Способ получения антибиотика

Ч 420187 ОП ИСАНИ ЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Реслублик(51) Ч.Кл. С 120 9,(14 06.02,69 (31) 8588(6 32) Г 1 риорит33) Япония Государственный комитет Совета Министров СССР оо делам изобретений(531 УДК 615.779.931088,8) 5.03.74. Вюллстсиь Л"о 1 уоликован открыт а опубликспзания опгсаиия 10.11,74 1(2) Авторьиз 0017 ст".Н 5 11 ностранцы Шомура, Н катсу, Шоич Таро Ниида (Япония) ио Езаки, Еиичи Амано, Хироши ита,атанаб П 1 о;траиная фир(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ Такаши Цуруока, ТакашиИ 1 игехару Иноуе, Шунзо фу Предлагается способ получения аитиоиотика, ранее в патентной литературе не описанный, заключающийся в том, что культуру Ягер 1 огпусев ГпСЯГ 01 асепз Г(АТСС 21454) выращивают В аэробнык услови 5 к нд среде, содержащей источники углерода. азота и пнсральныс соли, В течение 2 - 5 дней при температуре 15 - 38 С до накопления Янтибиот:ка в культуральной жидкости. Затем культуру отфильтровывают и при рН 7 - 9 экстрагируют органическим растворителем, нс смсшивающимся с водой, игпримср этилацста том, этиловым эфиром, метилизобутилкетоном, Оути;яцстятом, .лороформоъ 1, бутиловы спиртом. Полученный экстракт повторно экс трагируОт;ри рН 2 - 3 водным раствором кис.Оть 1, ня 17 и.1 е 17 со:яноЙ, серной, устанавливают рН 7 - 9 с помощью щелочи. Полученный экстракт вновь экстрагируют ие смсшиВЯ 101 Цимс 5 с ВОДОЙ ОРганичсским Раство- гО ритслем. Экстракт упаривают в вакууме досуха, растворяют сырой продукт в этилацстатс или бутилацстатс, пропускают раствор через колонку с активировапным углем и элюируОт актпвныс фракци: этилацетатом или бутила цетатом. Активные фракции очн 1 цяют повторной экстракцией и хроматографическими метолами. Полученное предложенным способом антибиотичсское вещество обладает низкой токсичиостью, При испытании на мьппак зостд нОВлсно, ч О 00 р -на 51 смср Гность че 1)езоиределсшыс промежутки времени достш алась соответствс:Но при дозе, г,кг: 3200,3100, 2900 и 2850. Штамм, используемый впредложенном . Нособе, выделен из образцапочвы, отно;".1 тся к Ягер 101 ю сс. шсаго 1 асепвпод номером 21454 в соответствии с нормамиАТСС и мсет .Лсдующис особенности ня рдз,ичнык нт 1 тельны. с 17 сдяк.Сякярозны яси Чяпекя. Смостр 11 тныи мицелий от Ос:цветного до кремового, рост пло.10. Воздушный мицслш скудный ыопкоиоподобныи бс(Овт 10-серы. Рдс 7 воримого пи 1 Н" Н.Гл:цср:Новый дгар Чапека. Суостратный1:1 С.7 НЙ Темно-к 017 ич 1 СВЫЙ. Возд; шиы(цслий от ослого до кремового, частично с образованием окрашенного в серый оттенок,клопкоиодобный. Растворимого пигмента нетили Очень мд:1 О сл 1150-РОЗОВОГО цВета,Глюкозо-аспарагииовый агар Чапека. Суостратный мицелий светло-коричневый до красновато-коричнево: о. Воздушный мицелий оельш или бело-розовьш. Растворимого пигмеинет:ли 0,7 або-ко 17 ичнсвато-же(1 ты"1,ГлОкозоспгряГинОВЬ 1 й ЯГя 17 Ушинск 01 О.Субстрдпый мицслий коричневьш с красновдтым оттенком. Воздушпыи мицелий розовдтый. Растворимый пигмент светло-кор:чневый.Кальцш 1-малдтный агар. Субстратный мицелий кремовый, рост слабый. Воздушногомицелия нет. Растворимого пигмента нет,Глицерин-кальциевый агар, Субстратныймицелий светло-коричневый. Воздушный мицелпй розовый, переходящий в сероватый. 5Растворимого пигмента нет,Крахмально-синтетический агар. Субстратный мицелий темно-коричневый с пурпурнымоттенком. Воздушный мицелий розовый созначительным красноватым оттенком, постепенно переходящим в сероватый, Растворимого пигмента нет.