Способ получения антибиотического комплекса

О П И С А Н И Е 352469ИЗОБРЕТЕНИЯ Соки Советских Социалистических РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патентаМ.Кл, С аявлено 23.17.1968 ( 1238501/315470 А/67, Италия иоритет 28.17.19 Комитет по делам обретеиий и открыти ри Совете Министров СССР(Италия) Иностранная фирма Сосиета фармацеутики Италиа-г л Заявите рда 11 т 0 библиот ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКО КОМПЛ ЕКСА2343 был выделен из образц; в г, Библосе (Ливан), штамаобразца почвы, отобранной в Пьемонте, штамм Г.1. 2501 - чвы, взятой в Нидер-Беербахг). Изобретение способу получен Известный с ние продуцецта аэробных усло среде, содержа и минеральныхШтамм Г 1,почвы, взятой Г.1. 2399 - и рисового поля из образца по Зексгейме (ФРбиологическому ков.ет культивироваЯгер 1 отпусе 1 ез в кой питательной и углерода, азота Н 5 - 8,8. относится к ия антибиоти особ включиз класса виях на жид щей источник солей, при р комплекса либаномицина Ацина С, в качтпусез 11 Ьап 1 иаэробных усреде, содержаи минеральне 72 в 1 часомплекс извест Для культивирования используют штаммы 5, 11 Ьап 1 Г.1. 2343, Г.1. 2399, Г.1. 2501 и Р,1.2521, зарегистрированные в 1 пзШц 1 е о 1 М 1 сгоЬ 1 ооду о 1 йе Кц 1 дег 1.1 пвегя 1 у (США) под номерами 1.М.К.Ь. 3915, 1.М.КЛ 1. 3916, 1.М.КЛ.1.3917 и 1.М.К.11, 3918 и в Сотпгпопжеай Мусо 1 орса 1 1 пзЯц 1 е, Реггу 1.апе, Кеъ, Ьеггеу (Великобритания) под номерами 1,М.1. 130777, 1,М,1. 130778, 1.М.1. 130779 и 1.М,1. 131233.Было обнаружено, что во встряхиваемой жидкой глубинной культуре они продуцируют антибиотический комплекс либаномицина. С целью полученияна, состоящего из лимицина В и либаномидуцента берут 51 гер 1 отивирование ведут вжидкой питательной сники углерода, азотапри 22 - 37 С в течениют антибиотический кемами. бацомици- либаноестве про, зр, кульчовиях на щей источых солей, и выделяными прпМорфологические признаки - общие длявсех штаммов, в то время как культуральцые 0 у отдельных штаммов несоклько отличаются. 1 ор фологп чески е п р из н а к15 В обычных культуральных средах вегетатцвный мицелпй состоит из более плц менее тонких, длинных, обильно ветвистых гиф толщиной 0,4 - 0,8 мк, образующих более толстые гц.фы толщиной 1 - 1,5 лтк. На этих гпфах цме ются короткие боковые и густые спиральныеветви, чередующиеся или расположенные дру 1 против друга с монополиальным ветвлением.Эти небольшие ветви в дальнейшем превращаются в цепи спор, которые в начале связа ны, а потом свободны, При наблюдении подэлектронным микроскопом споры имеют гладкую поверхность, которая бывает овальной или тйпичной почковидной, а зачастую и сфериче ской.30 Размеры спор (1,2 - 1,6)1,2 - 2,4) лк.352469 Таблицаальные свойства Культур Ш тамм Среда 2343 2399 2521 2501 Обильный налетЛимонный АгарБешета мицелий Лимонно-охристожелтыйБело. ореховый Воздушный мицелпйРастворимый пиг- мент ШоколадныйВинный Отсутствует Отсутствует РостВегетативныйспередисзади Порядочный налетСоломенный Порядочный налет Порядочный налетСоломенный Соломенньш Порядочный налетБесцветный АгарЧапека Соломенно.