Способ получения -интерферона лошади

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 17011 09 5 С 12 К 15/23 К ПАТЕНТУ йм Интернационал н, Адольф Химмле8,8) НИЯ у-ИНТЕРФЕРОГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР НИЕ ИЗОБ(72) Руцольф ХауптмаПетер Светлы (АТ)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНА ЛОШАДИ Изобретение относится к способу получения интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у,Способ получения у-интерферона лошади заключается в.том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Яаи ЗА, полученные фрагменты длиной 10 - 20 т.п.н, отделяют, дефосфорилируют, клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной геномной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученнь 1 ми рекомбинантными ДНК трансформируют штамм Е,соИ с последующим выделением и очисткой целевого продукта,П р и м е р. Стадия 1. Выделение лошадиной ДНК,Замороженную печень лошади размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение Зч при 55 С инкубируют в 0,5 М(57) Изобретение относится к способу получения нового интерферона, в частности к способу получения лошадиного интерферона типа у. Способ получения у-интерферона лошади заключается в том, что из печени лошади выделяют высокомолекулярную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Яац ЗА, полученнь 1 е фрагменты длиной 1020 т.п.н. отделяют, дефосфорилируют. клонируют в лямбда-векторе и выделяют ген интерферона из полученной библиотеки ДН К, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штаммы Е. со 1 с последующивыделением и очисткой целевого продукта. этилендиаминотетрауксусной кислоте (ЭДТУК), 10 мМ трис-НС, рН 8,0, 0,50 додецилсульфата натрия (ДСН) и 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани), Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем однократной экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25;24;1 по обьему), диализуют в растворе 50 ммоль трис-НС, рН 8,0, 10 ммоль ЭДТУК, 10 ммоль хлористого натрия и ДНК осаждают двумя объемами этанола, После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере(10 ммоль трис-НС 1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТУК) при 4 С, центрифугируют в растворе хлористого цезия 1,273 г/мл при 40000 об/мин в течение 62 ч при 20 С, фракции, содержащие ДНК, диализуют в ТЕ-буфере, ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают 70-ным этанолом, высушивают и снова растворяют в ТЕ-буфере при 4 С.Полученный препара ДНК свободен от РНК и имеет длину более 50 т,п,н. (определено путем электрофореза на 0,45%-ном агарозном геле),- Стадия 2, Частичное переваривание эндонуклеазой и фракционирование по величине лошадиной ДНК,50 мкг лошадиной ДНК вместе с 1,6 ед, Яао ЗА инкубируют при 37 ОС в 450 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-НС, рН 7.5, 10 ммоль хлористого магния, 1 ммоль дитиотреитола). Через 15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл аликвотной части и смешивают с 15 ммоль ЭДТУК и прогревают в течение 10 мин при 70 С для остановки реакции. После добавления 0,3 моль ацетата натрия, рН 6,0, ДНК осаждают с помощью 2,5 объема этанола, После повторного растворения в ТЕ-буфере ДНК разделяют по величине в ТВЕ-буфере (10,8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли ЭДТУК) путем электрофореза при 1 В/см на 0,45 о-ном агарозном геле в течение ночи, ДНК расщепляют рестриктазами Есой 1 и Нпс 111 и выделяют фрагменты Д Н К длиной 10 - 23 т.и. н, путем зле ктроэл юации при 300 В в течение 3 ч (буфер 5 0,1 х ТВЕ), очищают на колонке марки "Элютип Д" и затем осаждают зтанолом,ДНК дефосфорилирусот, Для этого ДНК вместе с 5 ед. кишечной бычьей фосфатазы инкубируют в течение ЗО мин при 37 ОС в 140 мкл реакционной среды (50 ммоль трис-НС, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магния, 0,1 ммоль ацетата цинка, 1 ммоль спермидина), добавляют 5 ед, фермента и инкубируют в течение ЗО мин. После добавления ЭДТУК до конечной концентрации 25 ммоль ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24;1 по объему) и трехкратно простым диэтиловым спиртом, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 х ТЕ-буфере,Стадия 3, Получение библиотеки лошадиной геномной ДНК,Дефосфорилированные длиной 10 - 23 т.