Способ получения антибиотиков

нэлэн 1: л:,.;о. н 6 лао еиа МЕА О П И С А Н И Е 528883изоьеЕТЕНия Союз Советских Социалистицеских Республик(088.8) икова но 15.09.76. Бюллет. ь ЛЪ 34 ДтТа опубликовнни 5 Онисии 51 72) Авторы изобретения ата Тойю, М ура Сатоси, Абе Ионносуке ецуо;71) Заявите ирма Китазато Институт Тойо Джо 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ Изобретение относится к об в частности к производству а Способ получения антибиоти пы лейкомицина в патентной литературе не описан.-Е,сн,- С - СН,СНз ил е Й - груп Оисключая комбинации, когд 10 являются группой Н н йз не Кг - групп Н, - СН- С - СН, - СН, - СН,Окачестве продуцента используют 1 огпусез К 1 тазатоепз 1 з ХКК 1. 2486 О котором тамм 1 Гасудврственныи камитвСаввта Министров СССРва делам изобретенийи аткрытий Иностранц е Акихиро, Ом и Ватанабе ТПредложен способ получения новых антибиотиков А, - А 9 группы лейкомицина, имеющих общую формулуШтамм получен в Северном исследоьательс 1:ом отделе Министерства земледелия США, Приорпя, Штат Иллинойс, США и хранится в коллекции микроорганизмов под номером ХГЯ 1 2486,Основные харатсрые признап штамма Ыгер 1 оп)усев К 11 аза 1 оепзв ХЙК 1. 2486.Воздушный мицелий от серовато-белого до желтого или светло-коричневого, слабо развить)й, тонкий, иногда пушистый или хлопьевидный. Иногда можно наблюдать спирально закрученные гифы.АГар Чапека. Культура От желтоГО до кел- Г 7)а О-И)р 1 Ч 11 СВОГО пвеТ 1 1170111 Каю 1 ца 51 в среду. Воздушный мицелий серовато-бел 1 й. астГоримый пигмент ке.Говт 1.Л 1 ар Кр 1111 сОГО. КО.01 и ке;1 ОваГО-бело ц 1)еи, це 11 тР 111)иОд 151, 11 Р 011 и аот в аГ 11), 1) 1 с Г)1,У 11 1)11111 ,Р,)Й.11)зду 11 мицслий тонкий, серовато-бсло ц 1:От 1. ВО в 1)еы 51 1111)оаци Оорзуются ушистые образования, которые превращаются пз белых в рыжевато-коричневые и покрывают всю поверхность.1 астворпмый пигмент светло-желтый. Иищевой агар. Колонии ограниченные коричневого цвета с приподнятым центром и складками от центра к краю. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент коричневого цвета.Глюкозный агар, Культура - от коричневой до темпо-коричневой, проникает в агар.Воздушный мицелий очень слабый, серого или мышиного цвета. Растворимый пигмент коричневого цвета.Крахмальный агар. Культура - от бесцветной до желтоватой или желтовато-коричневой, проникает в среду; центр колоний коричневого цвета, приподнят.Воздушный мицелпй тонкий. В процессе культивирования быстро растет пушистый или хлопьевидный воздушный мицелий белого цвета, разрастаясь по всей поверхности среды и окрашивая ее в желтоватый цвет.Растворимый пигмент отсутствует или образуется в незначительном количестве.Агар с тирозином, Культура - от. коричневой до темно-коричневой, проникает в среду.Воздушный мицелий серовато-белого цвета, тонкий, со временем пушистый. Реакция на тирозиназу положительная. Иногда реакция на тирозиназу бывает отрицательной для некоторых штаммов, что обусловливает слабо- желтую окраску среды. В других случаях - обильное образование серовато-черного пигмента.Картофельная пробка. Культура желтовато- коричневая и морщинистая,Воздушный мицелий отсутствует или тонкий, белого цвета, иногда пушистый и желтовато- коричневый, Цвет пробки неизменный или светло-коричневый, иногда черный.Морковная пробка. Культура - от коричневой до темно-коричневой. Воздуишый мицелий 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 отсутствует или бледно-серый. Цвет пробки неизменный.Среда с желатиной. При посеве уколом культура слабо развитая, темно-коричневого цвет;1. 1 азжике 1 Ие едлен 10 е, пол 1 юе.молоко, Коагуляция слабая или отрицательная. Г 1 ептонизация положительная, Кольцо от желтого до коричневато-желтого или темно- коричневого цвета.Яичная среда, Культура желтовато-коричневая, Воздушный мицелий тонкий, разбросанный, светло-желтый, со временем пушистый, Среда фиолетового цвета.Сыворотка. Культура коричневато-желтая. Возду пшый мицелий отсутствует.