Способ получения пептидамидов или их солей

Союз Советск 11) 582756 циьлистицеских Республик ИЗОВР И 1 ЕН 61) Дополнительный к пат 22) Заявлено 26,11.75 (21) 23) Приоритет 27.03.74 (32 008489/2191855/23-0480373 ГаауДарстаэннь 4 камхтат Саввта Мекстраа СССР Оа двлам хэабратакка н аткрыткй(72) Авторы изобретен Иностранцы Бернхард Риник и Вернер Риттел) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДАМИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙспособу идов, котое в медици ны тритильной илизащитами Я, 21 .С целью получедов, содержащихостатка, проиэводкоторые обладаютсвойствами и расшдействия на живогается способ полобщей формулы дометильной аци ия нов 2 амин ных ка Фа ир обы за между а путем которог ободны мыкания 1 дйуистеинамиокислениямеркаптогли блокиро Известны спо Фидного мостик молекуле пептид дом пептида, у Пы цистеинов срмакяютрганения йо- руп.а Х 8 1 2 3 5- СК-СО- Гдц-Асн - Лец-с ер-тре-ц,ие -8 9 10 И 1 а 1 З йелт - Аей-Гло -Тре-тцр-трв-Глн -19 20 2 ден -Гас -ТР 16 17 16 ФеН - АОН-Я 11 ХЗ 2 Хз Пво-Глн -Тре 26 27А ла - Иле-Г(11 йю-ун, (1) ЗО 31- ГЛО - АМО - огрупами,11,ловали неск эльк ложениях й аминок ионин ином,ислота или аменены в по и 24 друго но Й- мет онинф -лизодна аминонокислот э14,16,19,2той, а имейом, Й -тре дород, первичная аминланин эаенен -аспаиэолейцин замененв соответствующем слу где Ф в сюат и/илинином и, агин-т ае Изобретение относится олучения новых пептида ие могут найти примерке 1) М. Кл. С 07 С 103/5 // А 61 К 37/О ых пептидамикислотных ьцитонина, логическими редства воззм, предла- пептидамидов-легцином, Х-Фенилаланин 9 й-лейцином, й-Фенилаланинзф З-тирозином иЪ -глютаминфф Х-аспарагиномили их солей, заключаквдийся в том,Мто соединения общей формулы 0 Н 2 Н3 4Гг 7Я-Сй-СО-ГЛЦ- Асгг-Лай-СЕР-ТР 4-ЦИЕ - ЮЭ9 10 и И М 14 И-ГВН - ТР 4- Ада - Нвб- ГЛО ОЛ - ГЛО-ЯЯО -32гб Йн Ц)где Кимеет 1 указанные значенияг20- аланйнзе заменен Х-аспарагиномй/или 2 -изолейцинф заменен 7.-треоФянном и где, в соответствующемслуча 4,одна аминокислота или несколько амино 8 11 1416,19,22 и 24 указанными аминокислота-ми, причем меркаптогруппы остатков 1и 7 свободны или защищены тритильнойилгг ациламидометильной группами,окисляют йодом в растворителе при З 0комнатной темйературе с образованиемдисульфидиой связи, целевой йродуктвыделяют известными приемами,В качестве растворителя предпочтительны метанол или уксусная кислота. 35Б Мчестве кислотно-аддитивных солей используютсоли терапевтическиприменяемых кислот, например соляной,уксусной, серной, фосфорной и сульфоиовой кислот, или низших алкансульфоновых, бднзолсульфоновой,или толуолсульфоновой кислоты. 107 : этилацетат-пиридин-вода (49:24 г 7)112 Е ги -бутанол-пиридин-муравьиная Кислота-вода (44 г 24 г 2 г 20)121 : изопропанол-ный водный аммиак-вода (70 г 10 г 20)121 А : изопропанол-ный водный аммиак-вода (85 г 5 г 10)) - значения для ТСХгТС -иа готогых пластичных из силикагеля 5 Ь 254 ирмы ЯФее, Ь 1 га Ме тг;Ц - на готовых пластинах из ЦеллюлоЬы фирмы Ив ск Под тпз 1 ас(й ТА - на алокс-пластинах (45 г АЦ,О фирмы Свгггагг, МифСаггъ + З,З гипсатолщина В 0 г 3 мм)В примерах применяют следующие сокращенияЕок - трат-бутилоксикарбонилБ - карбобензоксиОтЕу - сло",ный грег-бутиловый эфирОнп - сложный и -нитрофениловый эфирОме - слояный метиловый эфирОсу - слояный оксисукцинимидовый эФиртЕу - простой грет -бутиловый эфирЕмп - 6 -меркаптопропионил.