Способ получения тиаминтрифосфата
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Номер патента: 1594179
Авторы: Гриценко, Забродская, Лучко, Черникевич
Текст
(51)5 С 07. Е 9/09, А 31 67 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЬСТ А 8 ТОРСНОМУ СВИ ях:(57) Изофорорган СОБ П ИЯ ТИАМИНТРИФО ни сается химии фосдинений, в частеских фос.- ннобретение относится к химианических соединений, а имершенствованному способутиаминтрифосфата (ТТФ) фо хлорида й кислоты ствляют минпос- ереосажеси и ионооб- анионооби каИ форо к ус ченилу- улы фиром енение с Св виде едоваемпера роцесса до 5,1% ется повышее его ста 1-3 ведены зависимости,гаемый способ. а поясняющи предл со(7 1) Институт биохимии АН БССР (72) И,П,Черникевич, Э,А.Гриценко, Т.А.Лучко и С,В.Забродская (53) 547,26118 (088.8)(56) Березовский В.М. и др . Нуклеоти ды, коферменты, фосфорные эфиры, Синтез кокарбоксилазы. - ЖОХ, 1963, т.33, вып.1, с. 49.Гордон А., Форд Р,. Спутник хими" ка. - М,: Мир, 1976, с. 399-401.Реп 1 дпеп Н.К, ВупЬезз оГ СЬхаш 1 пе йгрпозрЬаСе. Рпп. селеш. Бейб.1976, У 1, р,1-2. с 1" ын,Од.он,он,ор(он) -о,М СИ, - Х1 3. который является трифосфорным,витамина В , и может найти прв медицине .Целвю изобретения являние выхода ТТФ и повышенибильности. ности получения тиаминтрифосфата -трифосфорного эфира витамина В , чтоможет найти применение в медицйне.Цель - повышение выхода и стабильности целевого продукта, Синтез ведутфосфорилированием тиамина хлоридагидрохлорида смесью фосфорной кислотыи пятиокиси фосфора при 60-70 С втечение 70-90 мин с последующей последовательной обработкой реакционнойсмеси на следующих ионообменных гелсефадекс 6-10, ДЕАЕ-сефадекс А,ЗР-сефадекс Сс выделением готовойформы целевого эфира в виде литиевойсоли . Выход 5, 1%, т.пл. кислой формы194 С, литиевой соли 281 С, .бруттоф-ла кислой Формы С Н Н 40, 8 1/2 НОЭти условия позволяют повйсйть выходцелевого эфира от 0,6 до 5,1% и стабильность от 2 мес, до 2 лет, 1.з.п.ф-лы. 3 ил., 3 табл,Фосфорилирование тиаминагидрохлорида смесью фосфорни фосфорного ангидрида осущпри 60-70 оС в течение 70-90ле чего ТТФ выделяют путемдения из водно-ацетоновой смпоследовательной очистки наменном геле сефадекс С,менном геле ДЕАЕ-сефадекс Атионообменном геле ЯР-сефади готовую форму ТТФ вьщеляюлитиевой соли. Указанная потельность операций, а такжетурный и временной интервалпозволяют повысить выход ТТпротив 0,6% по известному си резко повысить стабильность ТТФв процессе хранения,В отличие от известного способа,В котором для очистки ТТФ используютсильнокислую ионообменную смолу, согласно предлагаемому способу для очистки последовательно используются триразличные модификации сшитого полидекстрана - геля сефадекс, которые , 10предназначены для гель-Фильтрации иионного обмена и различаются функцио"нальными группами, привитыми к поверхности геля; сефадекс Сне модифицирован, ДЕАЕ-сефадекс А, мо- . 15дифицированный диэтиламидной группой,и БР-сефадекс С, модифицированныйкарбоксильной илй сульфогруппойЯО 11. Снижение температуры или времени реакции соответственно ниже 60 С 20,и 70 мин ведет к увеличению содержания в реакционной смеси непрореагиро-;вавшего тиамина, а повышение температуры свыше 70 С и времени более90 мин - к нарастанию содержания продуктов термической деградации фосфорных эфиров тиамина (тиамина и тиаминмонофосфата) .Таким образом, любое отступлениеот приведенных условий приводит куменьшению выхода ТТФ и снижению егокачества.П р и м е р 1. Ортофосфорную кислоту предварительно обезвоживают при. Фосфорного ангидрида нагревают прио65 С до образования однородной массыи добавля 1 от при непрерывном перемешивании 5 г (О,016 моль) тиаминхлоридагидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, перемешивая при даннойтемпературе 80 мин, охлаждают до20 С, вносят 24 г измельченного льда 45и снова перемешивают до полного растворения (температура бани 0 С). Охлажденный раствор медленно приливаютк 0,5 л безводного ацетона (О С) иоставляют на холоду на 15 ч. Отстоявшийся водно-ацетоновый слой удаляют,а в остатке получают 13,6 г Фосфори.