Кровь. Культура темно-коричневого цвета.1 Ьзду 11 й мицелий отсутствует, Гемолиз положительный.Нитратное восстановление положительное. Гидролиз крахмала положительный. Разложение целлюлозы отрицательное. Образование сероводорода положительное.Огшсанная выше морфологическая характеристика Яг, К 11 аза 1 оепз)з соответствует четырем типам формы колоний; А)В)С)ь).Тип 1) имеет неправильную форму, Толщина колоний: тип А больше типа В, больше типа С.Воздушный мицелий: отсутствует у типа А и С, слаборазвитый у типа В.Цвет поверхности колоний; тип А - желтоватый блестящий, типы В и С - коричневый.Диаметр колоний: типа В больше типа А, типа С - очень маленький. Складки, тип А - менее трех, В - более трех, С - отсутствуют,Способ получения комплекса антибиотиков осуществляют следующим образом.Культуру Ягер 1 огпусез Кйаза 1 оепз 1 з ХКК 1.2486 выращивают в глубинных условиях в ферментационном аэробном процессе на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы.В качестве источника углерода могут быть использованы лактоза, мальтоза, декстрин, меласса, крахмал, глюкоза, кукурузная патока, сахар, глицерин, жирные кислоты - стеариновая, пальмитиновая, уксусная, пропионовая и т. д.В качестве источника азота могут быть использованы жидкость при вымачивании кукурузы, дрожжи или дрожжевой экстракт, мясной сок, пептон, молоко, хлопковое масло, гидролизат казеина, аминокислоты, соевое масло и т. д., а также неорганический нитрат, соли аммония и т. д.Из неорганических солей питательная среда может содержать калий, натрий, кальций в виде фосфатов, карбонатов, хлоридов и т, д., а также активаторы роста - соли бора, молибдена, меди, никеля, железа и т. д.Ферментацию проводят при 25 - 35 С, рН среды 7,0 при постоянном перемешивании и аэрации. Для выделения и очистки антибиотического комплекса используют известные способы, например экстракцию растворителем, 528883обработку адсорбентом, распределительнуюхроматографию, кристаллизацию из растворителя и т. д.Полученный антибиотический комплекс обладает следующими свойствами.Элементарный анализ, %: С 60,0; Н 8.80;Х 1,68. Мол. вес около 800.Физические свойстваПорошок белого цвета, т. пл. 128 - 145 С.Спектр поглощения УФ-лучей:Лматакаа = 231 нм Е = 353,макс.1 смОптическое вращение:(а)ззо = - 53 (с = 1; хлороформ).Растворим в низших спиртах, таких как метанол, этанол и т. д.; эфирах - этилацетате,бутилацетате; кетонах - ацетоне, метилизобутилкетоне; бензоле, хлороформе и т, п. Трудно растворим в воде и нерастворим в петролейном эфире.Химические свойстваНовые антибиотические композиции даютследующие цветные реакции:отрицательные: реакция Адамкевича, реакция с биуретом, реакция Милона, реакция сксантопротеином;положительные: реакция с антроном, реакция Шриванова, реакция Молиша и реакция сконцентрированной серной кислотой.Для выделения отдельных антибиотиков Аз,А 4, Аз, Аз, А 7, Аз и А 9 из указанного комплекса его дополнительно обрабатывают методомхроматографии с применением силикагеля,целлюлозного материала, активированной окиси алюминия и т. п. При дальнейшей обычнойобработке системой растворителей можно выделить каждый из компонентов в виде призмбелого цвета (Аз - Аа, Аз), кристаллическогопорошка белого цвета (Аи А,).Анализ антибиотических соединенийАз - С 4 зНз 9 МО 1 з, радикалы= 1, хлороформ).Величина рК (50% - этанол) - 6,70.Спектр поглощения УФ-лучей, нм:Лм"акса = 231 - 232, Е" - 351,макс.1 смКроме вышеуказанных цветных реакцийдля антибиотического комплекса, А, - соединение дает отрицательные реакции Шиффа иЭрлиха.А 4 - С 4 Н,7 ХО 1 з, радикалый, - С - СНР, - С - СН, - СН, - СН,1О . ОМол. вес 820+-15; т. пл. 120 в 1.С.Оптическое вращение:/а/ззр = - 50 (с = 1, хлороформ), Величина рК (50% этанол) - 6,71.Спектч поглощения УФ-лучей. нм;Лмстакса = 231, Е" - 325.макс.1 смКроме вышеуказанных цветных рея кпийдает отрицательные реакции Шиффа и Эг.лиха.А,= - С-. Наз,МО,.; радикалыЙ, - С - СНК, - С - СНа - СНа - СН,10НО ОМол. вес 780 4- 10; т. пл. 120 в 1 С.Оптическое вращение:= 1,8, хлороформ).Величина рК (50 %этанол) - 6.75.