 280 ед. (О) нуклеазы фасоли золотистой. Нуклеазу удаляют фенольной экстракцией с последующим осаждением этанолом. Обработанную таким образом плазмиду повторно суспендируют в буфере для лигирования и рециркулируют 10 ед, Т 4 лигазы.Препарат, содержащий сшитую ДНК, обрабатывают фенолом, осаждают этанолом, ресуспендируют в соответствукпщий буфер и расщепляют Есой ферментом, После удаления Есой 1 сайта, 0,05 пмоль (0,2 мкг) ДНК суспендируют в буфере (для лигирования с 0,4 пмоль (0,2 мкг) Есой 1 фрагмента размером 838 п.овыделенного из рй 1 Т 12581, который содержит полный О- терминальный кодирующий участок рае 82- .Я протеина. Вектор рОС 9 расщепляют Есой 1 эндонуклеазой и обрабатывают щелочной фосфатаэой, Плазмиду рйТ 10616 (АТСС 39131) расщепляют Есой 0 ве Асс рестрикционными эндонуклеазэми и 826 Есой 1-Ассфрагмент, содержащий часть рег32-Я выделяют с помощью препаративногоакриламидного гель-электрофореза и электроэлюирования. Около 0,4 пмоль (0,2 мкг)5 этого фрагмента смешивают с примерно 10пмоль следующего синтетического адаптора:Туг Ие Вор5 АТАСАТТТААО 310 АСС Есой 13 ТОТААТТОСТТАА 5и полученную смесь обрабатывают Т 4 ДНКлигазой и расщепляют Есой рестрикционной эндонуклеазой, К обработанной таким15 образом смеси добавляют около вектора рОС 90,2 мкг ЕсоЮ эндонуклеазы и щелочнойфосфатазы и полученную смесь обрабатывают Т 4 ДНК лигазой и используют длятрансформации компетентных клеток Е.соИ20 К 12, устойчивых к ампициллину,Колонии исследуют на присутствиеплазмиды, содержащей фрагмент 2650 ЬррОС 9 вектора с Есой 1 фрагментом 838 ЬрЕсой, содержащим 826 Ьр Есой 1-Асс рге25 32 - Я фрагмент, вместе с 12 Ьр Асс - Есойсинтетическим линкером. Правильностьконструкции проверяют путем определенияпоследовательности ДН К.Смесь, содержащую плазмиду ДНК30 рй 1 Т 12621 и 838 Ьр Есой фрагментрйТ 12581, используют для трансформацииЕ.соИ штамма. ММ 294, Трансформант, содержащий плазмиду с Есой фрагментом вправильной ориентации, идентифицируют35 как рй 1 Т 12662.П р и м е р 17. ДН К плазмиды рЮТ 12309расщепляют ЗаИ эндонуклеазой и лигируютс 2218 Ьр ХЬо 1-ЗаИ фрагментом ДНК с .ЕО2 геном. Лигированную смесь используют40 для трансформации клеток Е.со 11 К 12 штаммаА 221.Идентифицируют плазмиду рй 1 Т 12377из колонии трансформатов. Эта плазмидасодержит 2218 Ьр 0 ЕО 2 ХЬо 1-ЯаИ фрагмент,45 встроенный по ЗаИ сайту рй 1 Т 12309,Н 1 пб 1 И фрагмент размером 3050 пэроснований из рй 1 Т 12662 кодирующий рге82-3 белок, очищают электрофорезом наэкриламидном геле, обрабатывают Т 4 пол 50 имеразой и лигируют с рЮТ 12377; предвэ.рительно обработанной Ваа Н ферментоми вновь сшитой Т 4 полимеразой. Этот препарат используют для трансформацииштамма Е,соИ ММ 294, устойчивого к эмпи 55 циллину,Плазмиду рй 1 Т 12660 используют длятрансформации двух штаммов З.сегэч 1 аэе,т,е, штаммэДС 5 сг и штамма 10344 Ссгф,П р и и е р 18. Участок рге 32 плазмидырйТ 12662 ееквенкируют, при этом обнэру