лированного тиамина.Осажденная органическим растворителем смесь еще содержит значительныеостаточные концентрации свободнойи солеобразующей фосфорной кислоты,гидролизующей лабильные фосфорноэфирные связи синтезированных производ" ных. Для ее удаления из раствора осадок Фосфатбв тиамина растворяют в 20 мл дистиллированной воды и пропускают через колонку (5,6 х 70 см) с сефадексом Ссо скоростью 24 мл/ч на 1 см. Фосфорные эфиры тиамина элюируют водой с той же скоростью, собирая фракции по 10 мл. За качеством очистки от фосфорнокислых примесей следят с помощью высокочувствительной реакции на фосфор, а также визуально по образованию белого кристаллического осадка Ва з(РО )при добавлении к аликвотам элюата уксус" нокислого Ва, Концентрацию эфиров ,тиамина регистрируют тиохромным методом и спектрофотометрически по молярной экстинкции раствора (Е .=7400 см .М 9 при В 272,5 нм. При гель-Фильтрации на сефадексе Сэлюируется несколько пиков, (фиг.1), из которых пик 2 Фосфорной кислоты расположен на значительном удалении от пика 1 тиаминофосфатов, .Разделение фосфатов тиамина осуществляют в виде их внутренних солей бетаинового типа методом ионообменной хроматографии, Свободные от фосфорной кислоты фракции первого пика от 28 по 42 (фиг.1) объединяют, рН доводят 0,02 М трис-НС 1 буфером до 7,4 и наносят на колонку (2,6 х 40 см) с анио-. нообменным гелем ДЕАЕ-сефадекс А, уравновешенную этим же буфером. Тиамин не связывается с анионообменником и вымывается в пустом объеме колонки, После его удаления из раствора фосфаты тиамина элюируют линейным градиентом 1 ЛС 1 от 0,1 до 0,4 М (по 300 мл в каждом сосуде) со скоростью 18 мл/ч на 1 см, При хроматографии на ДЕАЕ- сефадексе получают шесть четко выраженных пиков с типичными тиаминовыми спектрами (фиг,2): пик 1 соответствует тиаминмонофосфату (ТМФ) и вымывается 0,12-0,16 М Ь 1 С 1, пик 2 - тиа- .н миндифосфату (ТДФ) (0,17-0,21 М 1,1 С 1), пик 3 - ТТФ (0,22-0,25 М Ь 1.С 1), пикы 4 - б - полифосфатам тиамина (0,26- 0,29; 0,30-0,33 и 0,34-0,36 М 1 ЛС 1), Расчет процентного содержания отдельных фосфатов в индивидуальных пиках показывает, что на долю тиаминмоно-, ди-, три- и полифосфатов приходится ,соответственно 25,0; 37,1; 28,6; 5,9;1;8 и О,Х всего наносимого тиамина (Т).,0,9 Е его оказалось в нефосфорилированной, свободной форме, Степень159417 5хроматографического разделения и идентификацию фосфатов оценивают методом восходящей хроматографии на бумаге РИ 5 в системе растворителей: Н-пропанол - вода - О,1 И фосфатный буфер, рН 5,0 (3: 1: 1) . ТТФ находят в реакции со специфической тиаминтрифосфатазой мозга. Наличие ТДФ в составе ТТФ фиксируют ферментативО но, рекомбинацией ТДФ, как кофермента, с апопируватдекарбоксилазой.Частичное перекрывание пика ТТФ пиком синтезирующегося в более высоких концентрациях дифосфорного эфира Т (фиг.2) приводит к незначительному, но достаточному для торможения специфической тиаминтрифосфатазной реакции загрязнению ТТФ остаточным ТДФ. Полная очистка ТТФ достигается на кати онообменном геле БР-сефадекс С. Элюируемые с ДЭАЭ-сефадекса фракции пика 3 (фиг.2) объединяют, упаривают до минимального объема (1 мм;.18 С) и приливают для удаления МС 1 и трис (оксиметил)-аминометана к 10-кратному объему охлажденного до 0 С абсолютно- . го этанола. Смесь перемешивают 20 мин, а фосфорные эфиры осаждают при О С из 10-кратного объема безводного ацетона,. После вьщерживания в течение30о15 ч при 18 С фосфаты отфильтровывают, повторно экстрагируют водой (2 мл) и перекристаллиэовывают из смеси абсолютных этанола и ацетона в соотношениях 1: 10. Выпавший осадок 35 фильтруют, растворяют в 1 мл 0,005 М натрийацетатного буфера,. рН 3,8 и наносят на колонку (1,2 х 60 см) с, катионообменником ЯР-сефадексом С, уравновешенную этим же буферным раствором. Скорость тока жидкости через колонку 15 мл/ч на 1 см, объем фракции 2 мл, ТТФ не сорбируется катионообменником и вымывается в пустом объеме колонки основным пиком 1, 45 (фиг,З). ТДФ значительно запаздывает, элюируясь позже минорным пиком 3 (фиг.