Спектр поглощения УФ-лу чей, нм: 50 55 Л"., 232, Е,;м - 380,Мол. вес 760-1-10.Оптическое вращение /а/зл = - 65,1 (с -- . - 1,3, хлороформ) .65 Величина рК (50% этаиол) - 6,75. Лает те же реакции, что и соединение Аа. Аз - СззНзХ 01 а радикалы Я, - Н, Яз - С - СНз 60ОП р ц м е р 1. Водную питательную среду,содержащую, %: пентон 0,5; мясной экстракт0,5; глюкоза 2; хлористый натрий 0,5; сухиедрожжи 0,3 ц карбонат кальция 0,3, разбавляют водой до 100 мл, помещают в колбу Сакагукц емкостью 500 мл, устанавливают рН.==- 7, стерилизуют, засевают культурой Яг.1 Оаза 1 оепв 1 з и цнкубируют при 27 С в течецис 72 ч прц взбалтывании.20 л ферментационной среды, содержащей,о/о: соевая мука 3, крахмал 2; глюкоза 1; хлористый натрий 0,5; сульфат аммония 0,3; сухиедрожжц 0,5, карбонат кальция 0,3; двухосновцый фосфат калия 0,1 и мочевина 0,01, помешают в стерильную склянку емкостью 30 л изасевают в асептических условиях цнокулятом.Ферментацию осуществляют при 27 С в течение 50 ч прц перемешивании мешалкой(250 об/мин) ц скорости аэрации 20 л/мин.Затем культуральную жидкость асептическипереносят в бродильный чац из нержавеющейстали емкостью 400 л ц тщательно смешиваютс 200 л бродильной среды того же состава.Смесь дополнительно инкубируют при 27 Св течение 85 ч при перемешивании (200 об/мин)и аэрации стерильным воздухом (200 л/миц).В конце ццкубапцоцного периода культуральцая жидкость содерясит 1200 мкг/мл смеси антибиотиков Аз - А 9 в пересчете ца соответствующее количество обычного стандартного лейком пина,В 160 л фцльтрата, полученного после удалеця мццелця цецтрифугированием, устанавливают рН = 9, экстрагируют дважды 50 л бутцлацетата. Устанавливают рН =9 в бутилацетатной фазе добавлением разбавленной соляной кислоты (рН = 3), хорошо перемешивают ц устанавливают рН = 8,5 в отделенной водяной фазе, а затем дважды экстрагируют 8 лбутилацетата. Бутилацетатную фазу экстрагируют 6 л разбавленной соляной кислоты (рН = 3,5). Водную фазу после установления рН = 9 дважды экстрагируют 6 л бензола. Бензольные экстракты объединяют иконцентрируют под вакуумом. Получают 130 гсмеси антибиотиков в виде порошкообразногосвободного основания белого цвета. Активность 1150 мкг/мг.П р и м е р 2. Выделение соединения Аз.250 г порошкообразного продукта белогоцвета (пример 1) растворяют в 1 мл бензолаи раствор выливают через верхний конец вхроматографическую колонку диаметром 1 смц наполненную 10 г селикагеля в бензоле. Затем колонку тщательно промывают бензоломи ппопускают через нее смесь бензола с ацетоном (5: 1) со скоростью 1/4 об./об. ч. Элюат Собвра 1 от в больщое число пробирок по Спектр поглощения УФ-лучей, цм:Дает те же реакции, что и соединение Аб.Ацтцбцотгцси обладают большой продолжцтсльшстью дсцствя и слабой токсцчностью. 510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 1 мл в каждую, пользуясь сборником фракций. Прц исследовании состава содержимого каждой пробирки методом хроматографии в тонком слое было установлено, что пробирки 15 - 25 содержат значительные количества соединения Аз.Содержимое указанных пробирок объединяют и в вакууме удаляют растворитель. Остаток растворяют в бензоле при 60 С и выдеркивают в течение 10 - 15 ч в камере, охлаждаемой льдом. Получают свободное основание в виде белых призм. Выход Аз 30 мг.П р и м е р 3. 4 г продукта, получаемого в примере 2, подвергают распределению по принципу противотока, применяя систему растворителя бензол - хлороформ - метанол - 1/15 моля лимонной кислоты (буфер) прц рН = 4,4 (соотношение растворителей 20: 6: : 20: 8), и помещают в 300 пробирок, каждая из которых содержит 10 мл обработанного растворителя. При исследовании содержимого пробирок методом хроматографии в тонком слое с сцликагелем установлено, что пробирки 65 - 80 содержат значительные количества соединения Аз. Содержимое этих пробирок объединяют и обрабатывают, как указано выше. Выход 350 мг Аз в виде порошка белого цвета.