Способ получения антибиотика в 508

Ссноз Советских Социапистичееиик Реснублик(22) Заявлено 290 б,77 (21)2497857/28-13 (23) Приоритет - (32) 30,06,7 б С 12 Р 9/00 Гоеуларетиенный комитет ГССР но неоич изобретений и отирнтнй( ) вториДжон Генри Эдвард Джеймс Мартин и Картин Роуд Херцизобретения(США) Иностранная фирматАмерикан Пианамид Компани (США)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА В Ь 508 Ь технической литературе не описан,Предлагаемый способ получения5 антибиотика формулы СН СНН Н СНз бот к и ЯЪъдто 5 сор 1 с о 5 МИ-метил-И-нитро-И-нитрШтамм депонирован вкультур Северного отделпользованию исследовансельскохозяйственногоСША, и Пеории, Иллиной дИНВ Ь 8180 аКультурально-морфологиче скиЗО признаки. Изобретение относится к области микробиологии и касается синтеза нового антибиотика, способ получения которого в патентной и научноНО заключается в том, что штамм Ыгерпззсеь Мдгоэсор 1 сць 818выращивают в азробных условиях вжидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выдлением целевого продукта.Штамм 51. 1 эдгоэсор 1 соэ 8180дуцент антибиотиКа в 4508 б, являся мутантом, полученным путем обр ЮЬ 5647 оэогуаниди лаборато ения по ий и раэв Департаме с по ном5 О На агаре с овсяными хлопьями Кастера воздушный ммцелий дает спороносные ветви, оканчивающиеся плотносвернутыми слиралями из несколькихвитков. Споры большей частью некруглйе, сустанчатой Формы, Размер спор0,6-0,8 мкм, Поверхность спор гладкая. Оболочки спор тонко морщинистые,Агар Чапека, Рост слабый. Следабеловатого воздушного мицелия, Спорообразования нет, Растворимый пигмент отсутствует, Субстрактный мицелий от бесцнетного до белонатого,Среда с дрожжевым экстрактом,Рост хороший, Воздушный мицелий беловатый, от светло- до темно-коричневого в зонах спорообраэонания.Спорообразонание обильное. Растворимыйпигмент желтоватый, Субстрактный мицелий желтый, Черноватые гигроскопические поверхности в центральныхзонах колоний.Среда с аспарагином-декстроэой,Рост умеренный. Воздушный мицелийбеловатый, от пепельного до светлокоричневого в зонах спорообразования. Спорообраэование умеренное.Растворимый пигмент отсутствуетСубстрактный мицелий желтый, Черноватые гигроскопические поверхностин центральных зонах колоний,Среда с крахмалом, Рост умеренныйВоздушный мицелий от беловатого дожелтоватого, от светло- до темнокоричневого в зонах спорообразонанияСпорообраэонание обильное, Растворимый пигмент отсутствует. Субстрактный мицелий пастельно-желтый, Черноватые гигроскопические поверхности нцентральных зонах колоний,Агар Беннета, Рост умеренный, Воздушный мицелий беловатый Темно-коричневый в зонах спорообразования.Растворимый пигмент желтоватый,Субстрактный мицелий желтый, Черноватые гигроскопические поверхностив центральных зонах колоний,Агар-картофель-декстроза, Ростхороший, Воздушный мицелий от беловатого до желтоватого, от пепельного до светло-коричненого в зонахспорообраэования, Спорообраэованиеумеренное. Растворимый пигмент желтоватый, светлый, Субстрактный мицелий желтовато-зеленый, Черноватыегигроскопические поверхности вцентральных зонах колоний,Физиолого-биохимические признаки.Нитраты восстанавливает н нитриты. Желатину разжижает полностью,Меланоидных пигментов не образует .На седьмые сутки молоко пентонизирует полностью,Переносимость НаС 1 в культуральной среде 7-10,Хорошо усваивает адонитол, д -галактоэу, д -Фруктозу, д -рафинозу,салицин, д "ксилозу и декстрозу,5 1 О 15 20 25 40 Плохо усваивает д-мелезитозу, д -мелибиоэу, Не усваивает 1 -арабиноэу,1-инозитол, лактозу, д-маннитол,-рамнозу, сахароэу и д -трегалозу,Культивирование штаммаЯ.Иугоэсор 1 аоэ ийнь 8180 пронодятв очень разнообразных средах, содер- .