п.н. фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, например лямбда- ЕМВ 3 или ЕМВ ЗА, с выступающими С-Л-Т-С-концами путем удаления внутреннего Васп Н 1-фрагмента фаговой ДНК.Вектор выращивают в штамме Е,со с супрессорным фактором ЯирГ., например Е.со ИМ 526, 538 или 539, вВ-бульоне с 5 ммоль сульфата магния, осаждают полиэтиленгликолем и очищают путем двукратного центрифугирования при 45000 об/мин и 20 С в течение 40 ч с использованием хло 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 рида цезия в качестве градиента плотности (0,71 г/мл раствора), После диализа в ТЕ-буфере фаговую ДНК освобождают от белка путем двукратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по обьему) и двукратной экстракции смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24;1 по объему), затем концентрируют путем осаждения этанолом,Для получения концевых фрагментов ЕМВ ЗА 50 мкг фаговой ДНК полностью переваривают с помощью Вагп Н 1 втечение 2 ч пои 37 С в 45 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-НС, рН 7,5, 10 ммоль хлорида магния, 1 ммоль дитиотреитола), после чего реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК на 10 мин при 70 С. ДНК осаждасот этанолом,Во избежание повторного лигирования средний фрагмент режут с помощью ЕсоВ 1 и отделяемый при этом олигонуклеотид удаляют путем осаждения изопропанолом,Полученную ДНК полностью переваривают с помощью Есой 1 в течение 2 ч при 37 С в 450 мкл 10 ммоль трис-НО, рН 7,5, 100 ммоль хлористого натрия, 1 О ммоль хлористого магния и реакцию прекращают путем добавления 15 ммоль ЭДТУК и 10-минутного прогревания при 70 С, После добавления ацетата натрия до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента ДН К осажда ют с помощью О, б объема изопропанола в течение 15 мин при 0"С, промывают 2 раза 0,45 М ацетата натрия (0,6 объема изопропанола) и однократно с помощью 0,3 М ацетата натрия (2,5 объема этанола) и растворяют в 15 мкл 0,1 х ТЕ-буфере. При этом линкеры Вастс Н 1/Есой 1 осаждаются в растворе.Фрагменты ЕМВ ЗА(8 мкг) объединяют примерно с 5 мкг лошадиной ДНК длиной 10 - 23 т,п,н, и 10 ед, Т 4 - ДНК-лисазы и инкубируют в течение ночи при 14 С и один день при 4 С в 50 мкл среды лигирования (бб ммоль трис-НС, рН 7,2, 0,1 М хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ трифосфата аденозина - АТФ). Лигированную смесь ДНК упаковывают в зрелые лямбда-фаговые частицы.Компоненты этой системы, т,е, ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживания - размораживания (ЛЗР), буферы М 1 и А приготавливают известным образом. 10 мкл аликвотной части смеси лигированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин вместе с 25 мкл УЭ, который так же, как и ЛЗР размораживают ао льду в течение ЗО мин, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инку 1701114бируют далее в тецение 60 мин при комнатной температуре, Полученну.о смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трис-НС, рН 7,5, 10 мМ сульфата магния, 1 мМ ЭДТУК) л хранят при 4 С.Стадия 4. Клонирование и анализ последовательностей гена для лошадиного интерферана типа гамма.Выделение клона полношго гена для лошадиного интерферона типа гамма,Бактериальную культуру, растущую в течение ночи вВ-питательном растворе (10 г/л хлористого натрия, рН 7,4), содержащем 0,2 % мальтозы, доводят до оптической плотности 2,0 (при 600 нм), По 0,5 мл этой суспензии инфицируют 50000 ед, лямбдафагов библиотекл ДНК и с помощью слоя мягкого агара распределяют поВ-агаровым пластинкам, содержащим 10 мМ сульфата магния, Пластинки имеют диаметр 13,5 см. Скринингу подвергаст всего 1,5 х 10 рекомбинантных лямбда-фагов. После инкубации в течение ночи при 37 ОС фаги каждой пластинки используют для приготовления двукратных репликонов на