Бульонный агар. Субстратный мицелийжелто-коричневый, Воздушный ицелй оченьскудный, белый. Растворимого пигмента нет. 15Глюкозо-бульонный агар. Субстрат 5 иый мицелий от коричневого до темно-коричневого,рост хороший. Растворимого пигмента нет.Глюкозо-пептонный агар. Субстратный мицелпй коричневый. Воздушный мицелий скудный, белый.Тпрозиновый агар. Субстратный мицелийбелый.На картофельных дольках субстратный мицелий от коричневого до темно-коричневого, 25ро:т хорош 41; воздушный мицелий обильный, серовато-коричневый, растворимый пшмент темновато-коричневый.На дольках моркови субстратпы мпцелийкоричневый, воздушный мицслий от белого докремового; растворимьш пигмент коричневыйпо периферии колонии.Спятос молоко, Субстратный мицелпй светло-коричневый, рост поверхностный. Воздушный мицслий скудный, белый. 35Яйцо. СубстрТпый м 14 целпй бледно-коричневый, воздушного мицелия пст.КоагулпрОВапная сыВОротка Лсрфлера,Субстратный мицслий бледно-коричневый.Воздушного мицелпя нет. 40Гл 1 окозный раствор Чапека, Субстратныймпцелий бледно-коричневый, Воздушпьш мицслий скудный, белый.Кслатина. Субстратпый мицслий от кремового до б:едно-кор 1 чнсвого. Воздушного мпцслпя нет.Среда Беннета. Субстратный м 1 щслий от коричневого до темно-коричневого. Воздушныймпцслий розовый с красноватым оттенком,Предложенным способом получено всщество, обладающее свойствами антибиотика, которое ингпбируст рост граммположительныхбактсрий. Оно включает четыре активнысфракции. Лнтибиотик растворяется в метиловом спирте, этпловом спирте, ацетоне, хлороформс, этн.ацстате, бут 51 ацст 51 1 е, подкпслснной воде, беп.Оле, этиловом эфире и четыреххлористом углероде, плохо растворяется впетролсйпом эфире, нормальном гсксане инейтральной воде. Имеет основную реакцию, 00образует с кислотами соли,Антибиотик содержит в молекуле углерод,водород, азот и кислород и вращает плоскостьполяризации влево в этиловом спирте, при"1 см это Вспсство пр 051 вл 5 ст СВойстВа кро- 5.пдн 11 х антибиотиков. 1 фракция в свободной основной форме образует белый порошок с т. пл. 122 - .124 С, проявляющий степень рКа 6,9 в 50 %.ном растворе этилового спирта в воде. Элементарный состав, О/О. С 60,38, Н 8,35, К - 1,65 и остальное О, мол. вес 813, что определено путем масс-анализа, эмпирическая формула С 4 Н 6-,01;Х, при концентрации в этиловом спирте 1% оптическое вращение (а 1 д --- 67. Максимальная абсорбционная способность лучей ультрафиолетового участка спектра раствора в этиловом спирте прп длине, волны 232 я равна(Е 1;", =325),Вещество в виде пилюль, т. е, в виде сво. бодного основания в бромистом калии, обладает способностью поглощать лучи в инфракрасном участке спектра при следующих волновых числах, с,5 . 3500, 2970, 2930, 173.= 1460, 1408, 1376, 1360, 1330, 1295, 1275, 1190, 1165, 1120, 1082, 1050, 1015, 910, 860, 840, 805, 780, 735 и 680. Диацетилпроизводное продукта образуст окрашенные в белый цвет 1 лы. т, пл. 122 в 1 С при псрекристаллизацип из четыреххлорпстого углерода.Элементарный состав, 010: С 60, 35, Н 8,02, Х 1,58, а остальное 0 - 30,05, что соответствует эмпирической формуле С 4 Н 7 О 7 М, причем максимальная абсорбционная способность при 232 нл равна (Е 1=295) в ультрафиолетовой области спектра в растворе в этиловом спирте. Это производное характерзуст.я способностью поглощать излучение в 1 шфракрасной области спектра гранул в бромистом калии при следующих волновых числах, сз3450, 2970, 2930, 1728, 1454, 1368, 1232, 1167, 1122, 1082, 1054, 1024, 1002, 957, 907, 868, 837, 788, 762. 