жащих усваиваемые источники углерода, например, крахмал, сахар, мелассу, глицерин, азотанапример белок,белковый гидролизат, полипептиды,аминокислоты, кукурузный настой,минеральные соли, например соли калиянатрия, кальция, сульфаты, Фосфаты,хлориды. Микроэлементы, напримербор, молибден, медь поступают нместес другими компонентами среды, Аэриронание проводят поверхностным илиглубинным методом при перемешинаниимеханической мешалкой, иногда с добавлением антивспенивателя например1% октадеканола в олеомаргарине,Посевной материал И.Ищг оэсор(.сизготовят путем заражения 100-мл порций стерильной среды н 500-мя колбах соскаблинанием или смываниемспор с косого агара культуры. Обычно применяют следующую .среду,нес.Ф:Соевая мука 1,0Глюкоза 2,0Кукурузный настой 0,5Карбонат кальция 0,3Вода Остальное,Колби инкубируют при 25-29 С,предпочтительно при 28 С, и интенсивно взбалтынают н течение 48-96 ч.Двумя 100-мл порциями посевногоматериала засевают 12 л стерильнойсреды н 20-л бутылях и перемешиваютпри аэрации и 25-29 С,предпочтительно 28 С в теченне 36-64 ч,Полученным материалом засевают300 л той же стерильной среды вферментере, перемешивают в течение36-64 ч при 25-29 С, предпочтительно при 28 фС, и аэрации .Этот посевной материал использу"ют для засенания 4000- л Ферментерасодержащего 3000 л стерильной среды,имеющей следующий состав, нес.%:Кукурузный настой 0,5Соевая мука 1,0Крахмал кукурузный 4,0Карбонат кальция 0,1Вода Остальное,Эту среду Ферментируют 100-200 чпри 27-32 С, перемешинании мешалкойи аэрации 0,4-0,8 л воздуха вминна 1 л сред), Добавляют антинспениватель, например Ходаг ГЭ 82, в количестве 1,3 ч. на 1000 ч, средыПолученную массУ, содержащую антибиотик В 4 508 а, смешивают с половинным объемом этилацетата и перемешивают 2-3 ч, Добавляют 8 диатомитовой земли, фильтруют на рамномфильтрпрессе, Фильтровальный жмыхпромывают н фильтрпрессе этилацетатом, Фильтрат и промывки концентри 715034руют до сиропообразного состояния,перемешивают с двойным объемом гептака и оставляют на ночь при 4 СВерхний слой декантируют и концентрируют до получения смолистого остатка,Смолистый остаток обрабатывают10 л метанола и несколько часов охлаждают сухим льдом, Фильтруют через спеченное стекло покрытое диатомитовой землей, и промывают холодным метанолом. Метанольный растворконцентрируют в вакууме досуха, остаток растворяют в хлористом метилене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненную активированным углем (1 л угля на 50 г загрузки), элюат концентрируют досуха, остаток смешивают с метанолом, охлаждают сухим льдом в течение 15 мин до-10 С, застывшее масло отфильтронывают, Фильтрат концентрируют в вакууме досуха и получают масло,Это масло растворяют в минимальном количестве хлористого метилена,смешивают с силикагелем, упариваютдосуха и загружают в колонку с су-,хим силикагелем, Элюируют сначала10-ным, а затем 20-ным растворомэтилацетата в бензоле, колонке даютстечь, делят ее на 10 равных частей(включая загрузку)образцы насадкиотбираюг при ) 005 010,35 и т,д, по длине всей колонки иэлюируют подходящим объемом смесиэтилацетат - хлористый метилен-метанол (3:2:1) . В местах, где полосыантибиотика накладываются, отбор производят через каждую 1/8%, Наличие антибиотика устанавливают по данным ТСХ и по обугливанию в присутствии серной кислоты,Образцы 10,11-0,35 вырезают из колонки и взмучивают в смеси этилацетат -хлористый метилен-метанол (2;2;1 по объему), фильтруют, промывают смесью растворителей и концентрируют в вакууме досуха, Остаток растворяют в трет-бутаноле, фильтруют, лиофилизируют и получают пушистое .твердое вещество,Нижнюю фазу системы н-гептанэтилацетат-метанол-вода (3000:1500: :75:37 по объему) смешивают с диатомовитовой землей (на 800 г земли б 00 мл Фазы), загружают в колонну (диаметр 7,5 см) смесь 40 г диатрмитовой землей (на 800 г земли600 мл Фазы), загружают в колонкуи элюируют верхней фазой укаэаннойсистемы, отбирая Фракции по 25 мл.