нитроцеллюлозе. После денатурации фаговой ДНК (1 мин 0,5 н,гидроокиси натрия, 1,5 М хлористого натрия), нейтрализации (2 раза в течение 3 мин в 0,5 М трис-НС, рН 7,5, 1,5 М хлористого натрия) и промывки (1 мин в буферах 2 хЯБС, 1 хЯЯС, 0,15 М хлористого натрия, 15 мМ цитрата натрия) фильтры сушат на воздухе, ДНК фиксируют при 80 С в течение 2 ч, Фильтры промывают при 65"С в течение ночи в растворе 1,5 М хлористого натрия, 10 мМ трис-НС, рН 8,0,0,1% ДСН., псдверга 1 от предварительной гибридизации при 65 С в течение 4 - 6 ч раствор для гибридизации;0,9 М хлористого натрия, 50 мМ гидрсгенфосфата натрия, рН 7,4, 5 мМ ЭДТУК, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1 % альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 0,1% ДСН, 20 мг/мл ДН К спермы лосося, подвергнутой ультразвуковой обработке и денатурации),10 Гибридизацию осуществляют в свежем растворе с использованием 10 сргп набфильтр с радиоактивно маркированной пробой человеческого гамма интерферона при 65 С в течение 20 ч, Фильтры промывают при 65 С в буфере Зх 55 С, 0,1% ДСН, сушат и подвергают ауторадиографии, После трехкратной очистки пятен идентифицируют пять лямбда-клонов, которые прсявлягст положительные сигналы гибридизации. Из этих выделившихся рекомбинантных фагов ДН К очищают известными приемами, После переваривания различными рестрик 15 20 25 30 35 45 50 55 ционными энэимами и последующего анализа по Саузерну фаговые ДНК характеризуют путем гибридизации пробой человеческого гамма-интерферона, Выделяют единственный гибридизирующийсяВа пН-фрагмент длиной 4,6 т п,н, клона ламодд Ец - )2, который клонируют в месторазреза Вагп Н 1 известной плазмидойр.1 С 9.После трансформации Е.со .М 101 изполученных колоний по способу приготовлены мини-препаратов получают плазмидную ДНК, которую характеризуют путем переваривания рестрикционными энзимами, Плазмиду с желаемой вставкой Ваго Н 1 обозначаст как рАН 111, После введения в известные векторы М Змр 8 или М 13 мр 9 Вап 1 Н 1-вставки плазмиды рАН 111 подвергают анализу последовательностсй по дидезокси-методу, Сравнение последовательностей с геном человеческогс интерферона типа гамма показывает большуо гомологию с некодирующими 5 - и 3 -областями. По этимрезультатам заключают, что выделен полный ген лошадиного гамма интерферона,Анализ последовательностей гена лошадиного интерферона типа гамма, выделенного из клона лямбда Ес.Ващ Н 1 - вставкудлиной 4,6 т,п,н. плазмиды рАН 111 подвергают полному анализу последовательностей. Общую последовательность фрагмента Вагп Н 1 определяют путем сочетания частичных последсватель - ностей субклонов М 13, которые получают путем направленного клонирования рестрикционных фрагментов (Ессй 1. Нпс 111, Рз 11, Рзт 1 - В 911, Нпг 111 - Вап Н 1) в соответственно разрезанные векторы М 13 мр 8 или М 13 мр 9, Дальнейшие частичные последовательности получают эа счет клонирования фрагмента Вап 1 Н 1 - В 9 11 длиной 2,0 т.п,н, или фрагмента Рзт 1 длиной 2,0 т.п,н, в вектор М 13 мрЯ, Оба фрагмента ДНК разделяют на меньшие куски путем ультразвуковой обработки, концы ДНК делают тупыми путем инкубации ДНК-полимераэой 1 из Е.со (фрагмент Кленова) в присутствии всех четырех дезсксинуклеотидтрифссфатсв, каждый из которых применяют в количестве 0,1 мМ (реакциснньиЛ буфер; 50 мМ трис-НС, рН 7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 1 ч, 25 С). После фракционирсвания в агарозном геле ДНК-фрагменты длиной примерно 0,4 - 1,0 т.п.н, выделяст и лигируют в место разреза Ягпа 1 вектора М 13 мр 8, Полученные последовательности обьединя 1701114ют с помощью компьютерной программы с получением общей последовательности длиной 4664 пар оснований.