ли монныйГладкий, бельш Соломенный Винный Воздушный мицелийРастворимый пиг- мент Ореховьш, шоколадный Винного цвета Хлопковидпый,кремово-белыйОтсутствует Отсутствует Порядочцьш цапетБесцветный Порядочный налет Порядочный налетБесцветный Бесцветный РостВегетативныйспереди-мнцелий сзади Порядочный налетБесцветный Агараспарагицо - глю- козовый Соломепцьш Соломенно-лимонныйБелый - бело-оре- ховый Винный Хлопковый, серо- коричневый Гладкий, винно- коричпевыи Воздушный мице- лин Отсутствует Винного цвета Отсутствует Растворимый пиг. мент Обильный налет Охристо-желтьш Обильный налетОхристо . желтьш Обильный налет Охристо-желтый Обильный налет Охристо. желтый АгарЭмерсона Сильно - охристыйГладкий, белый Сильно-охристый Гладкий, белый Сильно-охристыйГладкий, белый Сильно-охристый Гладкий, белый Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует Обильный налетБесцветный Обильный налет Винцо-охристый Обильный налет Соломенно - жел- тый Обильный налетСоломенный Крахмал, соли и агар Хлопковидный,ореховыйГладкий, ореховый Светло - коричпе. вый Отсутствует Растворимый пиг- мент Винный Отсутствует Обильный налетЛимонный Обильный налет Винно-коричневыйОбильный налетЛимонный Обильный налетЛимонный Картофельный агар Сильно-лимонныйБеловато - светло.коричневыйОтсутствует Винно-коричневыцСильно-ореховый Винные Обильный налетБесцветный Обильньш налетСоломенный Обильный налетСоломенный Агар - овес Обильный налетСоломенный СоломенныйСерый - светло-коричневыйОтсутствует Винно-коричневый Бежево-светло-коричневый Каштановый ЛимонныйГладкий, ореховый БесцветныйХлопковый светло-коричневый Отсутствует Отсутствует РостВегетативцыйспередисзади РостЬегетат ивныйспереди мицелий сзади Воздушный мицелинРастворимый пиг- мент РостВегетативныйспереди мицелий сзади Воздушный мице- лий РостВегетативпыйспереди мицелий сзади Воздушный мнцелийРастворимый пиг- мент РостВегетативцыйспереди мицелий сзади Воздушный мицелийРастворимый пиг- мент Охристо - желтыйБеловато - корич.нево-ореховыйОтсутствует Обильный налет Соломенно-лимонныйЛимонно-охристожелтыйОрехово-серый Соломенного цветаХлопковидцый,светло - коричневыйОтсутствует Светло-зеленыйХлопковидныйсветло - корич.невыйОтсутствует Сильно-лимонный Коричневый - светло-серыйОтсутствует Обильный налетСоломенно-лимон.цыйЛимонно - винный Обильный налет Соломенно-лимонныййЛимонно - светлоохристыйБело - коричнево.серыйОтсутствует СоломенныйБело-бежево-серыйОтс тствует352469 Продолжение Культуральные свойства ШтаммСреда 23992501 2343 2521 Обильный налетВинно-розовый Обильный налетСоломенный Глицерин аснара. гин, агар РостВегетатнвныйспередимнцелий сзади Обильнын налетСоломенный Обильный налетСоломенный ВинныйВинно-коричневыйВинный Лимонный Соломенный Лимонно - соломенный Хлопковый, свет. ло.коричневый ОтсутствуетХлопковый, серокоричневыйОтсутствует Воздушный мнцелнйРастворимый пиг- мент Беловато - светлокоричневыйОтсутствует Обнльньш налетОхра желтая Обильный налетЛимонный Обильный налетЛимонный Дрожжевой экстракт, глюкоза, агар РостВегетатнвныйспереди мнцелий сзади Воздушный мнцелнйРастворимый пиг- мент Обильный налетОхра желтая Охра желтая Белый с корнчневымн оттенками Отсутствует Охра желтаяОреховый Охра желтаяСеро - коричневый Охра желтая Светло - коричневыйОтсутствует Отсутствует Отсутствует Культур альные и биохи ми чески е свойстваВ табл. 1 приведены культуральные свойства каждого рассматриваемого штамма, выращенного в пробирках и в чашках Петри при 28 С. Наблюдения производят через 6,15 и 25 дней после инокуляции. Культуральные признаки мало различаются у отдельных штаммов. Воздушный мицелий довольно гладкий у штамма Г.1. 2343, а иногда и у штамма Г.1.2501, и наоборот, хлопковидный в результате образования очень длинных спорофорных гиф у штаммов Г.1. 2399 и Г.1. 2521.Цвет воздушного мицелия белый у всех штаммов на одних органических средах и преимущественно светло-коричневый на других органических и синтетических средах, однако на последних штаммы Г.1. 