Способ получения 5 3 2-2, 2, 2-трифторэтил-гуанидин -пиразол-1-ил -валерамида

,. ЯО 123379 31 3 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ПИСАНПАТЕНТУ БРЕТЕНИ(54) (57) СПОСОБ ПО -(2,2,2-ТРИФТОРЭТИЛ ЗОЛ-ИЛ)-ВАЛЕРА 11 ИДА щ и й с я тем, чт трифторэтил)-гуани ронитрил подвергаю центрированной сер У 1,9ал ИндастризАмериказ ИнкЕллин (ПЯ) и 88.8)ритании У 2052478,опублик. 1980.(72) Тобиас Орегонвид Джон Гилман (СВ12337 Изобретение относится к получению биологически активных веществ, в частности к способу получения 5- - 13- 2-(2,2,2-трифторэтил)-гуанидин-пиразол-ил 3-валерамида, являюшегося антагонистом гистамина Ни ингибирующего секрецию кислоты желудочного сока.Известно, что физиологически активное соединение гистамин, который образуется в организме животных, способен в процессе проявления его активности соединяться с некоторыми специфическими рецепторами, из которых известны по меньшей мере два определенньгх и отличных один от другого типа. Первый носит название рецептор Н-, и действие гтлстамина на данный рецептор блокируется (антагонизируется) классическими антигистаминовыми лекарствами, такими как мепирамин, Второй рецептор гистамина носит название рецептор Н, и действие гистамина. на данный рецептор блокируется такими лекарствами, как циметидин, Одним из результатов блокирования действия гистамина на рецептор Нявляется ингибирование секреции кислоты желудочного сока, и соединение, обладающее такой способностью, находит применение для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и других заболеваний, вызванных раздражением за счет желудочной кислотностиЦель изобретения - разработка способа получения нового соединения, являющегося активным антагонистом гистамина Ни сильно ингибирующего секрецию кислоты желудочного сока О 35 4 О П р и м е р, 5-(3- 2-(2 р 2 у 2-Тртлфторэтил)-гуанидино 1 -пиразол-ил 1- валеронитрил (13 г) добавляют в те - чение 10 мин к концентрированной сер ной кислоте (65 мл) при одновременном перемешивании. Полученный раствор поддерживают при 20 С в течение 18 ч и затем разбавляют льдом (300 мл) и подщелачивают с помощью 10,8 н, 50 гидрата окиси натрия,цо достижения рН 9, Смесь экстрагируют этилацетатом (Зх 200 мл), экстракт высушивают (над сульфатом магния) и выпаривают в вакууме до получения в остатке 55 масла, которое кристаллизуется, Сырой продукт перекристаллизовывают из Е:ОАс, в результате чего получают 99 27,2 т 5- 3- 2-(2,2,2-три торэтил)гуанидино - пиразолв ил в валер,т. гпт, 130 С. ЯМР-спектр (1 БМСО):7,4 (с 1, 11-); 5)65 (д, 1 Н), 4,0 (гп,4 Н); 2, (г., 2 Н); 2,6 (гп) 4 Н),Исходный м;ттериал поттучают следующим образом,Гидрид натрия в виде пастообразной массы (6,16 г 61 мас,%-ной суспензии в жидком парафине) вводят отдельными порциями в течение 30 минв раствор 3-нитропиразопа (17,4 г)в обезвоженном диметилформамиде(150 мл) с внешним охлаждением льдомс целью поддержания температуры раствора 20-30 С. Смесь перемептивают втечение 45 мин и к почти прозрачномураствору добавляют 5-бромвалеронитрил(25 г) в течение 30 мин при 25-30 С,затем смесь перемешивают в течение4 ч. Добавляют воду (450 мл) иЕгОАс (450 мл), верхний слой отделяют, высушивают (над М 804) и выпаривают в вакууме до получения в остатке масла, которое представляет собойсмесь 5-(3-нитропиразол-ил) -валеронитрила и 5-(5-нитропиразол-ил)-валеронитрила. Это масло разделяют надве (пс 15 г) порции, которые фракционируют, пропуская их через колонкус силикагелем (диаметр 3,5 см, длина100 см). Элюирование осуществляетсяпри давлении 2 атм смесью этилацетатпетролейный эфир (т. кип. 60-80 С)в соотношении 3:7 (об,). Сначала элюируется 3:5 изомер, а затем 1:3 изомер, Получаемый 5-(3-нитропиразол-ил)-валеронитрил имеет т, пл. 3233 С.К раствору 5-(3-нитропиразол-в(1,8 г), Смесь перемешивают при 20 Св атмосфере водорода. В течение 4 чабсорбируется 3,2 л водорода. Катализатор отфильтровываттт, фи:тьтратзьптаривают в вакууме, в результатечего получается 5-(3-аминолиразол - 1-ил)-валеронитрил в виде масла,В раствор 5-(3-аминопиразол-ил)"валеронитрила (7,0 г) в ацетоттитриле ,25 мл) вводят 2,2,2-трифторэтипизотиоцианат (6,02 т.). Спустя15 мин растворитель выпаривают ввакууме, в результате чет о получает гся 5- 13- 3-(2,2,2-трифторэтил) -тиоуроидо 1-пиразол-ил-валероыит 12337995О 5 го рил в виде белого кристаллическоготвердого вещества, т. пл, 96-98 С.