11 фракция в виде свободного основания представляет собой окрашенный в белый цвет порошкообразный продукт, т. пл.125 - 128 С; показатель рКа в 500/О-ном растворе этилового спирта в воде 6,8. Элемснтар. ныи состав, О/О: С 60,58, Н 8,85, Х 1,72, остальное 0 - 28,85; мол, вес 827; эмпирическая формула С 4 Н 690 дХ; оптическое вращение 1 а ",-, = - 68 при концентрации 1/О в этиловом сгиртс. Максимальная абсорбционная способность при длине волны 232 и, (Е " =320) в ультрафиолетовом участкес,спектра в растворе этилового спирта.,характеризуется абсорбционной способностью излучения в инфракрасной области спектра и в виде свободного основания в форме гранул в бромистом калии прп следующих волновых числах, с. : 3500, 2970, 2985, 1737, 1460, 1410, 1377, 1360, 1300, 1275, 1190, 1170, 1123, 1082, 1052, 1017, 990, 920, 910, 860, 840, 805, 780, 740 и 700. Диацетилпроизводное 11 фракции образует окрашенные в бельш цвет иглы с т. пл. 130 - 134 С. Элементарный состав, %: С 60,68, Н 8,28, Х 1,49, а остальное 0 - 29,60. Эмп 1 рческая формула С 46 Н 7 зО 7 Х.111 фракция в виде свободного основания представляет собои окрашенный в белый цвет порошок с т. пл. 122 - 125 С, г, 50%-ном вод 420187но-спиртовом растворе рКа равен 7,0. Элементарный состав, %; С 60,58, Н 8,23,: 1,87, а остальное О - 29,32; мол. Вес 811; эмпирическая формула С 41 Н 6 зОьХ, Оптическое вращение равно сг -".- = - 42 при 1%-ной концентрации в этиловосм спирте. Максимальная аб орбционная способность при длине волны 280 им равна (Е"=295) при излучении в ультрафиолетовой области спектра в растворе этилового спирта. Поглощает излучсгше в ипфракраспой Ооласти спектра В форме ГО 2- нул в бросмистом калии в виде свободного оснозан)гн пр:1 следующих волновы:( числах, сл . 3500, 2970, 2930, 1738, 1680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1360, 1300, 1275, 1252, 1190, 1168, 1121, 1088, 1052, 1015, 980, 910, 863, 840, 805, 780. Моноацетильное производное 111 фракции образует кристаллы, подобные кристаллам речного песка, т. Ил. 182 - 185 С, Элементарный состав, %: С 60,5, Н 7,92, 1( 1,68, а остальное 0 - 29,84, Эмииргческаяформула С 4 зН 67 Х,1 Ч фракция предстявляст собой сВОООд)Ос основание, которое образует порошкообразный продукт, окрашенный в белый цвет, т.,ил. 120 - 122 С, показатель рКа 3 50%-ном водном растворе этилового спирта равен 7,0. Элементарный состав, %; С 60,82, Н 8,52, Ы 1,73, а остальное О - 28,93, молекулярный вес 825. Эмпирическая ф,;.)мула С)НБ-О-Х. Оптическое врашение с 1-. - , - 10 при концентрации 1% в этловом спирте. Максимальная яосороцианняя способпость: "лучсии 51 3 ультрафиолетовой области спектра пр; длине Волны 280 ььи (Г,1,.;, =285) в растворе 3 этиВ Вис 1 рянл в форме -)обо 1- ного ошовяиия в бромистом калии хдрактсри етс 51 ПОГЛОП 12101 це 1 СПОСОО)ОСТЬ 10 В ПНфпякрасной област 1 излучения при следующих волновых числах, сл-. 3500, 2970, 2930, 1738, 680, 1640, 1600, 1460, 1378, 1,360, 1300, 1276, 1252, 1190, 1170, 1120, 1082, 1052, 1017, 980, 920, 910, 863, 840 и 780.Моноацстилпроизводное 1) фракции образует кристаллы, имеюшие форзу круп:ц рс 1- Ного песка, т, пл. 166 - 168 С. Элементарный состав, %; С 60,85, Н 8,06, Х 1,65, а остальное 0 - 29,44. Эмпгрическая формула С 41 ЪО 1 ЯХ. Все персис 1 ентые фракции моГут Оыть получеиьг 0;1 новрехсино В ходс прОВедени 5 процессаа культивировал;15 штамма ЮГ=837; характер)13 у 10 тся ян 2 ЛОГичныъи ф)131 ко - химсигсскими свойстзами.Н фиГ. 1 - 4 предстяВлсны характер;1 стикп 1 - -1)т фракц;й.