2399 и Г.1. 2521 могут иметь также оттенки серого цвета. Кроме того, штамм Г.1. 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что производит пигмент красно-розового цвета, обусловливающего в известной степени также цвет вегетативного мицелия и, следовательно, цвет воздушного мицелия,,Помимо этого, штамм Г.1, 2501 отличается от остальных трех штаммов тем, что усваивает 1-арабинозу и не разжижает желатину.Рассматриваемые штаммы не восстанавливают нитраты до нитритов, не производят ни меланина, ни сероводорода. Они гидролизуют крахмал, сжижают желатину и используют тирозин. Штаммы Г.1. 2343 и Г.1. 2521 пептонизируют и коагулируют молоко, Штаммы Г.1.2399 и Г.1. 2501 коагулируют молоко но не пептонизируют его.Для выращивания штаммов применяют глюкозу, сахарозу, д-ксилозу, мезоинозит, д-маннозу, д-фруктозу, мальтозу и рафинозу.Рамнозу и 1-арабинозу не употребляют, хотя Г.1. 2501 усваивает 1-арабинозу. Все четыре штамма не растут при 50 С и не производят склероциев, в глубинной и встряхиваемой среде они производят антибиотический комплекс либаномицина. Идентификация штаммов 30 По приведенным свойствам рассматриваемые микроорганизмы можно отнести к роду Ягер 1 отусез, 1 Ча 1 згпап е 1 Неппс 1 (Вагдеуз Мапца о 1 Ре 1 егпцпа 11 уе Вас 1 ег 1 о 1 ор, 1957, 744 - 745; к разделу Ьр 1 га по Рпсйат е 1 а 1.35 (Арр, пцсгоЬ 1 о 1., 1958, стр. 5), Однако этиштаммы нельзя отнести ни к какой из серий и, следовательно, ни к какому из видов, перечисленных в этом разделе. В действительности, в этом таксоне серия, включающая вид с воз душным мнцелием коричневого цвета, характерного для штаммов Г.1. 2343, Г,1 2399, Г,1.2501 и Г.1. 2521, не предусмотрена. Эти микро.организмы нельзя отнести ни к какой из систематических групп, предложенных Юа 1 згпап 45 (ТЬе Ас 11 погпусе 1 ез, 1961, 2, 111 и 117), а также ни к какой из групп, предложенных Ва 1 дасс 1 (Ыогп. М 1 сгоЬ 1 о 1, 1958, 6, 10), потому что в этих таксонах серии или группы, включающие вегетативный мицелий желтого цвета и воз душный мицелий коричневого цвета, отсутствуют. По той же причине, они не могут быть отнесены как ни к систематическим группам, предложенным Г 1 а 1 д цпс 1 ппс 1 Кц 1 кпег (АгсЬ, МйгоЬ 1 о 1, 35, 1960, 105 - 138), так и ни к ви дам, описанным Кргссильниковым (Руководство для идентификации бактерий и актиномицетов, 1949 г., Моксва). Рассматриваемые микроорганизмы следует 60 отнести к новому виду, для которого предлагается название Югер(опусез 11 Ьап 1 и. зр,Для последовательных посевов микроорганизмы хранят в подходящей твердой среде для нли посредством лиофилизации их спор в мо локе.Таблица 2 д 1 и1 см Среда 1 мах, и ик 25 Метанол0,1 н. 1 ЧаОН в метаноле0,1 н. НС 1 в ме.таноле 244 и 284 245 и 283 100, 107 100, 102 284перегиб при 255 101 70 30 35 40 45 50 55 60 65 Источником углерода могут служить глюкоза, декстрин, крахмал, мука (соевая, кукурузная, пшеничная и т, п.), меласса, кукурузный экстракт, различные растительные масла и другие вещества, обычно применяемые для процессов брожения. Кроме вышеупомянутых комплексных азотсодержащих веществ, источником азота могут служить казеиц, гидролизат казеина, барда и аммонийные соли, например сульфат, фосфат, хлорид аммония, и другие вещества, обычно применяемые для этой цели. Выбор минеральных солей зависит от используемой среды. Углекислый кальций почти всегда применяется. Могут быть добавлены также хлористый, серцокислый цлц фосфорнокислый натрий, соли калия, магния, железа, цинка и меди.