П р и м е р. Получение Н-Цис-Гли-Асн-Лей"Сер-Тре-Цис-Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп"Фен-Асн-Лиз-Фен-Гис-Тре- -Фен-Про-Глн-Тре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-И 0 (Тре -кальцитонин М).2780 мг Р-цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис-(три)-Мет-Лей-Гли-Тре-Тир- -Тре-Глн-Асп-фен-Асн-Лиз-фен-Гис-Тре- -фен-Про-Глн-Тре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- И Н -трифторацетата растворяют в 40 мл 95-ной уксусной кислоты и по каплям при сильном перемешивании за 1 ч прибавляют к смеси 100 мг йода в 120 мл 95-ной уксусной кислоты. Затем перемешивают еще 2 ч при комнатной температуре, добавляют 200 мл воды, экстрагируют избыточный йод взбалтыванием небольших порций смеси со 100 мл тетрахлорметана до обесцвечивания экстрагируемой смеси. Водный раствор высушивают лиофилизацией, остаток растворяют в 5-ной уксусной кислоте и фильтруют через колонку с ионообменника 9 11 Фирмы г 4 егсК(слабо-, основной, ацетатная форма). Элюат высушивают лиофилиэацией и получают Тренг-кальцитонин-.М-ацетат, 80 мг которого растворяют в 5 мл воды и при перемешивании прибавляют к раствору 1,2 мл слабоосновного ионообменника в виде свободного основания, р раствора 6,5, ацетат выпадает в виде мел-. кого осадка. Смесь перемешивают 2 ч, при этом рн раствора повышается до 7,1Осадок и ионообменник отфильтровывают, промывают водой и осажденный пептид растворяют в теплой 90-ной уксусной кислоте. Смолу отфильтровывают, промывают 90-ной уксуснойкислотой, уксуснокислый раствор высушивают лиофилизацией и получают 74 мгТре 1 -кальцитонина М в виде укс)снокислой соли высокой степени чистотыпо показаниям ТСХ и электрофореэа. 5ТА и 3+(52)0,49 1 кальцитонин М гВф (52 0,55.ТЦ М(101 А)0,52 1 кальцитонин М 1%(101 А) 0,57.Прм тонкослойном электрофорезе (пл 4 с-(Отины иэ целлюлозы, рН 1,9, 2 ч, 280 )пройденное расстояние 4,5 см от катода (кальцитонин М : пройденное расстояние 4,5 см). При анализе аминокислоты после фолного гидролиза (6 н. НС(110 С, 24 ч) продукт содержит вычисленное количество аминокислоты,Исходный материал получают следую-Шим образом.А. Ъ-Ала-Тре(тБу)-Гли-Оме.Смесь 18,9 г З-Ала-Онп, 13,4 гН-Тре-(тБу)-Гли-Оме-хлоргидрата, 100 млдиметилформамида и 6,2 мл Я, -метйлморФолина перемешивают 17, ч при комнат-.ной температуре, растворитель отгоняют ири пониженном давлении остатокрастворяют в сложном уксусном эфире,промывают и сушат. Раствор уиариваютдосуха, остаток кристаллизуют иэ смеси эфир - иетролейный эфир и получают16 г продукта, т.пл. 104-106 С. ЗОБ. Н-Ала-Тре-(тБу)-Гли-Оме.13,3 полученного в п. А продуктагидрируют в метаноле в присутствии1,5 г иалладиевого угля (10 палладия) и получают 9,4 г бесцветной 35смолы.В. Т -Тре-(тБу)-Ала-Тре-(тБу)-Гли-Оме.9,4 г полученного в п, Б продуктаи 13,2 г Ь-Тре-(тБу)-Осу растворяютв 100 мл,диметилформамида и выдерживают 17 ч при комнатной температуре.