После анализа с использованием компьютера открытых рамок чтения и сравне ния с генами интерферона типа гамма другого происхождения определяют кодирующую область гена гамма-интерферона лошади. Кодирующая область включает три интрона, причем первый кодирует гидро фобный сигнальный пептид длиной 20 аминокислот и 18 аминокислот полипептида зрелого лошадиного интерферона типа гамма (основания 366 - 479). Второй эквон кодирует аминокислоты 19 - 41 (основания 15.1639 - 1707), третий экзон - аминокислоты 42 - 102 (основания 1803 - 1985), а четвертый экзон - карбоксиконец с аминокислотами 103 - 146 (основания 3307 - 3441). В положениях 4010 и 4020 находятся две сигнальные 20 последовательности (ААТААА) для полиаденилирования м Р Н К. В положениях 86 - 88 полипептида для зрелого лошадиного гамма-интерферона находится единственное, возможное место й-гликоэилирования 25 (АвИ-Яег-Бег), которое совпадает с вторым местом Й-гликозилирования (Азпу-Бег) бычьего интерферона типа гамма. Неожидаемым образом полипептид для зрелого лошадиного гамма-интерферона содержит 30 только один единственный цистеиновый остаток в положении 3, причем аналогично природным, человеческим и мышиным гамма;интерферонам первые три аминоконцевые аминокислоты (в этом случае 35 Туг-Туг-Суз) по всей поверхности протеолитически отщепляются в теле.СТадия 5, Получение синтетического гена для зрелого лошадиного интерферона типа гамма, 40Синтетический ген для зрелого лошадиного гамма интерферона конструируют в виде двух вариантов с использованием 16 различных олигонуклеотидов, Первый вари. ант кодирует зрелый интерферон с 146 амийокислотами плюс стартовый метионин, авторой вариант - на концевой аминогруппе укороченный на 3 аминокислоты (Туг-ТугСуг) полипептид плюс сартовый метионин, как в организме,Синтез гена гамма-интерферона лошади осуществляют в две стадии, На первой стадии осуществляют конструкцию первой части гена с использованием восьми олигонуклеотидов Е 6-1 - Е 6-8 до места разрезаЯа 1, а на второй стадии - конструкцию второй половины гена с использованием шести олигонуклеотидов Е 6-9 - Е 6-14, размещенных от места разреза Яа 1 до места разреза Вагп Н 1, Для конструкции укороченного на три аминокислоты на концевой аминогруппе варианта лошадиного гаммаинтерферона используют олигонуклеотиды Е 6-15 и Е 6-16 вместо олигонуклеотидов Е 6- 1 и Е 6-2. Комплементарные олигонуклеотиды парами подвергают фосфорилированию на 5-конце. По 100 пмоль обоих олигонуклеотидов (например, Е 6-3 и Е 6-4, Е 6-5 и Е 6-6 и т,д,) инкубируют 10 ед. Т 4-полинуклеотидной киназы при 37 С в течение 10 мин в 9 мкл реакционного буфера (70 мМ трис-НС, рН 7,6., 10 мМ хлористого магния, 5 мМ дитиотреитола), 2 мкКч (Р) АТФ. Затем добавляют 1 мкл раствора 10 мМ АТФ и инкубируют при 37 С в течение 50 мин, Реакцию прекращают путем 10-минутного нагрева до 95 С, В целях предотвращения последующего связывания концов ДН К олигонуклеотиды Е 6-1, Е 6-15, Е 6-9 и Е 6-14 не фосфорилируют, После инактивации полинуклеотидкиназы их смешивают с соответствующим комплементарным олигонулеотидом, нагревают до 95 С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной температуры, Смеси олигонуклеотидов ЕО+ ЕО(или Е 6-15 и Е 6-16), Е 6-3+ Е 6-4, Е 6-5+ ЕОи Е 6-7+ Е 6-8 обьединяют, смешивают с 1 мкл 5 М хлористого натрия, нагревают до 70 С в теченине 5 мин и охлаждают до комнатной температуры. К раствору добавляют 5 мкл 10 мМ АТФ, 2 мкл дитиотреитола, 1,5 мкл 10 х буфера лигирования (0,66 М трис-НО, рН 7,2, 1 М хлористый натрий, 100 мМ хлористого магния, 10 мМ ЭДТУК, 50 мМ дитиотреитола) и 80 ед. Т 4 ДНК-лигазы и инкубируют при 4 С в течение 48 ч, За ходом реакции лигирования наблюдают путем разделения электрофорезом в 5 О-ном полиакриламидном геле фрагментов ДНК небольшой части реакционной среды и последующей ауторадиографии. Аналогично связывают один с другим шесть олигонуклеотидов Е 6-9 до Е 6-14, Реакцию прекращают экстракцией фенолом и хлороформом, ДН К выделяют осаждением этанолом,Стадия 6. Введение синтетического гена в плазмиду рйН,10 мкг плазмиды рВНрасщепляют рестриктазой Зас 1 в 100 мкл реакционного буфера и этим инактивируют путем 10-минутного нагрева до 70 С. ДНК обрабатывают фрагментом Кленова при 25 С в течение 30 мин в присутствии всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, каждый из которых берут в