З). Между пиками 1 и 3 фосфатов тиамина располагается небольшой .пик 2(фиг,З) неидентифицированной природы 50с нетиаминовым спектром.Очищенный препарат ТТФ не содержит примеси фосфорной кислоты и других фосфатов тиамина, однако, в водном растворе недостаточно устойчив, пос-, 55 тепенно гидролизуясь до ТДФ (на 1,6- 2,0 Х в течение 3 мес хранения при ОфС). Для стабилизации молекулы элюируемые с БР-сефадекса Сфракции 9 бпика 1 (фиг.З) упаривают на роторномо" испарителе до 5 мл, охлаждают до 0 Ь и .при интенсивном перемешивании в среде сухого азота, во избежание окисления ТТФ, приливают по каплям 203 ЬдОН до нейтральной реакции. Растворитель частично упаривают (1 мм;18 С), а к небольшому объему (1 мл) литиевой соли трифосфорного эфира тиамина добавляют при перемешивании.10-кратный объем смеси абсолютного ,этанола и ацетона (1: 10). Раствор оставляют на 15 ч при 0 С, после чего сформировавшиеся кристаллы отфильтро"вывают. Для полноты экстракции избыточного ЬОН и сконцентрировавшегося при упарийании буферного раствора СНэСООМа переосаждение ТТФ осуществляют трижцы, Выделившиеся кристаллы промывают охлажденным этанолом и су-.- шат в вакууме над РО. Выход целевого продукта составляет 256 мг (5,1 Е)Литиевую соль ТТФ хранят в среде сухого азота в ампулах по 50 мг при Оф С, Устойчивость контролируют черезкаждые 3 мес хранения (табл,З),П р и м е р 2. Берут 11,25. г (0,11 моль) предварительно обезвожен- ной в вакууме при 125 фС в течение б.ч 987.-ной ортофосфорной кислоты и 8,75 г (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородной массы при 60 ОС, после чего добавляют при непрерывном перемешивании 5 г (0,06 моль) тиаминхлоридагидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, помешивая при данной температуре О мин, охлаждают до 20 С, вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворения (температура бани 0 С) . Дальнейшие операции получения ТТФ (осаждение органическим растворителем образовавшейся за время фосфорилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катйонообменных смолах и перевод полученного раствора тиаминтрифосфорной кис" лоты в литиевую соль, в среде сухого азота) проводят способом, идентичным способу, описанному в примере 1. Выход целевого продукта составляет216 мг (5 Ж).Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 70 мин протекания реакции показано в табл,1. зависимость скорости синтеза фосфор 1594179ных эфиров тнамина от продолжительности реакции при 60 С - в табл.2.П р и м е р 3. Берут 11,25 г (0,11 моль) предварительно обезвожен ной в вакууме в течение 6 ч при 125 С 98 -ной ортофосфорной кислоты и 8,75 г (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородной массы при 70 С, после чего 10 добавляют при непрерывном перемешивании 5 г (0,016 моль) тиаминхлоридагидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, помешивая при данной тем-, пературе 90 мин,. охлаждают до 20 С, 15 .вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворе-. ния (температура бани 0 С), Все последующие операции получения ТТФ, а именно осаждение органическим раство рителем образовавшейся за время фосФорилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катионообменных смолах и перевод, полученного раствора ти- т аминтрифосфорной кислоты в литиевуюсоль в среде сухого азота, проводятспособом, идентичным способу, описанному в примере 1. Выход Целевого 30 продукта составляет 250 мг (5,1 )..Влияние температуры на скоростьФосфорилирования тиамина за 90 минпротекания реакции показано в табл.1,зависимость скорости синтеза фосфорных эфиров тиамина от продолжитель"ности реакции при 70 фС ф- в табл.2.Полученный препарат литиевой солиТТФ хроматографически однороден и в используемой системе бумажного хро.