Реакционную массу вливают в 500 млледяной воды. Выпавший осадок отфильтровывают, высушивают и кристаллизуютиэ смеси ацетон - иетролейный эФир, 45в которую добавляют в небольшом количестве воду и получают 13,6 гпродукта, т.ил, 193-195 фС.Г. Н-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Оме.13,1 г полученного в и. В продуктагидрируют в 750 мл метанола в присут-ствии 2,6 г палладиевого угля. Получают 9,95 г бесцветного масла.Д. Х-Глн-Тре-(тБу)-Ала-Тре-(тБу)-ГлиОме получают как производные тетрапеи-тида аналогично и. В. Продукт кристаллизуют иэ метанола, выход 10,7 г,т,пл. 198-202 С.Е. Н-Глн-Тре-(тБу)-Ала-Тре(тБу) --Гли-Оме.10 г полученного в п. Д продуктагидрируют в 1 л метанола в присутствии 2 г палладневого угля. Получают8,2 г продукта.Ж. Ь -Тре-(тБу)-Фен-Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-Оме. 6 К. 8,2 г полученного в п. Е продуктта прибавляют 8,3 г Е-Тре(тБу) -Фен-Про-Он, затем 100 мл днметилформами 1- да, 4,0 г М-оксисукцинимида и 4,2 гдициклогексилкарбодиимида, смесьперемешивают 17 ч при комнатной температуре, выпавшиую в осадок дицикло"гексилмочевину отфильтровывают, фильМрат вливают в 1,3 л ледяной воды, че.реэ 2 ч осадок отфильтровывают, сушаМи смешивают с 120 мл сложного уксусфного эфира. Нерастворимвшийсн порошок отфильтровывают, промывают сложным уксусным эфиром, сушат и получают8,5 г продукта,ТС :К,(121 А) 0,78) В (102 А) 0,85;Йу(43 С) 0,71.3. Ь-Тре(тБу) -Фен-Про-Глн-Тре(тБу)1-Ала-Тре-(тБу)-Гли-ОН.5,15 г полученного в п. 7 продуктарастворяют при нагревании в 110 мл90-ного метанола, охлаждают до 23 фСи прибавляют 13,5 мл 1,0 н. водногораствора едкого натра. Через 10 мин.к смеси добавляют 45 мл воды, а через 5 мин еще 25 мл воды. Через 20мин раствор выливают в 270 млледяной 0,05 н. водной соляной кислоты, осадок отФильтровывают, промываюледяной водой и смесью вода - ацетонитрил (4:1) высушивают н получают4,1 г продукта.ТС ; 1(45) О, 27; Р.у(100) О, 33;)1(43 С) 0,28,И. Н-Тре-(тБу)-Фен-Про-Гли-Тре(тйу)- -Ала-Тре(тБу)-Гли-ОН.3,65 г полученного в п. 3 продуктасуспендируют в 125 мл диметилформамидаи гидрируют в присутствии 0,5 г палладиевого угля (10 иалладия). Продук (2,62 г) растирают с водой, Филь-,труют и высушивают,и ТС: К (100) ф О, 12; К (52) -= 0,23,К. 2 -Асн-Лиз (тБу)-Фен-Гис-Тре- (тБу)- -Фен-Про-Глн-Тре (тБу) -Ала-Тре- (тБу)- -Гли-ОН.7,2 г Е-Анс-Лиз-,(Бок)-фен-Гис-ЙНЯНрастворяют при нагревании до 80 фС в30 мл диметилформамида, раствор охлаждают до -36 фС и прибавляют к нему7,74 мл 3,7 н. хлористого водородав диоксане, затем 1,42 мл тренг-бутилнитрата, Смесь вИдержиэаюэ 10 минири -10 фС вйовь сжимают температурудо -30 С и прибавляют по каплям раствор 6,45 г Н-Тре-,(тБу)-Фен-Про-Гли-Тре-(тБу)-Ала-Тре(тБу)-Гли-ОН и7,8 мл И-этилдииэопропиламина в 70 млдиметилформамида. Раствор выдерживают18 ч при ОфС и затем вливаютв 400 млледяной 1-ной уксусной кислоты.Выпавший осадок отфильтровывают,промывают водой и высушивают в вакуу-,ме над хлоридом кальция Продукт дегидрируют с ацетонитрилом, Фильтруют на нутче и высушивают.ТС :Яу(70).Г 0,33) К у (100)0,21.