количестве 10 мкМ, Реакцию прекращают зкстракцией смесью фенола с хлороформом, ДНК концентрируют осаждением этанолом, В результате этой обработки за триптофановым промотором образуется ту50 55 пой конец ДНК, который заканчивается трансляционным стартовым кодоном АТО, Линеаризированную плазмидную ДНК расщепляют рестриктазой ВащН 1 и векторную часть выделяют электрофорезом в агарозном геле.50 нг подготовленного таким образом плазмидного вектора рЙНсмешивают с 20 пмоль лигированных олигонуклеотидов Ебдо Еби Ебдо ЕОи в 10 кмл буфера лигирования (66 мМ трис-НС 1, рН 7,2, 100 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ЗДТУК, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ) инкубируют 1 ед. Т 4-ДНК-лигазы при 14 С в течение 24 ч. Обработанные кальцием клетки Е,со 11 Ытрансформируют этой лигазной смесью и инкубируют при 37 С в течение ночи. Иэ полученных трансформатов выделяют плазмидную ДНК, структуру которой определяют рестрикционным анализом и анализом последовательностей вставки Н 1 пс 111-Вап) Н 1, Плазмиду желаемой структуры для экспрессии зрелого лошадиного интерферона типа гамма обозначают как рЕоО-УУС 1, Аналогич и ы м образом ол и гон уклеотиды ЕО, ЕО, Ебдо ЕОи ЕОдо ЕОклонируют в вектор рВНс тем, чтобы получить укороченный на три аминокислоты лошадиный интерферон типа гамма. Плазмиду желаемой структуры обозначают как рЕс 1 О-ОАА 1.Стадия 7. Экспрессия интерфероновой активности штаммом Е.со 1 НВ 101, содержащим плазмиду рЕс 1-УУС 1 или рЕобОАА 1,100 мл бактериальной культуры инкубируют при 37 С и при интенсивном встряхивании в следующей, не содержащей триптофана в среде (данные на литр среды): 10 г фосфата аммония, 3,5 г гидрогенфосфата калия, рН 7,3 с помощью гидроокиси натрия, 0,5 г хлористого натрия, 21 г Сав-аминокислот (подвергнутых кислотному гидролизу), 11 г глюкозы, 1 мМ сульфата магния, 0,1 мМ хлорида кальция, 1 мМ тиамина НС 1, 20 мг 1:цистеина, 20 мг 3-Р- индолакриловой кислоты. Кроме того, среда может содержать еще 50 - 100 мг ампициллина. После инкубации среду центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин, осадок суспендируют в охлажденном буфере (50 мМ трио-НС 1, рН 8,0, 30 мМ хлорида натрия), взятом в количестве 1/10. Клетки дважды в течение 30 с разрушают ультразвуком (при 20 кГц, 100 Вт). Остатки разрушенных клеток удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при 4 С и после стерилизующей фильтрации надосадочную жидкость проверяют на интерференовую 5 10 11 20 5 30 35 40 45 активность путем определения цитопатического эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита(ВЭМ).Тест-система: клетки КВ 1-6 (АТСС СС57, клетки лошадиного эпидермиса)/ВВС:А 549 (АТСС СС 185, клеточная линияопухоли легких человека)/ВЗМ.Титр на клетках А 549 нормируют на международные единицы с помощью стандартачеловеческого интерферона. Штамм Е,со 1СЯВ 603 трансформируют плазмидами, бактерии селекционируют нг содержащих ампициллин агаровых плитках. Дляприготовления макси-клеток и маркировкипротеинов клетки выращивают при 37 С дооптической плотности 0,5 при 600 нм в 15 млсреды (см. стадию 7) без индолакриловойкислоты и 10 мл этой культуры в качающейсячашке Петри, облучают в течение 5 с с помощью установленной на расстоянии 50 смот чашки лампой (15 Вт), после чего и кубируют при 37 С в течение 1 ч. Культуры смешивают с 100 мкг/мл О-циклосерина,инкубируют при 37 С в течение 14 ч, бактерии отделяют путем центрифугирования.Клетки дважды промывают 5 мл солевогораствора Хершей, в 5 мл среды Хершей суспендируют 20 мкг/мл индоакриловой кислоты и инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Ккаждой культуре добавляют 5 мкКи/мл Яметионина (1000 С 1/ммоль) и встряхиваютпри 37 С в течение 1 ч. Клеткл отделяют,лизуют в буфере для электрофореза, содержащем ДСН и 2-меркаптоэтанол, и протеины разделяют в 15;-номполиакриламидном геле.