Брожение можно проводить в колбах Эрлен- мейера, в лабораторных, заводских ферментерах различной емкости,Комплекс либаномицина состоит из трех веществ, обладающих очень сходными между собой физико-химическими и биологическими свойствами, Этим веществам присвоены назва ния либаномицин А, либаномицин В и либаномицин С.Антибиотическую активность бульонов и сы рых продуктов определяют на чувствительном микроорганизме и сравнивают с активностью образцов, содержащих значительные количества антибиотика.Содержание антибиотика в сырье определяют также спектрофотометрировацием метанольных растворов при 284 имк,По окончании брожения антибиотический комплекс либаномицина, находящийся преимущественно в мицелии, экстрагируют подходящим растворителем, например спиртом или водным ацетоном, и осаждают, Полученный осадок антибиотического комплекса очищают и разделяют на либацомицицы А, В и С с помощью хроматографии.Например, мицелий экстрагируют спиртом или водным ацетоном, концентрируют экстракты до небольшого объема, осаждают сырой продукт, который промыгают водой, сушат хлористым кальцием и промывают безводным ацетоном, Всплывающий слой и промывные воды после промывки сырого продукта приливают к профильтрованным бульонам, для выделения активного продукта из которых используют бутиловый спирт при рН 7,5 - 8,5 цли катионообмеццую карбоксильцую смолу в Н-форме, Полученные бутанольные экстракты после промывки водой и упаривания до небольшого объема обрабатывают ацетоном или диэтиловым эфиром, получая активный сырой продукт. При использовании смол после адсорбции и промывки смолы водой и 0,5 н. раствором аммиака активный продукт элюируют водно-спиртовым раствором соли, например 3%-ным раствором хлористого натрия в метаноле (1: 3) .Антибиотический комплекс получают из активных элюатов после упаривапия, экстрагирования бутиловым спиртом при рН 7,5 - 8,5 и осаждения экстракта ацетоном.Полученный сырой продукт (концентрация 50 - 70%) растворяют в низкомолекулярном спирте и хроматографируют на колонке, заполненной нейтральным активированным глиноземом или силикагелем, Для элюирования используют спирт. Сначала получают либаномицин В, а затем либаномицины А и С. Из элюатов выделяют антибиотики в виде белого аморфного порошка, содержащего 90 - 95% активного ингредиента.Для анализа образцы антибиотиков дополнительно пропускают через колонку, заполненную порошком целлюлозы, элюируя смесью бутанол в пиридин в (6: 4; 3).Либаномицин А представляет собой аморфный порошок, т. пл. 152 - 154 С (разложение); Га =+62,5 (с=1, метанол). В УФ-спектре антибиотика обнаружены полосы поглощения, перечисленные в табл. 2. Найдено, %: С 63,12; Н 8,05; 1 х 1 6,49.Реакции с 1.еСз, КМпОх, Вг, положительны.В присутствии конц, серной кислоты антибиотик имеет синий цвет, который переходит в фиолетовый.Реакции Фелинга, нингридрина и Сакагучи отрицательны. При хроматографии на бумаге антибиотик выявляют реагентами Буртона для фенолов и энолов, и реагецтами Пан-Дутчера для амидов.С реагентами Эрлиха он дает желтое окрашивание,Либаномицин А хорошо растворяется в водных спиртах, водном ацетоне, пиридине, ДМФА и ДМСО; растворяется в метаноле (20,яг/мл) и этаноле (4,5 мг/мл) и плохо растворяется в воде (1 мг/мл при 20 С и 5 лг/ил при 50 С). Он не растворяется в ацетоне, хлороформе, бензоле, этиловом эфире и петролейцом эфире,Этот продукт быстро активируется в кислотах, стабилен при нейтральном или слабощелочном рН, ца свету, при комнатной температуре,Либаномицин В представляет собой белый аморфный порошок, т. пл. 155 - 160 С (разложение); 1 сс =+72 (с=1, метанол).