Указанную тиомочевину (12,5 г)растворяют в 8 М растворе аммиака вЕВОН (120 мл), К раствору добавляютокись ртути (12,8 г) и смесь перемеошивают при 20 С в течение 30 мин.Полученную смесь фильтруют, фильтратвыпаривают в вакууме, в результатечего получается 5- 13- 2-(2,2,2-трифторэтил)-гуанидино-пиразол-илвалеронитрил в виде масла, Образецэтого масла растворяют в ацетоне идобавляют 5 М эквиваленты малеиновойкислоты. К образующемуся прозрачномураствору добавляют диэтиловый эфир,в результате чего получается крйсоталлический малеат, т. пл. 123-125 С.Кроме того, 5-3-2-(2,2,2-трифторэтил)-гуанидино 1-пиразол-ил)-валеронитрил может быть получен в результате реакции 3-аминопиразола с2,2,2-трифторэтилизотиоцианатом, реакции полученной тиомочевины с аммиаком в присутствии окиси ртути и алкилирования у атома азота в 1-м положении 3- 2-(2,2,2-трифторэтил)-гуанидино-пиразола с 5-бромвалеронитрилом,Активность антагониста гистаминаН.может быть продемонстрирована посредством стандартных испытанийпредложенного соединения ингибировать вызванную гистамином положительную хронотропную ответную реакциюпри спонтанном биении правого предсердия морских свинок или по способности этого соединения ингибироватьвызванное гистамином поглощение аминопирина в кислотное пространствопариетальных клеток (т.е. обкладочных клеток желез желудка).Испытания на морских свинках осуществляют следующим образом,Правое предсердие морской свинкиподвешивают с натяжением 1 г (изометрическое натяжение) в тканевойванне с термостатическим регулированием (80 С) емкостью 25 мм, содержащей насьпценный кислородом (957. 057 СО) буфер КгеЬз-НеЬзеХе 1 (рН 7,4),Ткань стабилизируют в течение 1 ч,и в течение этого времени ее промывают 2-4 раза, Отдельные сокращениярегистрируют посредством датчика силового смещения с использованием измерителя деформации, мгновенные частоты сокрашения регистрируют пос 25 30 35 40 45 50 редством кардиотахометра, Получаютзначение контрольной ответной реакции на 1 мкмоль гистамина, послечего ткань промывают три раза и сноваприводят в равновесное состояние доосновного показателя частоты, Послеустановления равновесия, длящегося15 мин, вводят испытываемое соединение по желаемой конечной концентрации, Через 1 О мин после введения соединения снова вводят гистамин(1 мкмоль) и ответную реакцию нагистамин в присутствии антагонистасравнивают с контрольной ответнойреакцией на гистамин. Результат выражен в процентах от контрольной реакции на гистамин, После этого стандартными методами определяют кажущуюся константу диссоциации антагониста гистамина Н. Испытание с аминопропином осуществляют следующим образом.Удаляют слизистую оболочку желудка из мьппц дна желудка и промывают ее в буфере 1 (содержащем 1 л раствора, г: ИаС 7 8,007; КСУ 0,201; Ма НР 04 0,113; КН 2 РО 0,204; СаСУ 2 Н 0 0,132; М 8 С 2 0,101; глюкоза 1 с регулированием рН до 7,4 посредством ИаОН). Ткань тонко измельчают, суспензируют в буфере и промывают три раза буфером 1, Затем ткань суспензируют в диспергирующей среде (Коллагеназа ( 81 еша СЬеппса 1 Со Тип У;100 мг) и альбумин коровьей сыворотки (МЬз ЬаЪагагог 1 ез ЬМ, фракция-У;100 мг (в 100 мл буфера 1) в количестве 50 мл на 10 г чистого веса ткани, и термостатируют при 30 С и рН 7,4 (поддерживается путем непрерывного регулирования) при перемешивании в атмосфере кислорода. Через несколько минут ткани дают возможность осесть и поверхностный жидкостный слой удаляют. Вводят свежую .порцию диспергирующей среды и продолжают термостатирование с использованием ткани, которая в большей своей части диспергируется в железы и целые клетки через 40-60 мин. Оставшиеся большие кусочки ткани удаляют путем фильтрации через нейлоновую сетку. Смесь желез и клеток центрифугируют при 200 я и суспензируют в буФере 1, содержащем 1 Ж альбумина коровьей сыворотки (МдУез ЕаЬогагогез ЬМ, Фракция У). Затем железы и клет 1233799ки промывают три раза буфером 1 и суспенэируют в буфере 2, содержащем ТадЪ МЕМ (500 мл), Апротин ( Я 1.