П р и м е р 1. В 60 л жидкой питательной среды, содержацей 2,5% осахаренного крахмала, 4% растворимого растительного протеина, 0,3% хлористого калия и 0,3% углекислого кялыц 51, при р 1.1 7,0 инокулируют штаммом и при,постоянном перемешивании культивируют ири 28 С в течение 35 час з услов.- ях непрерывной аэрации, Полученную культуру отфильтровывают, мицел;й промывают зс 1 ным рястзорс Соляной кислоты, Фильт 1)дт Ос)ьсд:151 яют с иромььзной жидкостыО, В -, езультате Оопьес кол;чество палу 11 енной :к;Дкой сррякции составляет 50 л (потенция или сила равна 150 лг(г/л.г). Далее из филь- трата пр: рН 8, с помошью 25 л эт;лацетатя э:(страгируОт активное вещество, далее 22 л "тиляцетдт)сои ф 1)2 К 1 ци концентрируОт ДО конечного объема, равного приблизительна 3 л, 3 условиях пониженного давления, Получен;ыи концентрат разбавляют 1,5 .г воды, дово.дят рН среды до 2,0 добавлением 5 н, раствора солянсй кислоты и тщательна псоемеши.зяОт вст)я.;".вя:Исм. Затем воднуо фазу от деляют от аргяни сской фдзы, доводят рНводного рдствсд до 8,0 добавленем 3 и. раствора Г)гдрдт 2 Окиси натрия. Да:1 ее экстряГИ- руют 800 3 л этилацетатов. Полученный этиляцетдтпьтй эк тракт перемсш)гвают Встряхи Вяниеъ с 500 л. задиОГО раствора сол 5 нойкислОты. з псзу 1 ьтдтс чеГО Ктивпыс фракТНН ;ереходят в этот раствор, которыи затем повторно экстрягируОт с 400 лл серного эфира при рН 8. Далее эфирный экстракт сушат 25 безводным сульфатом натрия с последуюьцим.с)Нцс.тр 1,)дза:ем п)11 паниж. Ином ддвле и:ш, 3 рсзул).тате получают 16,5 г сзстса-желтого порсшкобразного продукта.Г 10 слс этоса 1 г и;)Одукт,1 раствориОт В 30 200 лл этила;с; дтя и раствор иршлускдютСрез колсиху с 600 л, тонкодисперснОГО уГ- ля,:1 педзарительпо пропитанного этилацстата)1. Эл 10;1 и",1 с)Г этиляцстятам, после 1 сга дк П 1 БНЬ 1 Р фряци:1 элоятя Объедии 51 ют, с)ОПсе 5 количество (ан,чной фракЦ 1 И 2000 .11 Зятсмес ВыпяривяОт досуха В 1 славиях 110 никсн.Ного ддзлешгя, получают 5 г окрашенного з Ос;1 ый цвет пар апкоабрязного трод ктя, Да,ее этот:1 рОдмкт р)СТВОр 51 От В 1 О л,г бснзо,д и Отф 1)льт 1)авыва 10 т иеряствсри.51 10 сячасть. Пс.ле этага ф:льтрдт пропускают чсрхр 0 12 тс Граф 11 С.ку 10 калан(у, В катар)1 с с)Перл(итс)1 00 лл с;ликГеля. Предвдритсльаензаяа), с послед)ошей 45 элюцией с;ама;цыо бензала и ацетона з саОтнотпен)1 П 4:1. Палучсн)ый элюат сао 102 от 3 Виде фракции, калиество каждой ПЗ катарых состяВл 51 ст )О .,г. После этого д(тивиыс фракии:1 Ъо 90 - 380, характеризуюшисся толь 1(0 ОДНИ)1;1 ЯТНОМ В ХОДЕ ПРОВСДСИИ 51 ХРОМ;1.тОГряфичссксГО дияли 32 В танком с,10 е Ок".1 си 51 лОмини)1, чтс соответствует содержашио чистой 1 фракции, в соответстви) с величиной Я для одного лятнд, объединяют, абшсе ка личестзс; состдзляст 4000 лл, После этого ироду(т кониснтр;1 р;От В условиях пан:Жсннаго ДЯВлени 51, получая 1,5 г Ок;)ашеннОГО 3 белый цвет порашкообрдзиога продукта, т, ил, 122 - 124 С. В результате шгялизд мстдиовгено, что оп представляет собой ч.Стый про.дукт в в.де свободного осиоздиия.П р и м с р 2. 20 л питательной среды, с,- держдшсй (%) 3 глюкозы, 1 иептоид, 0,5 мя,- ного экстракт, 0,2 хлористого натрия, 0 3 уг лекислого кдльц;гя и 0,3 соевого масла, рН ,О, 42018765 помещают в внбрационный бродильный чан. емкостью 30,0 л, стерилизуют при 120 С 20 гин. Стерлизованную питательную среду инокулнруют ЮгерОгпусез ппсаго 1 асгепз с последующим культивированием прн постоянном псремешпванги прн 28 С в течение 48 час с одновременной аэрацией, Далее жидкую ферментатнвную среду фильтруют при рН 6 и получают 18 л фильтрата (сила 200 мкг/мл). рН фнльтрата доводят до 7,5, добавляя 3 н. раствор гндрата окиси натрия, и экстрагиру 1 от 8 л бутплацетата. Полученный бутилацетатцый экстракт подвергают Обраоотке, Описанной в примере 1, т. пл. окрашенного в белый цвет конечного порошкообразного продукта 122 - 124 С. Выход антибиотика 800 мг.