Состав солевсго раствора Хершей (на 1л);КаС 5-4 гКС 3,0 гМН 4 С 1 ф 1 гСаС 2 2 Н 20 15 мгМ 9 С 2 6 Н 20 0,2 гРеС 1 з 6 Н 20 0,2 мгКН 2 РО 87 мгТрио-Н С 1 12,1 грН 7,4,Состав среды Хершей (на 100 мл солевого раствора Хершей):2 мл 20 Я, глюкозы0,5 мл 2;4 треонина1,0 мл 1 лейцина1,0 мл 2;4 пролина1,0 мл 2; аргинина0,1 мл 0,14 тиаминаАуторадиографию высушенного геляосуществляют 2 дня при -80 С на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки, В качестве стандарта-СОАТОААТТСОАОСТСАТАТТАААССТССТТАССОТСТСОАОС-З,По 100 пмоль олигонуклеотидов Тгр-15 Тгрраздельно фосфорилируют в 10 мклреакционного раствора. Тгри -2, Тгри -4и Тгри -6 подвергают гибридизации путемкипячения и медленного охлаждения, Растворы пар олигонуклеотидов соединяют и20 добавлением Т 4-ДКА лигазы, 3 мкг рАЕ 153режут с помощью ЕсоВ 1 и Оа 1, После очистки большого фрагмента к нему прибавляют приблизительно 20 пмольолигонуклеотидов и лигируют, Затем ДНК25 трансформируют в Е,соИ НБ 101 и плазмидыиз полученных колоний выделяют. Фрагмент Ры-Н 1 пб 111, содержащий промотор,подвергают анализу последовательностей,После подтверждения желаемой последова 30 тельности выбирают плазмиду и обозначают как рВН 281/5.Последовательность промоторной части следующая. -355 - ОААТТОАСОСТОАТСО СТААААСАТТОТ35 ОСАААААОАОООТТОАСАТТОС3 -СТТАА СТО СОА СТАО СОАТТТТОТААСАХЬо 1 40 -10 ТгапзЕгрбопззсагтСТТСОСОААССАОТТААСТАОТАСАСААО-ТТСАСООСТСОАОАСООТААОААО СО СТТООТСААТТОАТСАТОТОТТСА-АОТО ССОАО СТСТО С САТТС 45 ВВЯ Яы 1 ЕсоВ 1 Са 1ОАООТТТААТАТЙАО СТСОААТТСАТСОАТ - З молекулярного веса применяют смесьСметилированных протеинов. В качествеконтроля применяют плазмиду рЕВ 103, которая содержит только промотор без генаинтерферона, и плазмиду рЕВ 21/1, котораясодержит две копии гена человеческого интерферона типа Альфа 2 аго.Стадия 8, Доказательство наличия гомологичных последовательностей в лошадином геноме с геном ЕцИФ-у.30 мкг высокомолекулярной лошадинойДНК (см. стадию 1) полностью переваривают с помощью 60 ед. соответствующего рестракционного фермента в 200 мклреакционного объема и каждый раз 10 мкгэтой разрезанной ДНК разделяют по величине в 0,8 О/о-ном агарозном геле, После переноса на нитроцеллюлозные фильтра,денатурации и фиксации ДНК каждыйфильтр гибридизуют 17 ч при 65 С, бхбуферБЯС, 5 х раствор Денхардта, 0,1% ДСН, 20мкг/мл денатурированной ДНК из спермылосося в присутствии примерно бх 10 сргпрадиоактивно маркированной пробы,В качестве пробы для ЕцИФ-у применяют фрагмент из плазмиды рЕоО-УУС 1, который содержит последовательность,кодирующую весь зрелый интерферон. Затем фильтры промывают 4 раза в течение 45мин при 65 С с помощлью 0,3 хЯЯС/45 мМхлрида натрия, 4,5 мМ цитрата натрия, 0,10ДСН, Ауторадиографию осуществляют нарентгеновской пленке с использованиемусиливающей пленки при -80 С в течение 7дней.Стадия 9, Экспрессия лошадиного интерферона типа (ОАА) в Е,соИ НВ 101/рЕООАА 2 и НВ 101/рЕоО-ОААЗ.Для достижения улучшенной экспрессии использу 1 от улучшенные экспоессионные векторы и улучшенное месторибосомального связывания.Улучшенные экспрессионные векторыоснованы на промоторе игр из Яеггабагпагсезсепз (Ягпа), который в области -35путем замены основания (рВН 281) приравнен к консенсусной области -35, или на гибридном промоторе игр, который имеетпервую богатую А/Т область Е.соИ (Есо)или вторую богатую А/Т область плюс промотор Згпа (рВН 282), В качестве места рибосомального связывания используютэнтеротоксин И из Е.соИ.рВН 281/5.Известным образом синтезируют следующие олигонуклеотидьпТгр: 5 -ААТТОАСО СТО - 3;Тгр,-АТСО СТААААСАТТОТО САААААОАОООТТСТССАААТТАТАСТСОАО СТТААОТАОСТАПреимуществами нового экспрессионного вектора являются оптимальная область - 35 в промоторе гр-Ягпа; единственное место ХЬо 1 перед местом рибосомального связывания (МРС), что допускает замену МРС на другое; экспрессионная плазмида содержит трансляционный старт АТО на расстоянии 5 нуклеотидов от МРС; 6 этого АТО является первым основанием последовательности опознавания Ям 1 (ОАОСТС), Путем разреза с помщью Язт 1 и последующего получения прямого конца получаютэкспрессионный вектор с трансляционымстартом АТО, с которым можно лигироватьчужой ген, начиная с первого основаниярамки считывания; связь МРС-АТО не содержит ни 6 ни С; выбором последовательности олигонуклеотидов на 5-концеразрушается первоначальное место разреза ЕсоВ 1, благодаря чему на 3-конце промотора можно получать местомультиклонирования, состоящее из Язс 1,ЕсоВ 1, Са 1 и Нпб 111 (уже в рАТ 153).