Полученное соединение растворяют в 5 мл этилового эфира и по каплям при перемешивании выливают в 5 мл 2%-ного раствора винной кислоты в этиловом эфире.Образовавшийся осадок соединения Аз промывают этиловым эфиром и после выделения высушивают. Выход 400 мг.П р и м е р 4. Получение соединения Л, Содержимое пробирок 28 - 35 после обработки его, как описано в примере 2, объединяют и удаляют растворитель путем перегонки под вакуумом. Оставшийся белый порошок растворяют в 1 мл бензола и выливают в хроматографическую колонку диаметром 6 мм, наполненную 5 г силикагеля, смешанного с требуемым количеством бензола. Затем колонку элюируют смесью бензола с ацетоном (4: 1). Из элюата удаляют растворитель путем перегонки и остаток перекристаллизовывают из бензола. Получают свободное основание А в виде кристаллов в форме призм белого цвета. Выход 20 мг.П р и м е р 5. Содержимое пробирок 95 - 115, полученное, как описано в примере 3. объединяют и обрабатывают, как описано выне. Получают соединение А в виде порошка белого цвета. Выход 294 мг.Пример 6. Получение соединения Аз.Содержимое пробирок 45 - 68, полученное, как описано в примере 2, объединяют ц обрабатывают методом хроматографии (элюируют смесью бензол: ацетон 4: 1).Получают свободное основание соединения А: в гиде пооошка белого цвета. Выход 35 мг.П р и м е р 7. Содержимое пробирок 171 - 195, полученное. как описано в примере 3, объединяют и обрабатывают, как ранее,Выход Лв 480 мг, 528883 10П р и м е р 8. Получение соединения Л 250 мг белого порошкообразного продукта, полученного по примеру 1, растворяют в 1 мл бензола и раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 1 см, наполненную 1 О г силикагеля в бензоле. Затем колонку элюируют бензолом и пропускают через нее смесь бензола с ацетоном (4: 1) со скоростью 1/4 об./об, ч. Элюат собирают в большое число пробирок в количестве 1 мл в какдой, пользуясь колектором фракций.Содержимое пробирок 26 - 40 объединяют и удаляют растворитель перегонкой, Оставшийся порошок белого цвета растворяют в 1 мл беизола и выливают в верхний конец хроматографической колонки диаметром 6 мм, наполненной 5 г активированной окиси алюминия в смеси с необходимым количеством бензола. Затем через колонку пропускают смесь бензола с этилацетатом (2: 3) на второй стадии хроматографирования. Элюат перегоняют в вакууме и остаток перекристаллизовывают из бензола. Получают продукт в виде белых призм. Выход соединения А, в форме свободного основания 15 мг. П р и м е р 9. 35 мг белого порошка, полученного по примеру 1, растворяют в 70 мл бензола и раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 10 см, наполненную 900 г силпкагеля в бензоле. Колонку тщательно промывают бензолом, а затем через иее пропускают смесь бензола с ацетоном (4". 1) со скоростью 1/4 об./об. ч. Элюат собирают в пробирки по 20 мл в каждой. Содержимое пробирок 130 в 1 объединяют и удаляют растворитель перегонкой под вакуумом. Оставшийся пороцгок белого цвета растворяют в 20 мл бензола и выливают во вторую хроматографическую колонку диаметром 3 см, содержащую 100 г активированной окиси алюминия в смеси с требуемым количеством бензола. Затем через колонку пропускают смесь беизола с этилацетатом (2:3). Элюат собирают, перегоняют под вакуумом и остаток перекристаллизовывают из горячего бензола. Получают чистый продукт в виде кристаллов белого цвета. Выход А, 800 мг.П р и м е р 10. Получение соединения А мг белого порошка, полученного,по примеру 1, растворяют в 1 мл бензола, и раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 1 см, наполненную 10 г силпкагеля в бензоле. Затем колонку промывают бензолом и пропускают через нее смесь бензола с ацетоном (3: 1) со скоростью 1/4 об./об. ч. Элюат собирают в пробирки по 1 мл в каждую.