-Глц-Асп(СтБУ)"Фец- Ы Н И Н растворяютпри нагревании до 80 С н 4 мл дйметил-З 6формамида, затем раствор охлаждаютдо -20 С, прибавляют к нему 0,35 мл3,7 н. хлористого водорода в диоксанеи 0 067 мл трсг -бутилнитрита. СмесьФперемешивают 10 миц при -1 э С и к40полученной массе прибавляют по каплямохлажденный до ОфС раствор 600 млН-Асц-Лиз (Бок ) -Фен-Гис-Тре (тГу) -Фен-Про-Глн-Тре (тГУ) -Ала-Тре (тБУ) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про-ЫН-ацетата в 5 млМдиметилформамида и 0,33 мл Я-этилдиизопропиламина, перемешивают 5 мин при-15 С, нагревают до 23 С и продолжаютперемешивать еще 6 ч. Затем реакционнуюсмесь вливают в 100 мл ледяной воды,выпавший осадок отфильтровывают,промы"вают водой и высушивают при пониженном.давлении над хлоридом кальция. Смесьпереосаждают из смеси метанол-вода,осадок отделяют, сушат растирают сацетоном и получают 650 мг продукта. 55".С: 1 (43 С) = 0,33, 3(70) = 0,60,О. Ч-Тре (тГУ) -Тир (тБУ) - ,Тре (тБУ) -Глн-Асп (ОтБУ) -Фен-Асн-Лиз (Бок) -Фен-Гис-Тре (тБУ) -Фен-Про-Глн-Тре (тБУ) -Ала-Тре (тБУ) -Гли-Вал-Гли-Ала-Про- К Н, 60610 мг полученного в п. Н продуктагидрируют в 25 мл 80-ной уксуснойкислоты в присутствиипалладиевогоугла. Продукт растворяют в 50 мл водонасыщенного М-бутанола. Для удаления 65 уксусной кислоты раствор цромынают днажлы разбавленным соловым раствором, дважды полунасьпцецным раствором хлорида натрия и водой. Бутанольной слой отделяют, упаривают при поцижецном давлении и получают 605 мг продукта н виде бесцветной пены.ТС : Я(100) 0,20131 (96). 0,40П, Бок- Цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер(тГу)-Тре-(тБу)-Цис (три)-Мет-Лей-ГлиТре (тБУ) -Тре (тБу) -Глн-Асп (ОтБУ) -ФецаАсц-Лиз (Бок ) -Фец-Гис-Тре (тБУ) -ФенПро-Глц-Тре (тБ у) -Ала-Тре (тБу) -ГлиВал-Гли-Ала-Про- КН,К смеси 605 мг Н-Тре(тБУ)-Тир(тБУ) -Тре(тБУ)-Глн-Асп(ОтБу)-Фен-Асн-Лиз(Бок) -Фен-Гис-Тре-(тБу)-Фен-Про-Глн:-Тре(тБу)-Ала -Тре(тБУ)-Гли-Вал-ГлиАла-Про И 11 , 330 мг декапептида Бок-Цис-(три)-Гли-Асн-Лей-Сер(тБУ) - -Тре(тБУ)-Цис(три)-Мет-Лей-Гли-ОН, 46 мг 1-оксибензтриазола и 10 мл диметилформамида прибавляют 75 мг дициклогексилкарбодиимида перемешивают 90 мин при 40 фС и затем 18 ч при 23 С, выпавшую в осадок дициклогексилмоченину отфильтровывают, маточник вливают в 100 мл ледяного эфира, свободного от перекисей. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и нысушинают. Полученный продукт-сырец растворяют н смеси диметилформамидметанол (1:1), раствор фильтруют через колонку (высота 100 см, диаметр 4 см) на Сефадекс (алкилиронанный сшитый полидекстран), которая приготовлена в той же смеси, Собирают Фракции по 5 мл, высушивают досуха, вначале при 11 мм рт.ст., а затем при 0,01 мм рт.ст. и 45 фС температуры ванны. Чистоту полученный фракций контролируъ ют ТСХ на силикагеле. Получают Бок-Цис-(три)Гли-Асн-Лей-Сер(тБУ) - Тре(тБУ)-Цис(три)-Мет-Лей-Гли-Тре(тБУ) - -Тир (тБУ) -Тре (тБУ) -Глн-Асп (ОтБу) -Фен-Асн-Лиз (Бок) -Фен"Гис"Тре (тБУ) -Фен-Про-Глн-Тре(тБУ)"Ала-Тре(тБУ)-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- И с Р (100) 0,541 Р (70) 0,65. 135 мг полученного продукта растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты, раствор оставляют на 1,5 .1,5 ч при комнатной температуре,добавляют к нему 30 мг трифенилкарбино ла и оставляют еще на 10 мин.