Найдено, %: С 64,34: Н 8,42; 1 х 1 6,77,УФ-спектр и дру 1 гце физико-химические свойства либаномицина В такие же, как и у либаномицина А за исключением растворимости в этиловом спирте, которая выше для либаномицина В и составляет 10 иг/ил,352469 10 2,000 0,800 0,950 0,400 Обезвожеццая люцерна Дцкальцийфосфат Углекислый кальций Хлористый натрий Габбомикс Р без антибиотиковЖ-Метионин УФ-спектр либаномицины С не отличается от соответствующих спекторов либаномицинов А и В. При хроматографии на бумаге при комнатной температуре антибиотики выявляют биоавтографией на Вас. вцЬт 1118. Используемые 5 реагенты и Кг для соответствующих либаномицинов приведены в табл. 3. 0,500 0,032Таблица 3 Величина Дг для 10 либаномицинов Система растворителей для хроматографии(6: 4: 3)Бутанол, насыгценный буферным фосфатным раствором (1/15 М) при рН 3, на бума.ге, содержащей тот ке буферТо же, но с буфером прирН 5,4То же, но с буфером при рН 7 То же, но с буфером при рН 8 55,93 0,96 0,72 0,85 0,60 Продолкцтельцость опыта 30 дней. Резуль 20 таты опыта приведены в табл. 5. 0,75 0,55 Таблица 5 0,90 0,75 0,90 0,50 0,30 Привес оо Вес, кг Номер группы 25 цыплятпетушки куры куры петушки Антибиотик либо в виде комплекса либаномицина, либо в виде одного из трех его компонентов - либаномицина А, либаномицина В и либаномицина С, очень активно воздействует на животных и его целесообразно добавлять 30 в корм,0,481 0,511 0,510 0,492 0,515 0,534+8,53 П р и м е р 1. Две колбы емкостью 300 ллзаполняют 60,цл среды, содержащей (в %):Декстрцц 3,00 Казеин 0,50 35 Кукурузцый экстракт 0,30Углекислый кальций 0,40 Сернокцслый аммоний 0,10Дикалцйфосфат 0,01Вода водопроводная До 10040 Колбы стерилпзчот 20 цпн при 120 С, рНсрелы после стерилизации 6,8 - 7, В каждую колбу вносят 2 цг суспензцц спор, образующейся при промывке 5 ц.г дистиллированной волы цалета культуры, полученной из 20-днев 45 ного Г.1, 2343, выращенного на смеси картофель - глюкоза - агар в пробирке с косым среКолбы, размещенные ца ротационном встряхивателе (эксцецтрисцтет 3 с,ц, скорость50 225 об/.цан), термостатпруют 48 час при 28"Сц 2 .цл культуры ццокулируют в другие колбы емкостью 300 цл, солержащце 60 ц,а продуктивной среды следующего состава (в %);Крахмал 10,00055Сернокцслый аммонцй 0,300 Углекислый кальций 0,300 Обезжцрев 1 ая соеваямука 8,000Монокалийфосфат 0,75060 Хлористый натрий 0,250Сернокцслый магний 0,100 Сернокислый цинк 0,001 Сернокислое железо 0,001 Сернокпслая мель 0,001 Вода водопроводная До 100 Таблица 4 Диаметр пятен ингибирования, яя Микроорганизм 16 20 0 0 15 17 17 5. ацгеизВ. ацЫ 111 зЕ. со 1Р. чцдаг 1 зМусоЬас 1 егшгп зр., штамм 607МусоЬас 1 емигп рЬ 1 е 1СапдЫа а 1 Ьгсапз 65 ФармакологияВ табл. 4 приведены значения микробиологической активности комплекса либаномцццна (в растворе 1000 лкг/мл) в твердой среде. Токсичность либаномицица для мышей 1 г/кг при перроральном введении и 25 цг/кг при внутривенцом введении.Активность либаномицина определяют опытным путем на 180 цыплятах при содержании в клетках, Цыплят делят на три группы по 30 кур и петушков в каждой, Первая получает основной корм, вторая - основной корм и 1 г/г 1 либаномицина, третья - основной корм и 2 г/г 1 либаномицина.