р В Н 282/5.Аналогичным образом конструируютэкспрессионный вектор рВН/5, Олигонуклеотиды Тгри Тгрзаменяют олигонуклеотидами Тгри Тг)-8:Тгр; 5 ААТТО С С СОТТ СТООАТААТОТТТТТТО СОССОАСАТСАТСАТО СТ-З,Тгр: 5 --ТТАО СОАТСАО САТОАТОАТОТСТСОО СО СААААААСАТТАТССАОААСОООС - 3 .Последовательность промоторной части в рВН 282/5 следующая;5-- СО СТААААСАТТОТО САААААОАОООТТОАСАТТОССТТСО СОААССАОТОСОАТТТТОТААСАСОТТТТТСТСССААСТ".ССАТТССТССАААТТАТАСТЯз 1 ЕсоВ Са6 СТСОААТТСАТСОАТ СВАО СТТААСТАО СТА 1 мкг рОС 18 разрезают с помощью ВавЙ 1 и Яа 1.Из 10 мкг ЕцОСАА 1 путем разрезас помощью Ваш Н 1 и Яэ 1 выделяют идефосфорилируют вторую половину гена лошадиного интерферона типау, 20 нг векторалигируют с 100 нг вставки и ДНК трансформируют в Е.со,ЗМ 101. Плазмиду одной колонии анализируют путем перевариваниярестрикционными энзимами и обозначаюткак рСМ 1,р СИЗ.Первую половину синтетического гена вместе с местом рибосомального связывания конструируют иэ олигонуклеотидов: Ецб: 5- АО СТТСССТСОАОАООТТОАООТОАТТТАТ ОСАОО СТО СТТТСТТТАААОАААТСОААААССТОАААОААТАСТТСААСОСТСОТААССС 5 АОАСОТТООТ;ЕцО: 5 -- ОАСООТООТССО СТОТТССТООАСАТССТОАААААСТООАААОААОАСТСТОАСААААА ОАТСАТССАОТСТСАО;10 ЕцО: 5 - АТСОТТТСТТТСТАСТТСАААСТОТТСОААААССТОААОАААОАСААССАООТТАТССАОА ААТСОАТООАСАСТАТСАААОААОАТСТОТ ТСОТТАААТТСТТСААСТСОТСОАСТССО15ЕцО: 5 -- ААТТСООАОТСОАСОАОТТОААОААТТТААСОААСАОАТСТТСТТТОАТАОТОТССАТСО АТТТСТООАТААССТООТТОТСТТТСАООТТ 20 ТТСОААСАОТТТОААОТАОАААОААААСОАТСТОАОАСТО;Ецб: 5 -- ОАТОАТСТТТТТОТСАОАОТСТТСТТТССАОТТТТТСАООАТОТССАООААСАОСООАССА 25 ССОТСАССААСОТС;ЕцО: 5-ТОООТТАСОАО СОТТОАААОТАТТСТТТСАООТТТТССАТТТСТТТАААОАААО САО С СТ ОССАТАААТСАССТСААССТСТСОАООА.30 По 50 пмоль олигонуклеотидов фосфорилируют, а именно ЕцОвместе с ЕцОв 7 мкл, ЕцОи ЕцОраздельно в 8 мкл.Реакцию прекращают. путем нагрева до 100 С. К ЕцОдобавляют 50 пмоль ЕцО(1 35 мкл), а к ЕцО- 50 пмоль ЕцО(1 мкл),Растворы еще раз нагревают до 100 С и медленно охлаждают. Растворы олигонуклеотидных пар соединяют и лигируют Т 4- ДНК-лигазой в 30 мкл, 2 мкг р 0 С 18 40 расщепляют ЕсоВ 1 и Нпб 111, векторную.часть очищают в геле и растворяют в 50 мкл воды, 40 нг вектора и около 2 пмоль лигированных олигонуклеотидов подвергают лигированию в среде 10 кмл, Полученной ДНК 45 трансформируют клетки Е.со М 101,Вставка ЕсоВ 1-Нпс 111 некоторых из полученных плазмйд переклонируют в М 13 тр 9 и устанавливают последовательность, Выбирают плазмиду с требуемой последова тельностью и обозначают как рОМЗ,рОИ 20.Около 3 мкг рбй 1 и рОИЗ расщепляютНпд 111 и Яа 1. Очищают в геле вставку рОчЗ и вектор (вторая половина гена Ец ИФ- у из рОЙ 1). 0,2 мкг рОИЗ лигируютпримерно с 0,05 мкг вставки рОИЗ и ДНКтрансформируют в Е,со.М 101. Плаэмиду полученного клона выбирают после проверки рестрикционного рисунка и обозначают как рОИ 20.рЕг 1 О-ОДА 2 или рЕчб-С 1 ДДЗ,Пр 555 ерно иэ 10 мкг рбй 20 выделяют ХЬО 1-Есой 1 фрагмент, содержащий ген синтетического гамма-интерфероиз .Лошадл вместе с местом рибасомального связывания энтеаотаксиня 111 из Е,са 11, рЯН 281/5 лли рЯН 282/5 расщепляют рестриктззамлн Х 11 О 1 и ЕсоБ 1, 20 нг вектора ллгиру 5 от с 20 нг фрагмента, полученной ДНК трзнсформируют клетки Е.са 15 НВ 101, из которых затем выделя 5 ат плззмиды и проверя 5 от Оестрикц 5 лон 5 ым з 5 ализом, Выбира 5 от плаэмиду, которую обоз 5 ача 5 от кяк рЕс 1 ОС 5 АА 2 (вектор рВН 281/5) или рЕцб ОАДЗ (вектор: рйН 282/5),Опыт по проверке активности интерф 5 е- РОНЗ ТИПЗ ГЗММЗ,Росшую в течение но 5 И культуру Е.со 11 НВ 101/рЕцб-ОДА 2 или НВ 101/рЕцб-ОДДЗ разбавляют в соотношении 1:100 1 В-буфером (100 г/л тоиптоия, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натрия. ЬО мг/л ампициллина) и далее и 55 убиру 5 от при 37 С, После достижения оптической плотности 0,3 (600 нм) добавляют 50 мг/л индолакриловой кислоты и культуру иикубиру 5 от в течение дальнейших 2 ч при 37"."