П р и м е р 3. 4,0 г сырого порошкообразного вещества, окрашенного в желтый цвет, полученного описанным в примере 1 способом, суспендируют в 1000 1 л воды. Величину рН суспензнн доводят до 3,5 добавлением 5 н. раствора соляной кислоты, Раствор пропускают через колонку, содержащую 100 лл продукта Лмберлит СС(кокапно-активного типа). Смолу промывают 800 мл дистиллированной Воды с последующей элОП 5 ей смесью 0,4 н. раствора солянои кислоты:с этиловым спиртом в соотношении 1:2, Объединяют активные фракцГп элюата, общий объем их составляет 180 мл. Всл 1 чгпи р 11 элюата доводят до 6,0 добавлением 3 н. раствора гидрата окиси натрия и концентрируют до объема 40 мл в условиях пониженного давлсцпя. Далее величГну рН сконцентрированного продукта доводят до 8,0 добавлением 3 и. раство- РЯ ГПДРЯТЯ ОК:1 С 1 ПЯТРП 51 С ПОС.1 ЕДУ 101 Ц 11 М двойным экстрагпрованием двумя порциямч по 50 .1 ь каждая этцлОВОГО э 1 рпря, Полуси ныс фракции объединяют 1 концентрируют в условиях пониженного дявлсцпя. В ре ГГьтятс,пол 1 ч 210 т 2, г Окряшснцого В Ослый цвет порошкоооразцого продукта, который рястВОр 511 от В 10 мл этцлацетятя, ПолчС 5 Ны 1 расгВОр пропуск 2 От чсрез ко,10 цку, 32 полцсннуо 200 мл окиси ал 1 омпн.51, предварительно тропптянцой этеляпстс 1 тоы, с пос;1 сду 10 щей элюцией этплацстатом. Лкт;нные фракции эл 102 тя Ооъед 1 гпя 10 т. Оощсс ко,цсс 110 этОГО элюят 200 1,г, Далее В э;юят40 ыл дистиллированной воды и дозодят рН до 1,8 добавлением 5 н, раствора соляной кислоты с последующим тщательным перемещением путем вотряхиванпя. Далее водную фазу отделяют, доводят рН до 8,5, добавляя 1 н. раствор пидратя окиси натрия, в результате твсрдын продкт впадает в Осадок Осадок отфильтровывают, растворяют в бензоле, я затем раствор пропускают через,колонку с с:лпкягелсм (кяк Описано В прпСре 1), причем разделение производят в соответствии с вариантом осуществления предлагаемого спосооа, Получают порошок белого цвет. Выход антгнбцотика 300 мг.П р и м е р 4, Штамм ЛТСС 21454 Ягер 1 огпуссз гпсаго 1 ас 1 спв ицокулируют в ЗОО л жидкой 5 10 15 20 25 30 35 4 О 45 50 55 60 питательной среды, содержащей (%) 2,0 глюкозы, 1 пептона, 0,5 мясного экстракта, 0,4 кукурузного экстракта, 0,2 хлористого натрия, 0,3 углекислого кальция и 0,2 лярда, при рН 7,0, и культивируют при 28 С в течение 70 час в условиях аэрации.Культуральную жидкость фильтруют и мицелиальную массу промывают соляной кислотой. Фильтрат объединяют с промывными жидкостями, в результате чего общий объем конечной массы составляет 280 л (сила 320 икг/мл). Далее фильтрат экстрагируют 70,г этилацетата и 71 л полученной этилацетатной фазы концентрируют до 20 л в условиях пониженного давления. Концентрат разбавляют 10 г воды, доводят рН до 2,0 добавлением 5 н раствора соляной кислоты с последующим тщательным церсмешиванием путем встряхивания, Далее водную фазу отделяют, доводят рН до 9,0 добавлением 3 н. раствора гидрата окиси натрия и экстрагпруют 4 л этилацетата. Полученный экстракт перемешивают встряхиванием с применением 2 л водного раствора соляной кислоты. Затем вновь экстрагируют 1 л этилацетата при рН 8,0. После этого