Состав основного корма (в %);Кукуруза 62,118 Соевая мука (44%-ная) 31,200 Рыбная мука 2,000 Химический состав корма (вВодаСырой протеинКлетчаткаЗолаВезазотцстыс экстрактцвные веществаКальцийг 1 осфор30 11Раствор стерилизуют 20 мин при 120 С. После стерилизации рН 5,8. Культуру термостатируют при 28 С со встряхиванием, как указано в примере 1, через 120 час получают 150 лкг/мл продукта. 10 л сброженного бульона фильтруют через 2 О/,-ный Суперсел, промывают водой и промывную жидкость приливают к профильтрованному бульону.Влажный мццелцй экстрагцруют сначала 3 л метанола, а затем 2 л 80%-цого водного метанола.Смешаццгяе экстракты концентрируют в вакууме до 1/10 (500 цл) первоначального обьема. Осадок отделяют, промывают водой, высушивают в течение ночи в вакууме цад хлористым кальцием при 20 С и в течение 4 час при 56 С над фосфорным ангидридом. Взвесь желто-коричневого порошка в безводном ацетоне фильтруют и осадок высушивают, Получают 1,2 г 70%-ного комплекса либаномиципа.Профильтрованный бульон подщелачивают до рН 8,5 10%-цым углекислым натрием, встряхивают 1 час, фильтруют и фильтрат (11 л) дважды экстрагируют 1 об, бутилового спирта. Экстракт промывают водой, концентрируют в вакууме до 50 лл с прибавлением 10 об. ацетона, Полученный осадок промывают ацетоном и высушивают. Из профильтрованного бульона получают 0,500 г 70%-ного активного сырого продукта.Пр им е р 2. Повторяют те же операции, что и в примере 1, но продуктивную фазу проводят на среде, содержащей (в %):Декстрин 4,00Казеиц 1,00Кукурузный экстракт 1,00Сернокислый аммоний 0,20 Углекислый кальций 0,50 Дикалийфосфат 0,01 Вода водопроводная До 100Раствор стерилизуют 20 мин при 120 С. После стерилизации рН 6,7 - 7, Раствор термостатируют при 28 С со встряхиванием, как в примере 1. Через 120 час получают 120 икг/лл продукта.П р и м е р 3. Порядок операций такой же, как в примере 1, но продуктивную фазу проводят на среде, содержащей (в %):Крахмал 2,00 Барда 1,75Хлористый натрий 0,25 Обезжиренная соевая мука 3,00 Соевое масло 08 дл Вода водопроводная До 100. рН доводят до 7,2 едким натром, после стерилизации рН около 6,7.Раствор стерилизуют 20 мин при 120 С, термостатируют при 28 С со встряхиванием, как в примере 1. После 120 час ипкубации получают 100 мкг/мл продукта,Пример 4. В колбу на 2000 .мл с тремя углублениями снаружи, образующими трц ребра внутри колбы, и боковой шейкой для ццо 5 10 15 25 35 40 45 50 55 60 65 12куляции заливают 500 лл среды, указанной в примере 1 для вегетативной стадии, и стерилизуют ее 20 лин при 120 С. После охлаждения колбу инокулируют суспензией спор, полученной промыванием стерильной дистиллированной водой налета трех культур в пробирке.Колбу термостатируют при 28 С и встряхивании (скорость 120 об/лин, эксцецтриситет 45 цл) в течение 38 час, 50 лгл полученной вегетативной культуры ицокулируют 3 л среды, залитой в 5-литровые стеклянные ферментеры ц имеющей следующий состав (в %):Декстрцц 4,0 Казецц 1,0 Кукурузный экстракт(5 О % ь )1,0Углекислый кальций 0,5 Серцокпслый аммоций 0,1 Дикалцйфосфат 0,1 Вода водопроводная До 100,Бульон встряхивают со скоростью 400 об/лин и продувают 1 об, воздуха ца 1 об. среды в 1 лсин при 27 С в течение - 24 час, В конце этого периода отбирают 3 л мицелиевой суспензии и инокулируют в 50 л сбраживаемой среды, которая содержит (в %);Крахмал 4,0 Казеин 1,0 Соевая мука 3,0 Свекольная меласса 0,2 Углекислый кальций 0,4 Сернокислый магний 0,1 Вода водопроводная До 100.