Наличие антибиотика во фракциях определяют методом ТСХ в системе хлороформ-зтилацетат и по обугливанию,Фракции 90-150 объединяют, концентрируют и получают антибиотикВЬ 5086,П р и м е р 1, Стерильную средУсодержащую, г: Соевая мука 1,0Глюкоза 2,0Кукурузный настой 0,5Карбонат кальция 0,3Вода До 100 млзаражают смытыми или соскобленными с косого агара спорамиЯС.ЪЕговсар(сов, Применяют .две500-мл колбы, содержащие по 100 мгуказанной среды, Колбы интенсивновзбалтывают 72 ч при 28 С,Полученный материал из 500-млколбы переводят в бутыль, содержащчс 12 л той же среды,и йерментируют 48 ч при 28 С и аэрации,Затем пересевают в Ферментер, содержащий 300 л той же стерильной.среды, и перемешивают (173 об/мин)при аэрации (3 л воздухана 1 л среды в 1 мин) в течение 48 ч при28 С поддерживая рН б,9-7,0,и р и м е р 2, Среду, содержащую, г:.Кукурузный настой 0,5Соевая мука 1,0Крахмал кукурузный 4,0Карбонат кальция 0,1Вода ,До 100 млстерилизуют при 120 С и рН 6,4-6,5в течение 60 мин. 3000 л среды засевают 300 л материала, полученногов примере 1, ферментируют при 2830 С, аэрации (О,б л воздуха на 1 лсреды в 1 мин) и перемешивании(150 об/мин) в присутствии 4 л антивспенивателя в течение 138,5 чв 4000-л Ферментере,П р и м е р 3, 2550 л (рН 7,4)массы после ферментации, полученной,как в примере 2, и 1275 л этилацетата перемешивают 2,5 ч, Добавляют 8диатомнтовой земли, Фильтруют несколькими порциями на паре рамныхФильтрпрессов, Фильтрату (3250 л)дают отстояться и отделяют этилацетатный слой (1000 л) . После Фильтрования каждой порции жмых промываютн фильтрпрессе этилацетатом, Промывки объединяют, дают им отстояться иотделяют этилацетатный слой (535 л)Эгилацетатные слои концентрируютсначала до 25 л, затем до 20 л,Эти20 л концентрируют в стеклянном дистилляционном аппарате до получениясиропа,Сироп выдерживают 48 ч при 4 С,перемешивают с двойным объемом гептана и оставляют на ночь пои 4 С,Верхний слой отделяют декантациейи концентрируют до получения смолистого остатка,К смолистоМУ остатку добавляют10 л метанола, охлаждают сухим льдомнесколько часов, фильтруют черезспеченное стекло, покрытое диатомитовой землей, и промывают холоднымметанолом. Объединенные фильтратыи промывки концентрируют досуха ввакууме и получают 1353,6 г остатка.1353 6 г остатка растворяют вхлористом метилене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненную27,07 зернистого угля (О х 40 меш),со скоростью 375-400 мл/мин. Элюатконцентрируют досуха, остаток .-10 С Застывшее масло отфильтровывают, Фильтрат концентрируют досуха и получают 781,4 г масла,200 г масла растворяют в минимальном количестве хлористого ацетилена,добавляют 300 г,силикагеля, тшательно перемешивают, упаривают в вакууме досуха и, загружают в пластмассовую колонку, заполненную 4 кг силикагеля, сверху кладут немного морс"кого песка для предупреждения нарушения слоя во эредия элюирования,Элюируют 12 л 10-ного раствораэтилацетата в бензоле, колонке даютстечь и элюируют 7,6 л 20-ногораствора этилацетата в бензоле, Отбирают Фракции, дают колонке стечь,и продувают азотом,Для определенйяантибиотической активности Фракциииспользуют 51 ге р 1 ососсцэ ришадепеэ.Колонку делят на 10 равных частей(включая загрузку), Образцы насадкиотбирают при Му 0,05, 0,15, О 25,0,35 и т,д, по длине всей колонки,В местах, где полосы антибиотиканакладываются, отбор производят через каждую 1/8 йу, Каждый образецзлюируют 10 мл смеси этилацетатхлористый метилен-метанол (2:2;1) ипо данным ТСХ в системе этилацетатхлороформ (1:1) и по обугливанию вприсутствии серной кислоты определяют наличие антибиотика,Образ цы с ВО, 11-О, 3 5 вырез ают и эколонки и взмучивают в смеси этилацетат-хлористый. метилен-метанол (2::2:1),фильтруют, промывают этой жесмесью растворителей и концентрируют в вакууме досуха,. Остаток растворяют в трет-бутаноле лиооилиэируюти получают 26,7 г продукта,600 мп нижней фазы системы н-гептан-метанол-этилацетат-вода (3000;1500:75:37 по объему) и 800 г промытой кислотой диатомнтовой земли смешивают, загружают в стеклянную колонку смесь, состояшую из 40 г