Затем упаривают досуха на роторном испарителе при температуре бани 30 С,остаток растворяют в свободном от перекисей эфира. Полученный порошок отфильтровывают, промьвают эфиром и сушат при пониженном давлении над едким натрием. Получают 87 мг Н-Цис-(три) - -Гли-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис(три)-Мет- -Лей-Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен- -Асн-Лиэ-Фен-Гис-Тре-Фен-Про-ГлнТре-Ала-Тре-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- Н - трифторацетат, который может быть582756 использован в дальнейшем без дополнительной очистки.Аналогично получают следующие сов диненияАсн -Тре 2-кальцитоиин М; ТЦ5 Йу (101 А) 0,53; К(112 Е) О, 39. Тонкослойный электрофорез (на пластинках из целлюлозы) : рН( 1,9 и 16 В/см, 1,5 ч; пройденное расстояние3,7 см. по направлению к катоду.Дезамино-Асн 2 ф-тре 21-кальцитонин А ф ТЦ: %1 (45) О, 501 К (101 А) О, 59;(112 Е) 0,43. Тонкослойный электроФорезрН 1,9, 16 В/см, 1,5 ч 1 пройдейное расстояние ф 2,4 см по направлениюк катоду.Дезамино-Вал -Лиз -Лей 12 -Тер -Аси6 2 Трее -кальцитонин М; ТЦ : К (101 А) 0,51 % (112 Е) 0,45. Тонкослойный электроФорез :рН; 1,9, 16 В/см, 1,5 ч 1 пройденное расстояние 3,7 см по йаправлению к катоду,цизамйно-Лиз-Лей фф .-Тир 22- Ьсн -Тер 21 -кальцитонин Д.; ТЦ; (, (45) Ъ,47 р 1 (101 А) О, 50 у Ф. (112 Е) 0,42. Тонкослойный электроФорез рН 1,9, 16 Влксм, 1,5 ч; пройденное расстояние ф 3;7 см по направлению к катоду.Лиэ -Лей-Тирф -Асио -Тер 27н 12 И,1 Еьцитонин М ТЦ : 11 ф 5) Офф 3(101 А) 0,43; К(112 Е) Оф 3 Тонкослойный электроФорез: рН 1,9116 В/см, 1,5 ч; пройденное расстояние 4,9 см по направлению к катоду.Лей 2 -Тир 2"-кальцйтонин И ТЦ% 6(101 А) 0,502 ТА з Й (52) 0,45, Тонкослойный электроФорез на пластин,- ках из целлюлозы : рН 1,9, 280 В/см, 2 ч; пройденное расстояние 4,5 смпо нафавлению к катоду. 46Лейф -Асифу -Тир 21 -кальцитонин М ТЦ: К (101 А) 0,33) ТА% (52) 0,47.Асн -кальцитонин М, йу (101 А) 0,5 Ь(112 А) 0,58, 45Формула изобретения1. Способ получения пептидамидов общей ФормулыСИ 26 ф сн, зн43- сн -сО-Глм-Аел-лей - серре 7 8 Э 1 О 11 12 1325 -ц-Глв- вел-глц-Ала - Прф-е 2 Яу где Ж имеет 1 казанные,значения) 1 -аланннфЕ заменен Й -аспараТинби и/или 2 -изолейции заменен Т-трвонином и где, в соответствующем случае, одна аминокислота или несколько аминокислот заменевЫ в положениях 8,11,14,16 Д 9,22 и 24 указанными Ими нокислотами, причем меркаптогруппы остатков 1 и 7 свободны или защищены тритильной или ациламидометильной группами,окисляют йодом в растворителе при комнатной температуре. т л и ч а ючестве раствоол или уксус 2. Способ по и. 1 о с я тем, что в келя используют мета кислоту. Ю щ принятые в Источники информациивнимание при экспертизе Пепти 1. Г 1 редер Э., ЛюМир, 1967, с. 3 2. Патент С 103/52, 197-63 Гвв -- Ь-ИИ гдето - водород или первичная аминогруппа;- аламин заменен Х -аспараги).2 Еном и/илиХ - изолейцин 21 заменен З-треони. ном и, в соответствующем случае, Ьдна аминокислота или несколько аминокислот заменены в положениях 8 11, 14, 16, 19 22,и;24 другой аминокислотой, а именно : Х метионинф валиномнтреОнин 1 -лизиномртирозин-лейцином, Х Фенилаланин 1 фф .- -лейцином, Й -Фенилаланинф Е -лейцином, 2 -Фенилаланин 1-тирози 22ном и 7 -глютаминфя Е -аспарагином, или их солей, о т л и ч а ю щ и йся тем, что соединение общей Форму(лы