Среду стерилизуют 30 яин при 121 С и после пнокуляции встряхивают со скоростью 200 об/мин и продувают 0,7 л воздуха ца 1 об. среды в 1 мин при 28 С в течение 110 чпс. Получают 110 лкг/ял антибиотика, 50 л полученного сбраживаемого бульоца фильтруют через 2%-ный Суперсел. Влажный мицелий экстрагируют 15 л метанола и 10 л 80%-ного водного метанола. Экстракты упаривают до 4 л. Осадок отделяют, промывают водой, высушивают, суспецдируют в безводном ацетоне, фильтруют и высушивают. Получают 11,30 г 60%-цого сырого продукта.Маточные растворы и промывные воды приливают к профильтрованному бульону. Кальций удаляют, доведя рН раствора (55 л) до 6 едким цатром и прибавляя углекислый натрий до рН 9,2. Смесь встряхивают 1 час, прибавляют 100 г ццфузорцой земли и фильтруют для удаления углекислого кальция. После этого рН фильтрата доводят до 6 хлористым водородом, пропускают через колонку, содержащую 2 л Лмберлита 1 КС в хлористоводорсдцой форме. Смолу промывают 5 л воды, 5 л 0,5 и. раствора аммиака и 5 л воды.Элюировапие проводят смесью 3 об, метанола и 1 об. 3%-ного водного раствора хлористого натрия. Получают 6 л активного элюаза, который упари,;акгг до 1,5 л в вакууме, досадят р 11 до 8,5 ечкцм натром, экстрагиру 13 ют дважды 1 об. бутилового спирта. Экстракт промывают водой и концентрируют до 100 лл.После прибавления 10 об, ацетона отделяют образующийся осадок, промывают, высушивают и получают 3,25 г 60%-ного сырого продукта.В 200 лл метанола суспендируют 14,40 г сырого продукта. Осадок неактивной фракции (1,40 г) отделяют, фильтрат пропускают через колонку, содержащую 300 г нейтрального глинозема, взвешенного в метаноле, промывают 3 л метанола и элюируют 80%-иым водным раствором метанола. Собирают фракции по 100 мл, следя за элюированием по спектрофотометру (отсчет показаний при 244 и 284 ммк), а затем анализируют методом хроматографии на бумаге, применяя в качестве растворителя смесь бутанол в пиридин в , Для проявления активных компонентов используют метод биоавтографии на Вас. зцЬИЬ.Первые 20 фракций содержат либаиомицин В (Кг 0,78), а фракции от 21 до 30 содержат смесь либаномицииов А и В (Кг 0,65 и Кг 0,78).Фракции от 31 до 50 содержат либаиомицины А и С (Кг 0,65 и Кг 0,40).Каждую группу фракций выпаривают отдельно в вакууме досуха. Остаток растворяют в этиловом спирте, фильтруют, концентрируют до небольшого объема и осаждают 10 об. ацетона. Осадки высуцгивают в вакууме при 56 С над фосфорным ангидридом, Получают 1,80 г либанмицииа В (90%-ный), 1,70 г либапомицииов В и А (90%-ный) и 3,80 г либаиомицииов А и С (90%-иый).Раствор 1,40 г либаномицина А, содержащего также либаномицины В и С, в этиловом спирте (96) пропускают через 25 г порошка целлюлозы, высушивают в течение ночи в вакууме над хлористым кальцием и помещают в хроматографическую стеклянную колонку, содержащую 225 г порошка целлюлозы. Смесь элюируют смесью бутанол - пири дии - вода (6: 4: 3), собирая фракции по 10 лг, которые анализируют хроматографией на бумаге, проявляя активные компоненты биоавтографией хроматограмм на пластинках агара, инокулироваиного Вас. зцЫ 111 з.