Содержимое пробирок 35 - 55 объединяют и иод вакуумом отгоняют растворитель. Полученный остаток в виде порошка белого цвета растворяют в небольшом количестве бензола и обрабатывают хроматографическим методом, как ранее. Получают соединение А в виде кристаллического порошка белого цвета. Выход 10 мг. 10 15 20 25 30 35 40 Я 50 55 60 65 П р и м е р 11. Содержимое пробирок 220 - 245, полученное по примеру 3, объединяют и обрабатывают, как описано выше. Получают 200 мг сырого порошка белого цвета, Этот продукт дополнительно хроматографируют, как в примере 10, Получают свободное основание соединения Л, в виде кристаллического порошка белого цвета. Выход 100 м г.Пример 12. Получение соединения Л.Содержимое пробирок 30 - 40, полученное по примеру 10, объединяют и удаляют растворитель перегонкой под вакуумом. Полученный порошок белого цвета растворяют в небольшом количестве бензола и раствор обрабатывают путем повторного хроматографироваиия, как описано выше. Получают свободное основание соединения Л, в виде кристаллов белого цвета. Выход 5 мг.П р и м е р 13. 35 г белого порошка, полученного по примеру 1, растворяют в 70 мл бензола и раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 6 см, наполненную 700 г активированной окиси алюминия в бензоле. После промывки бснзолом через колонку пропускают смесь бензола с этилацетатом (1: 2) со скоростью 1,/4 об./об. ч. Элюат собирают в пробирки порциями по 20 мл. Содержимое каждой пробирки обрабатывают методом хроматографии в тонком слое. Установлено, что соедиение Л содержится в пробирках 3 - 40. Содержимое этих пробирок объединяот и перегоняют под вакуумом. Остаток растворяют в 30 мл беизола, и раствор выливают и хроматографическую колонку диаметром 5 см, наполненную 375 мл смеси силикагеля в треоуемом количестве бснзола. Затем колоик, элюируют смесью беизола и ацетона (3: 1) и содержимое пробирок 150 - 170 объединяют и высушивают под вакуумол. Полученный остаток перекристаллизовывают из горячего бензола. Получают соединение Л в виде иглообпазиых кристаллов белого цвета. Выход 500 мг.Пример 14. Получение соединения Л.Содержимое пробирок 60 - 70, полученное по примеру 10, объединяют и высушивают под вакуумом. Полученный порошок белого цвета растворяют в бензоле и обрабатывают повторно хроматографическим методом, как описано выше. Выделяют соединение А в виде кристаллического порошка белого цвета. Выход 20 мг.П р и м е р 15. 35 г порошка белого цвета, полученного по примеру 1, растворяют в 70 мл бензола. Раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 6 см, наполненную 700 г смеси актпвированной окиси алюминия с бензолом. Затем колонку промывают бензолом и пропускают через нее смесь бензола с этилацетатом (1: 2) со скоростью 1/4 об./об. ч. Элюат собирают в пробирки по 20 мл в каждой и содержимое каждой пробирки анализируют методом хроматографии в тонком слое, применяя активированную окись алюминия. Установлено что в ппобирках 60 - 80 содержится соединение Л,. Содержимое этих дроби528883 12 лученный порошок белого цвета перекристаллизовывают из горячего бензола. Получают соединение А, в виде кристаллического порошка белого цвета, Выход 700 мг.5Ф о р м ул а изобретенияСпособ получения антибиотиков группы лейкомицнна общей формулы С;, Сно н МО Н Н5 Н де Я 5 - С - СН,иН,Н Е г иф У,)ле(лев-С-СКг-СНС-СИ.-СЬг СНв )з Ь 15 отличающийся те 1 огпусез К 11 аза 1 оепз 1 з ют в водной питательн источники углерода и а ли н микроэлементы с20 ннсм целевого продукта Н, - СН, и - С -О условии 1 р то когда ставитель Г. Смирнова Техред 3, Тараненко Корректор Л. Брахни евятко едакт аказ 1896/4 Изд. Мд 334 Тираж 575 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Минис по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рау(5(сдя ндо д. 4, дписное в ССС 55(поГр;(ф)555, 5511, СЗ(515вд, 2 рок объединяют, высушивают под вакуумом и полученный остаток растворяют в 30 мл бензола, Раствор выливают в хроматографическую колонку диаметром 5 см, наполненную 350 г смеси силикагеля с бензолом. Колонку элюируют системой растворителей бензол, ацетон 13: 1), содержимое пробирок 150 - 170 объединяют н высушивают под вакуумом. ПоН Н0 Н С 11 О гно Сн,м, что культуру ЯгерМКК 1. 2486 выращиваой среде, содержащей зота, минеральные сопоследующнм выделе- известными приемами.