Вша СЬеппса 1 Со, 10 мг) и НЕРЕЯ (т.е.2-14-(2-оксиэтил) пипераэин-ил этансульфокислоты ; 150 ммоль; 20 мл), при поддержании рН ,4 посредством БаОН (150 мл на 10 г чистого веса ткани). Эту тканевую суспензию 1 О перемешивают в атмосфере кислородаопри 32 С в течение по меньшей мере 1 ч, после чего ее можно испольэовать.тканевую суспензию термостатируют 15 вместе с испытуемым соединением и аминопирином (10 мкмоль), меченым С в диметиламиновой группе (0,1 мк дюйм 5/мл), в течение 20 мин. Затем поглощение амидопирина стимулируют 20 путем добавления гистамина и ингибитора фосфодиэстеразы ТСТ 63197 до конечных концентраций 10 и 5 х 107 моля соответственно. По истечении 18 мин клетки/железы извлекают иэ 25 термостатированной среды путем фильтрации суспензии через стеклянный микрофибрильный фильтр. Клетки / железы быстро (в течение менее чем 10 с) промывают три раза буфером 1, ЗО охлажденным льдом. Аминопирин, меченый С , удерживаемый тканью, изменряют с помощью сцинтилляционного счетчика и степень ингибирования поглощения испытываемьм соединением рассчитывают путем сопоставления с контрольным образцом. Затем с помощью графиков, полученных в ряде испытаний, проводимых при различных концентрациях, рассчитывают концентрацию испытуемого соединения, дающую ингибирование на 50 Е.Предлагаемое соединение испытывают либо в экспериментах с предсердием морских свинок, либо в экспериментах с аминопирином. Это соединение, подвергнутое испытанию в экспериментах с предсердием морских свинок, является активным и при концентрации в тканевой ванне 1 О мкмоль 5 О или ниже показывает полное ингибирование ответной реакции при этой концентрации. Все соединения, подвергнутые испытанию в экспериментах с аминопирином, показывают 503-ное 55 ингибирование поглощения аминопиридина при концентрации 3 мкмоль или менее. Ингибирование секреции кислоты желудочного сока демонстрируют стандартными испытаниями, например по способности соединения при вводе его путем внутривенной инъекции, через желудок или через рот, ингибировать секрецию кислотного желудочного сока, например, у крыс или собак, у которых имеется желудочный свищ или денервированные углубления дна желудка и у которых секреция желу,дочного сока стимулируется путем ввода секретогенного агента, например гистамина, пентагастрина, бетанехола или пищи.Испытание на крысах проводят следующим образомСамок крыс (весом 200-230 г) анестезируют путем внутримьнпечного вво,ца уретана (1,5 г/кг), в трахею вводят полую хирургическую иглу. Гибкую трубку пропускают через пищевод в желудок и укрепляют ее путем стягивания в области шеи. Многодырочную пластмассовую трубку (диаметром 3 мм) пропускают в полостную зону желудка через надрез в двенадцатиперстной кишке и закрепляют, привязывая ее поаредством хирургической нити к привратнику желудка, Солевой раствор (9 г/л ИаСХ) пропускают через желудок (посредством вставленной в пищевод полой иглы) со скоростью 7 мл/мин, извлекают его из пилорического отвода через каждые 10 мин и собирают в химических стаканах. Секрецию кислоты стимулируют путем подкожного ввода специфического агониста Ндимаприта, вводимого дозой 10 мг/кг, с последующим вливанием 30 мг/кг. ч. Выделение кислоты рассчитывают путем титрования 20 ммоль гидрата. окиси натрия 10-минутных образцов до конечного значения рН б,4 (выделяемых в течение 10 мин).Когда секреция достигает постоянного эначеаия (плато на кривой - три последовательных показания с расхождением в пределах 57), испытуемое соединение вводится путем внутривенной инъекции через полую иглу, введенную в левую наружную яремную вену. Затем измеряют секрецию в течение последующих 2 ч. Приготавливают основной раствор каждого испытуемого соединения (1 О мг/мл в диметилсульфоксиде) и разбавляют соответствующим образом солевым раствором, такчтобы обеспечивалась возможность ввода в организм дозы 1 мг/кг (диметилсульфоксид ( 2%).Испытание на собаках с хроническим свищом осуществляют следующимобразом,3Испытания проводят на самках собак чистой бельгийской породы весом9-12 кг, имеющих хронический желудочный свищ. В течение ночи их некормят и лишь при желании дают воду.