матографирования его подвижность(К) составляет 0,22, не отличаясьот таковой для кислой формы ТТФ, вы,"деленного Фракционировйнпем Фосфатов,на ЯР-сефадексе С(фиг.3), При 45рекомбинации ТТФ с апопируватдекарбоксилазой дрожжей не наблюдалось образования холоформы Фермента, под3 тверждая тем самым отсутствие в синтезируемом препарате примесных концентраций ТДФ. Температура плавлениякристаллов кислой формы ТТФ равна194 С, солевой (в виде литиевой соли) 281 С. Элементный анализ для кислой Формы трифосфорного эфира тиамина.Найдено,.: С 27,49 + 0,3.1;Н 3,98+0,09:, Я 10,67+ 0,19;Р 18,14 + 0,16; НО 2,01 + 0,07,С Нд И О РЯ 1/2 Н О.Вйчйслено,: С 28,08,. Н 3,93;И 10,92; Р 18,10, НО 1,56.Соотношение числа атомов Ь литке"вой соли к числу молей ТТФ соответструет 2,Таким образом, предлагаемый спо.соб синтеза ТТФ позволяет значительно(от О,б до 5,1 ) повысить выход ТТФпо сравнению с известным способом и,кроме этого, значительно (от 2 мес додо 2 лет) повысить устойчивость препарата,Формула изобретения1. Способ получения тиаминтрифос"фата взаимодействием тиамина хлоридагидрохлорида с фосфорной кислотойи фосфорным ангидридом при нагреваниис последующим выделением целевого пропродукта.,переосаждением иэ водноацетоновой смеси и хроматографическойочисткой, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выходацелевого продукта, нагревание ведутдо 60-70 С в течение 70-90 мин и хро"матографическую очистку осуществляютпоследовательно на фильтрующем гелесефадекс С-.10, на анионообменном гелеДЯАЕ"сефадекс Аи катионообменномгеле БР-сефадекс С.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности тиаминтрифосфата,его выделение осуществляют в виделитиевой . соли,О 1594179 Та блица Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина эа 70 (а), 80 (б) и 90 мин (в) протекания реакцииОтносительное содержание, 7., фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилирования Температура реакции, СФ Т ТМФ ТДФ ТТФ Полифосфаты в) 30 5.0 60 65 70 80 90 120Т а б,л и ц а 2 Зависимость скорости сиитеэа фосфорных эфиров тиамина от продолжительности реакции при температурах 60(а), 65 (б) и 70 С (в) Относительное содеркание, Х, фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилирования1594179 Продолжение табл,2 . 1 Времяреакции Относительное содержание, %, фосфорных эфиров тиамина в продукте реакции фосфорилированияТ ТИФ ТДФ ТТФ Полифосфаты 90 1,1 100 1,9 120 . 3,4 150 5,1 28,8 27,9 23,3 18,4 38,3 38,1 37,2 33,8,3 7,2 6,6 5,8 23,5 24,9 29,5 37,0 Таблица 3Зависимость степени гидролиза тиаминтрифосфата от времении формы хранения препарата ф Степень гидролиза, %, через, мес 6 9 12 18 Исследуемая форматиаминтрифосфата 3 24 е 0,10012 :Оэ 37 . Оэ 69 0,17, О;31 0,78 1,04 2,42 6,19 Литиевая сольКислая форма0,5%-ный йодныйраствор 1,86 3,63 14,71 . 36,98 Степень гидролиза тиаминтрифосфата определяют ферментативнымметодом, по количеству образовавшегося ТДФ, а также хроматографически в системе растворителей н-пропиловый спирт - вода - 0,1 Ифосфатный буфер, рН 5,0, 3:1:1. Структурную целостность и идентичность хранящегося препарата оценивают по реакции со специфической тиаминтрифосфатазой мозга (Кф 3,6.1.28) . в) 3060 70 80 90 100 120 150Составитель Л,Карунинактор Н.Рогулич Техред М,Ходанич Корректор Л.Вески Заказ 281 316 Подписноео изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР35, Раущская наб., д. 4/5 ВНИИПИ Государственн 1130
СмотретьЗаявка
4478060, 26.08.1988
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ АН БССР
ЧЕРНИКЕВИЧ ИВАН ПЕТРОВИЧ, ГРИЦЕНКО ЭММА АЛЕКСАНДРОВНА, ЛУЧКО ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА, ЗАБРОДСКАЯ СВЕТЛАНА ВИКТОРОВНА
МПК / Метки
МПК: A61K 31/675, C07F 9/09
Метки: тиаминтрифосфата
Опубликовано: 23.09.1990
Код ссылки
<a href="https://patents.su/8-1594179-sposob-polucheniya-tiamintrifosfata.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения тиаминтрифосфата</a>
Предыдущий патент: 2, 7, 12, 17-тетрабромтетраазапорфин в качестве реагента для количественного определения ионов м и а в растворах
Следующий патент: Способ получения -карболиновых алкалоидов из гармалы обыкновенной
Случайный патент: Способ получения производных пиперазина или пиперидина или их солей