экстракт сушат безводным сульфатом натрия с последующим концентрированием в условиях пониженного давления. Получают 92 г сырого порошкообразного продукта, окрашенного в желтый цвет.90 г этого продукта растворяют в 1 Гг этилацетата, раствор пропускают через колонку, заполненную 1,5 л угля, пропитанного этилацетатом с последующей элюцией этилацетатоы, после чего активные фракции элюата объединяют. Получают 5,5 л. Далее объедипегп 1 ую фракцию выпаривают до сухого состояния в условиях пониженного давления. Получают 55 г порошкообразцого продукта ослого цвета (сила конечного продукта 700,цкг/лг).Порошкообразцый продукт подвергают обработке методом распределения по принципу протцвотока, применяя оснзол и О,ЗМ раствор фосфорного буффера (рН 4,40), используют 2,5 л каждого растворителя и нижний подвижный слой подвергают десятикратной обработке методом распределения. Лнтибиотик распределяется цо пробиркам нли трубкам с первой по трстью и сосредотачивается преимущественно во второй пробирке, тогда как большая часть, т. е. приблизительно 80% остальных фракций -- 11 - 1 Ч сосредотачиваются в первой пробирке.После этого содержимое первой пробирки нли трубки (2,4 г) концентрируют, получают 7,7 г продукта, окрашенного в белый цвет (сила 720,кг/1 г). После этого продукт растворяют в 15,л бензола, нерастворившийся остаток отфильтровывают, фильтрат пропускают через колонку, заполненную 800 1 л силикагеля, который предварительно пропитывают бензоломЛктнвцые вещества элюируют смесью бензола с ацетоном в соотношении 4:1. Элюаты объединяют, Далее те фракции элюата ( 28 - 30), которые характеризовались только одним пят 420187 10ном, объединяют в вакууме, Получают 140 лг порошкообразного продукта, окрашенного в белый цвет, т. пл. 120 - 122 С. Это 1 Ч активная фракция в чистом виде в форме свооодного основания,Далее фракции38 - 57, которые арактсризовались образованием трех пятен в коде проведения хроматографического анализа в тонком слое окиси алюминия, объединяют и концентрируют в условиях пониженного дав.ления. Получают 1,1 г порошкообразного продукта белого цвета, который представляет фракции 11 и 111 и незначительное количество 1 фракции. Фракции70 - 95, которые драктеризовались образованием только одного пятна в ходе проведения хроматографичсского анализа в тонком слое окиси алюминия содержали только 1 фракцию. Затем концентрируют в условиях пониженного давления и получают 0,8 г порошкообразного продукта, окрашенного в белый цвет, т. пл. 122 - 124 С. Он представляет собой 1 фракцию в виде свободного основания.При м е р 5, В 4 лбензола ра тзсряют 1 г продукта, окрашенного в белый цвет и содсржащеео 11 и 111 активные фракции и значительное количество 1 фракции. После этого раствор пропускают через колонну, заполненную 100 лл окиси алюминия, пропитанной Оензолом, и элюируют смесью этилацетата с бензолом в соотношении 1:1. Элюат ссбиргиот в виде отдельных фракц 1 й, количество канадой из которых составляет 20 мл. Каждую фракцшо подвергают испытанию хроматографичсским путем в тонком слое окиси алюминияприменением в качестве элюата смеси этилацетата с бензолом в соотношении 2:1. После этого те фракции, номера которых паодятся з пределаот 30 до 48 и которые арактсриз)- 10 ТСЯ ТОЬКО ОДНИМ ГЯТНОЪ В ХОДС ПРОВСДЕПИ 51 роматографического анализа в онком слое окиси алюминия, объединяют и концентрируют в условияпониженного давления до порошкообразного продукта, окрашенного в ослый цвет с т. пл. 122 - 125 С. Получают 1 Ч активную фракцию в виде свободного основан:я.