В ходе эксперимента собаки находятся в стоячем положении в слегкарасслабленном состоянии. При вводеиспытуемого соединения путем внутри-.венной инъекции свищ открывается, ипосле полного убеждения в том, чтобазальная секреция не происходит втечение 30 мин, начинают осуществлятьнепрерывное внутривенное вливаниесекретогенного агента (гистамина0,5 мкмоль/кгч или пентагастрина 2 мкг/кг ч) в солевом растворе(15 мл/ч) . Пробы желудочной кислотысобирают каждые 15 мин. Измеряютобъем каждой пробы, 1-миллилитровуюаликвотную пробу титруют до нейтральной 100 ммоль ИаОН с целью определения концентрации кислоты. 1(огда достигается постоянная секреция (платокривой; 1-2 ч), путем внутривеннойинъекции вводят испытуемое соединение в солевом растворе и пробы кислоты желудочного сока собирают в течение дальнейших 23 ч, в ходе чего непрерывно продолжается вливание секретогенного агента.При исследовании испытуемого соединения путем внутрижелудочного ввода после полной убежденности в отсутствии базальной секреции в течение 30 мин испытуемое соединение,содержащееся в 25 мл 0,5%-ной(мас./об,) оксипропилметилцеллюлозыи 0,1%-ного (мас./об,) Твина 80 вводе, вливается по каплям в желудокчерез доэируюшую пробку, вставленнуюв свиш,. Спустя 1 ч свищ снова открывается, и тотчас начинается вливаниесекретогенного агента, Пробы кислотыжелудочного сока измеряют и приближение секреции кислоты к постоянному значению сравнивают с приближением секреции кислоты к постоянномузначению для контрольного животного,в организм которого вводят путемвнутрижелудочного вливания лишьодин носитель. При изучении испытуемого соединения, вводимого через рот, оно используется в форме желатиновых капсул вместе с 15 мл воды. Через 1 чпосле ввода свищ открывается, итотчас начинается внутривенное вливание секретогенного агента. Пробыжелудочной кислоть 1 измеряют и приближение секреции кислоты к постоян 1 О ному значению (к плато кривой) сравкивают с приближением секреции дляконтрольного животного, з котороене вводилось испытуемое соединение,Испытачие на собаках с денервированным углублением дна желудка осуществляют следующим образом,Испытания проводят на самках собак коротконогой гончей породы весом 14-22 кг. Денервированные углубления в области железы дна желудкау этих собак получаются при подготовке их к испытаниям способом Кцс 11 с 1 и др, В течение 4-б нед животные поправляются от операции, и в дальнейший период в течение 2-3 мес до обычного использования проводится подготовка таблиц и нормализация секреторных реакций. Собак не кормят в течение 23 ч перед эксперимен-. том (по желанию дают воду) и в процессе эксперимента повязку, которой они перевязаны, расслабляют , После промывки углубления теплой водой путем подкожной инъекции вливают гистамин со скоростью 10 мкг/мин. Такая доза приводит к менее чем максимальному (б 0-90% от максимального) увеличению выделения кислоты при всех используемых дозах, Выделения желудочного сока из углубления собирают через каждыс 15 мин в градуированные стеклянные пробирки и измеряют объем секреторных выделений, приближающийся в 01 мл. Пробу в количестзе 500 мкл разбавляют 5 мл солевого растзора и рН доводят до 7,0 с помощью 100 ммсль ИаОН, Общее выделение кислоты рассчитывают как произведение концентрации кислоты на объем выделенного желудочного сока. Испытуемые соединения вводятся внутривенно (0,1 мл/кг) через лучевую подкожную вену или через рот в виде желатиновой капсулы после достижения постоянной секреции (расхождение в трех последовательных показаниях в пределах 10%). Секрецию измеряют в течение 3 ч после ввода испытуемогосоединения1233799 Составитель И. КуликоваТехред И,Попович Корректор Е. Сирохман Редактор В, Петраш Заказ 2787/59 Тираж 379 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Результаты, полученные при испытании на предсердии и с использованием Ъминопирина, позволяют предсказать активность данных соединений. При испытаниях на собаках и крысах не обнаружено явной токсичности или побочных эффектов данного соединения.В соответствии с указанной методикой соединение, полученное предложенным способом, активно в концентрации 0,0036 мкМ,а известное 0,29 мкМ.