Фракции 5 - 7 содержат либаномицин В, фракции 8 - 16 либаномицины Л и В, фракции 17 - 24 либаомицин Л, фракции 25 - 40 либаномицип А и следы либаномицина С и фракции 41 - 45 либаномицин С. К каждой группе фракций приливают дистиллированную воду и петролейный эфир. Водную фазу экстрагируют 1 об, петролейного эфира, повторяя операцию три раза, добавляют этиловый спирт, упаривают досуха, растворяют остаток в этиловом спирте, полученный раствор фильтруют и концентрируют до половины первоначального объема. Добавляя 10 об. безводного ацетона, осаждают антибиотики в аморфном виде. Осадок отфильтровывают, промывают безводным ацетоном и высушивают над фосфорным ангидридом в вакууме при 56 С, Получают 30 мг либаномицина В; 120 мг либаномицина352469 А, содержагцего следы либаномицина В, 640 ягг либаиомицина А, 150 лг либаномицина А, содержащего следы либаномицина С, и 5 мг либаномицина С.Пример 5. В 80-литровый ферментер изнержавеющей стали вливают 50 л среды, описанной в примере 4, и стерилизуют 30 лин при 121 С, При 27 С ферментер засевают 500 лл вегетативной культуры, выросшей на той же среде в колбе, описанной в примере 4.Ферментер продувают 0,7 об. воздуха на1 об. среды и встряхивают 25 час, За это время рН доводят до 6,7 и получают бульон, готовый для засева.15Состав сбраживаемой среды (в %):Крахмал 5,0 Глюкоза 0,5 Углекислый кальций 0,5 Соевая м ка 4,0 Сернокислый магний 0,1 Вода водопроводная До 100 20 Предмет изобретения1. Способ получения ангибиотического комплекса, включающий культивирование продуцента из класса Ягерогпусеез в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содер жащей источники углерода, азота и минераль 500 л среды стерилизуют 20 лин при 121 С,после охлаждения до 27 С засевают 25 л вышеописанной вегетативной культуры, полученную смесь встряхивают со скоростью210 обилии и продувают 0,65 об. воздуха на1 об. среды в 1 лин в течение 87 час, ПолучаЗ 0 ют 120 лкг/л,г антибиотика,450 г бульона фильтруют па фильтр-прессес использованием 3%-ного Суперсела. Промытый водой, ио еще влажный мицелий (86 кг)экстрагируют дважды 360 г 90%-ного водногометанола. Экстракты концентрируют до 100 лв вакууме при 40 - 45 С. рН полученного концентрата доводят до 8,5 Концентрат экстрагируют сначала 70,г, а затем 20 л бутиловогоспирта. Смешанные экстракты промывают во 40 дой и концентрируют до 8 л в вакууме. Осадок фильтруют, промывают ацетоном и высушивают. Получают 180 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С,Дальнейшее концентрирование полученного45 бутанольного экстракта до 1 л и последующееосаждение 10 г ацетона позволяет дополнительно получить 208 г 20%-ного сырого продукта, состоящего из смеси трех антибиотиков.Профильтрованный бульон и промывные во 50 ды (500 л) смешивают, доводят рН до 8,5,экстрагируют два раза 280 г бутплового спирта, полученный экстракт промывают водой иконцентрируют до 25 л в вакууме. Неактивныйосадок отделяют, фильтрат концентрируют до55 2 л, прибавляют 10 об. ацетона, полученныйосадок промывают ацетоном, высушивают иполучают 75 г 20%-ного сырого продукта, содержащего либаномицины А, В и С.15ных солей, при рН 5 - 8,8, отличагогггийся тем, что, с целью получения комплекса лпбаномицина, состоящего из либаномицпна А, лпбапомицина В и лиоаномицпна С, В качестве продуцента берут Ягер 1 опгусез 11 Ьап 1 и. зр а культивирование ведут при 22 - 37 С в тече 35246916пие 72 - 160 час п выделяют антибиотический комплекс известнымп приемами.2, Способ по п. 1, от,гичагощийся тем, что используют штаммы Ягер 1 огпусез 1 йап 1 Г. 1.5 2343, г .1. 2399, Г.1. 2501 или г.1. 2521 (Яос 1 е 1 а Гаггпасеп 1:1 с 1 11 а 11 а) .Составитель М. ДранишниковРедактор Т. Шарганова Техред Л, Евдонов Корректор Л. БадыламаЗаказ 3224/17 Изд. гге 1330 Тираж 406 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений н открытии при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 45Типография, пр. Сапунова, 2