После окончания вымывания фракции80 с хроматографической колонки смесью этилацетата с бензолом в соотношении 2:1, фракции90 - 125 концентрируют в у ловиях пониженного давления. В резулыате получают 280 лг порошкообразного продукта белого цвета, представляющего собой П активную фракцию, Далее 250 мг этого продукта растворяют в 3 мл бензола, раствор пропускают через колонку, заполненную 50 лл окиси алюминия, предварительно пропитанной бензолом, затем элОируют 300 л,г смеси этилацстата с бензолом в соотношении 1:3, после чего заменяют эту смесь смесью этилацетата с бенлом в соотношении 2:1, Элюат собирают в виде отдельных фракций, количество каждой из которых составляет 5 мл, после чего каждую фракцию испытывают путем роматографичсского анализа в тонком слое окиси алюми 5 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 и:;я. Далс фрдкци:36 - 47. образующие только одно питно в оде роматографиче;кого анализа з тонком слое, объединяют и концентрируют з уловияпониженного давлсн:я. Получают 80 лг порошкообразного вещества ослого цвсга, представляющего 11 активную фракцию.П р и м е р 6, Штамм ЮГ=837, который получил наименование Ягер 1 огпусез ппсаго 1 асепз, инокулируют в 30,г жидкой питательной среды, содержащей (7 О ) 3,0 глюкозы, 5 растворимого растительного белка, 0,2 хлористого калия и 0,3 углекислого кальция, при рН 7,0. Затем культивируют при 30 С в течение 85 час при постоянной аэрации. Далее фермснтативную среду фильтруют, мицелиальную массу промывают разбавленным раствором соляной кислоты, Фильтрат объединяют с промывной жидкостью до объема 28,1 л (сила 300 лкг/мл), Полученный филь- трат при рН 8,4 экстрагируют с 7 .г бутилацетата, а полученный экстракт, как описано в примере 4, Получают 15,2 г. После этого в 200 л,г бутплацетата растворяют 15 г сырого порошкообразного желтого продукта, раствор пропускают через колонку, заполненную 400 1 и угля, предварительно пропитанного бутплацстатом, с последуюгцей эл 10 цией бутплацетатом. Активные фракции элюата объединяют. Общее количество объединенной фракци 1 составило 1,8,1, Общую фракцшо концентрируют в условиях пониженного давления до 220 ли. Далее концентрат разбавляют 50 л.1 дистиллированной воды, р 11 раствора доводят до 2,0 добавлением 6 и. раствора соляной кислоты, после чего конечную массу псрсмснивают втряиванисм, Затем водную фазу отделяют, величину рН этого водного рд.творд доводят до 9,0 добавлением 1 и. раГвора гид 11 дгд окии натрия, в результате че- ГО выпадде. В оалок конечныи продм 1 т. Заев 0 ддок Отф 11 ьтрОВъ 1 Ва 10 т 1 ВысушпВа 10 т в эксикаторе, В результате получают 6,3 г окрашенного в белый цвет порошкообразного продукта, сила которого 720,1 кг/д 1 г.Порошкообразный белый продукт растворяют в 12 лл бснзолд, а нерастворпвшуюся чат 1, отфильтровывают. Фпльтрат пропускают через колонку, заполненную 600 м,г силикагсля, пропитаного бензолом с последующей элюцисй смсью бензола с ацетоном в соотношении 6:1. Элюат получают в виде отдельных фракций по 20.11 л. Активные фракции 11 - 115 вымывают ранее 1 фракции, После этОГО ес 1 жд 10 пз полъченныфракций подвергают ипытаншо путем роматографического анализа В тонком слое силикагеля с применением в качестве элюата смеси бензола с ацетоном в количтвснном соотношении 2:1. Фракции64 - 82 концентрируОт в условияпон жспюго ддвле 1 шя, в результате получаот 800 дг окрашенного в белый цвет по- р 01 пкооордзнОГО продукта, который Включает фракц 11; 11 - 11, с незначительным количеством 1 фракции. 