., ЕЯ 5 теоии отделя 5 от центрифугироваиием и разрушают путем ультразвуковой сериьной фильтрации, надасадачную жидкость испытывают на клетках МВ 1:6(АТСССС 1 57) на активность гамма-интерферона, причем в качестве влруса используют веэикулярный вирус стоматита. Лизаты обеих трансформированных бактериальных культур (Е.соИ НВ 101/рЕс 1 О ЙКД 2 или НБ 101/рЕс 1 С- ОААЗ) прояеля 5 от около 0,1 - 1 мпн ед,/мл интерферановой активности, В качестве контроля испытывают идентично полученный лизят Е,со 15 Н В 101/рРН 281, Этот конт 1 зальный лизЯт проявляет меньше чем 100 ед,/мл,Формула изоб ретени я Способ получения уинтерфег 5 о 55 Я лошади, заключа 5 ощийся в том. что из печени лошади при рН 8,0 экстрагиоуют ДНК с использованием фенола, элюат длз 5 тизуют ДНК осаждают этанолом, центрифу 5 ируют в буфере рН 8,0, диал 5 лзуют и осажда 5 от этаналом ДНК размером более 50 т.п.нполученную ДНК расщепляют эндоиуклеазой Яа 5 ЗА при рН 7,5, фракционируют с помощь 5 о электрофореза, выделяют фрагменть, длиной 10 - 23 т,п.ндефосфорилируют их и клониру 5 от в векторе ЕМВ 1 3 (-ЗА), путем скринииГя клонировзн 5 ых фрзГментав Д 1 К Отбирают фрз 5 мент, ГамолаГичныи Гену гамма-И 55 терферона человека, отобранный фрагмент размерам 4,6 т,п,н, расщепляют рестриктазой Вап 5 Н 1, встрзивают в вектор рОС 9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии ЕзсЬег 1 сЫа соП .1 М 101, отбирают плазмиду рАН 111, содержащую Вап 5 Н 1, синтезируют фрагмеи;, состоящ 5 лй из 14-ти олигонуклеотидов Еб 1 - Еб 14, который встраивают в плазмиду рЙН 100 по сайту рестрикции Яас 1 путем затупления выступающих концов ДНК обработкой фрагментом Кленова в присутствии четырех деэоксинуклеотидтрифосфатОв и дополнительным ГидрОлизом Вап 1 Н 1, далее полученной рекомбинантной ДН К трансформируют бактерии Е.са 11 .1 М 101, продукты трансформации, содержащие плазмиду рЕ 516-УУС 1 или рЕцО-ОАА 1, культивируют, аналиэиру 5 от на интерфероновую активность выделенный и очищенный ионообменной храмз 5 ографией и гель-хроматографией белок, сиитезиру 5 от олигоиуклеотиды Тгр 1-6 или Тгр 7-8 со гледующими нуклеотидн ыми последовательностями:Тгр: 5 -АА 1 Тб А СО СТО;Тгр: 5-ПАС СОАТСАО САТОАТСАТОТСОО СО СААддддсдттдтссдбддсбббс 3затем получают фрагменты, кодирующие 45 промотор и место рибасомнаго связывания,лигируют их с большим фрагментом разрезанной Есой 1 и С 1 а 1 плззмиды рАТ 153,трансформируют полученной ДНК штаммбактерии Е,со 11 НВ 101 и выделяют плазми ды рВН 281/5 или рйН 282/5, параллельновектор рОС 18 обработанный Ваго Н 1 и ЯЯ 11эидонуклеазой, лигируют с второй половиной синт тического фрагмента, полученного в результате переваривания плазмиды 55 Е 51 О-ОАА 1 эндонуклеазами Ваш Н 1 и ЗЯ 11 идефосфарилирования, полученной ДНКтрансформиру 5 от бактерии Е,со 11 .1 М 101 ивыделяют плазмиду рбй 1 или векторрОС 18, обработанный эидонуклеазамиЕсой 1 и Н 5 пс 1 111, лигируют с олигонуклео1701114 18 Составитель Т. ЗабойкинаТехред М.Моргентал Корректор М. Максимишинец Редактор Н. Бобкова Заказ 4480 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 тидами ЕцО- ЕцОили ЕОЗ - ЕОб,полученной ДК трансформируют бактерии Е.со,М 101, выделяют плазмиду рОМЗ, плазмиды рОИ 1 и рОИЗ обрабатывают Нпб 111 и За 1, подвергают гель-очистке с последующим лигированием, трансформируют полученной ДНК бактерии Е.со,М 101 и выделяют плазмиду рбй 20, далее выделяют ХЬо 1-Есой 1 фрагмент ДНК, содержащий синтетический генуинтерферона с местом рибосомного связывания Е,со Ептеготохи , который лигируют с плазмидами рВН 281/5 и рВН 282/5, обработанными ХЬо 1 и Есой 1, эндонуклеазами, полученной ДНК 5 трансформируют штамм бактерии Е,соНВ 101, продукты трансформации, содержащие плазмиду рЕсО-ОАА 2 или рЕцО-ОААЗ, культивируют с последующим выделением интерферона и его очисткой путем ионообменной 10 хроматографии и гель-хроматографии.