диатомитовой земли, ЗО мл нижней фазыукаэанной системы и 13,8 г лиофилизированного продукта, элюируютверхней Фазой указанной системырастворителей и собирают фракции по25 мл, которые анализируют методомТСХ, Фракции 90-150 объединяют и получают 2, 75 г антибиотика ВЬ 508 ьв виде натриевой соли,П р и м е р 4. Смешивают 600 млнижней фазы системы гептанметанолэтилацетат-вода (3000:1500;80:40 пообъему) и 800 г диатомитовой земли,В колонку загружают смесь 28 г диатомитовой земли, 21 мл указаннойнижней Фазы, 10,9 г антибиотикаВ),508 Ь в виде натриевой соли, элюируют верхней Фазой укаэанной системы, отбирая фракции по 90 мл. Поданным ТСХ на пластинках СилплейтГ = 22 в системе этилацетат-хлороФорм и па обугливанию судят о наличии антибиртика, Фракции 29"39объединяют, концентрируют, твердый..остаток растворяют в трет-бутаноле,лнофнлизируют и получают 4,79 гпродукта,800 мг лиофилизированного продукта перемешивают с 300 мл смеси водаз Фнр-петролейный э Фир (2: 1: 1), Приперемешивании добавляют 1 н, соляную кислоту до рН 2,5, ОрганическуюФазу отделяют и три раза проькваютравными объемами воды, концентриру 20 ют в вакууме, остаток растворяютв трет-бутаноле, лиофилиэируют и получают 657 мг антибиотика ВЬ 508 ьв виде свободной ккслоты, 1,с 3Яб-ГГК-спектр, мкм: 2,95; 5,88;8,35 У 8,601 9,001 9,12 Р 3,43 У 9,62 У10,05 и 10,47,П р и м е р 5, 1 г антибиотикаЗ 0 В(,508 Ь в виде свободной кислоты растворяют в 300 мл смеси эфир-петролейный эфир (1:1), добавляют к200 мл воды, при перемешивании добавляют 0,1 н, соляную кислоту дорН 10,0, органическую фазу отделяют,концентрируют в вакууме,.остатокрастворяют в 10 мл эфира, добавляют20 мл петролейного эфира (30-70 С)и кристаллик натриевой соли антибиотика В 1 508 а, выдерживают при 4 С,40 кристаллы промывают холодным петролейным эфиром, сушат на воздухе иполучают 323 мг натриевой соли антибиотик БЬ 508 ь, т,пл, 157-161 С 1с 1 Я =Ф 6 1 (с = 1,52, метанол),45 Йайдено,%: С 60,99; Н 8,47Иа 1,95,ИК-спектр, мкм: 6,27 у 7,28; 9,0;9,13; 9,48 и 10,60П р и м е р 6. 1 г антибиотика50 В Ь 5 0 8 Ь в виде натри евой соли,834 мг п-бромфенацилбромида, 600 мгкарбоната лития и 20 мп сухого диметилформамида выдерживают 16 ч при37 С, добавляют 4-кратный объемхлороформа, фильтруют, фильтрат концентрируют в вакууме и получают сиропоподобный остаток, 90 мл нижнейфазы системы гептан-этилацетат-метанол-вода (200:25:1000:17) смешиваютсо 120 г диатомитовой земли, В колонку загружают сиропоподобный остаток,12 г диатомитовой земпи и 9 мл нижней Фазы указанной системы, элюируют верхней фазой, отбирая Фракциипо 10 мл, Активность фракций опреде 65 ляют методом ТСХ. Фракции 22-41715034 10 Молекулярн:.:Й ве;: моногпр.-;т; и-брсмфен ациловог о з фн р;. В. 508 а, определенный дифракцией рент пановских пулейравен 1 1 1 4038Предлагаемый способ позволяет получить антибиотик В508 ь, обладающий высокой активностью против кокковых инфекций теплокровных животных и невысокой токсичностью,Формула изобретения Способ получения антибиотика фор- мулы Н 0 Н. 0 (. питател О Т Л штамм.8180 в в жидк и й с я тем, что еэ Ьц озсор(сов. в аэробных условия ьной среде, содержашей источники углеродаминеральные соли, сшим выделением целедукта,азота и последую ого пр Составит ель С. Малютинкто Т Иа ганова Тех е О,Андрейко Тираж 522осударственного комитета ам изобретений и открыти Москва Ж"35 Ра ская н з 9327/63ПНИИПпо11303 4 5 л, Проектн ая, 4.объединяют и концентрируют в вакууме, остаток растворяют в 50 мл метанола и Фильтруют. Фильтрат нагревают на паровой бане, добавляют 10 млводы и дают медленно охладиться доо4 С. Получают 566 мг кристалловбромфенацилового эфира антибиотикаВ( 508 ь, Га 1 Д=+63 + 2 О (с 51, хлороформ) .Найдено,Ъ: С 58,80) Н 7,80;Вг 8,64,ИК-спектр . мкмжд 2,9 у 5,88 р 6,30 р8,208,45 у 8,60 у 9,00) 9,15 (широкая)9,37 (широкая)ф 9,62) 10,06 и 10 37,илиал ППП Патент, г, Ужгор Ко екто Я. Веселовская Подписное