110 лс этого порошкообразныйЪ,4 т+,7 о г -- -т -- . т бо що где 1800 ИОО Ядд 1 гоб ОООО ро 0 болгОО ПОО ЧОО бОО ЫЮ аОО аи МоВОПНОЫ цОСМ(см )Риг 1 1000,БИО дг 00 г 800 лоо,яоо юоо г продукт подвергав)т обработке пуСм хроматографического разделения с применением колонки, запОлнснпой силинаслом, спосооом, описанным в примере 4. Очи 1 цеииьй продукт подвергают хроматограф:чсской обраооткс на колонке, заиол Пениой Окис)ио )ломииия, как Оп:сПо В пимсрс 5, ПолучаОт 15 г ч)1- стОГО прОДл кта 1) ф)акЦИИ 1) и "1 дс СГООО 1 ПОГО ОСНОВаи;я, 85 Лг л 111;Т 010 ПродЧКТа 111 ф;,)акции В Виде сВОООднОГО Осиоваии 51 и 35 лг чи- ) О стОГО продукта 1фракции.П р и м с р 7, В 10 )л этилового или сриого эфира растворяют г 0 .)1 г 1 фракци 11, которуо получают;ио;лбом, оп:салиым и примере 2, после чего раствор по каплям дооавля)от НаСЫщСННЫЙ ра:Зор Л 5 нл,10 ПП 01"1 КИСЛОГЫ, ПОЛУл 1 ЕННЫй ОСВДОК ОТфИЛЪТРОВЫВа 10 Т И ВЬСУШИВают. В результате ПО;1 учают 230 иг цитрат(1 продукта - 1 фг)акцию, т, пл. от 162 до 167 С (с разложением). уЭ По 200 )г каждого из свободиь)х осшгваий фракций 11 - 1 Ъ обрабатывают насыщенным раствором лимонной кислоты и получают лимоннокислые (производные данных фра(Цпй. Выход 210, 220 и 190 лг. 25П р и м е р 8, В 20 ял дистиллированной воды суспсндируют 300,иг фракции, к суспсизии добавляют водный раствор винной кислоты. Полученную смесь перемешивают, рН дододят до 4,0. Далее фильтруют, срильтрат суиат зО при температуре ниже 0 С, получают 340 )г виннокислого продукта в виде окрашенного в белый цвет порошка, т. пл. 115 С.П р имер 9. В 1,5 лл иридина растворяют 300 иг продукта 1 фракции в виде свободного 35 основания, в раствор добавляют 1,0 5 л уксусно 0 ВИГидр 1 Да. Г 10 лученную смесь перемешивают, выдсрживают при комнатной темпера- тург в течение 20 чс)с, Далее смесь выливают В,месь воды со;п,дом, перемешивают. Выпав;и;й осадок отфильтровывают и Высушивают В экс.1(аторс. Получасот 330 .)г порошкообразисно продукта белого цвета, который перек 1)110с.,1,1 ИЗОВ 1 эВают из л 1 стырсххлор)1 стОГО мглс.рода. Г 1 олучают 305 хг диацетильного произио;По)0 ф 1)акции 1 В Виде Оелого игловидиого )родукта, т. Пл. 122 - 125 С.Подобным способом иолучаот фракц)ш 11 в л в Виде свободных оснований, обраба, ын 1:051,)точным колилСством уксусного си):др)да В В:дс его раствора в пиридиие и иос)л гают диацетильпое производное фракции 11, моноацстильнос производное фракции 111, а также моноацетильное производное франц;и 1 Ъ, представлявшие собой белыс кристаллические Вещества, Выход которых , с)савил соответственно: 310 лг (т. пл.130 в -1 С), 295 мг (т. Ил. 182 в 1 С) и 300 5 яг 1 Т. Ил, 166 - 168 С). Предмет изобретенияСио. 01) пол л чения антиоиОтика, ОтлссчсчоиигСя тем, что культуру тгер 1 огпусев писагоЬсСпв Ы=837 1 ЛТСС 21-154) вырашива;от и аэросгных условиях иа срсдс, содержащей исгочиикс углерода, азота и минеральные соли, В тсчсиис 2 - 5 дисй при температуре 15 - 38 С, )ЗВ 1 СКОТ ЦСЛЕВОЙ ПРОД л КТ ИЗ МИЦСЛИЯ И К) ЛЬ - Т л РЯЛЬНОй )КИ ЧКОС ТИ, ОЧИЩаЮТ И РВЗДЕЛЯ 10 Т известими приемами и выделяют в свободном виде, В виде солевой или ацетильных производных.,ООО ОООО гаОО ЫОО ЫОО 1 ДОО ИОО,"ООО ВОПИЯОИ цПСПО (СМ )ООО 4 О Шенев гданов Госта вите, исдактор Е. Хорнна Тскрсд Л Корректор Н. Л 156Чи пистии4/5 11 одписиоеСССР Изд, Лв 1 111Государственного комитета Г по делам изобретений и саа 3072Ц 1.1 ИИП Тиран овста откры аб., д ушск сква,зо ВО ф 7 ОбО ст50 бл. тии. Костромского управления издательств, полиграфии и кпигкиой торговли