Способ получения новых пептидов

О П И С А Н И Е 386508ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскими Социалистицеских РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патента-аявлено 21.Х.19701486904/23-4), Кл. С 07 с 103/52 риоритет 22,Х.1969,15786/69, Швейца ударственный комитетвета Мнннотрав СССРо делам изобретенийн открытий публиковано 14.Ч 73. Бюллетень2 К 547.964.4.07 (088.8) та опубликования описания 9.Х.197 Авторыизобретения Иностранцы рихард Риникер и(Швейцария) ностранная фирма ИБА - ГЕЙГИ АГакс Бруггер,Вернер Риттель явитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПЕПТИДО лу ысоко получать веческого е собой Предлагатидов зал тИзобретение относится к областиния новых пептидов, обладающихгипокальциемической активностью.Предлагаемый способ позволяетпо оптимальной схеме аналоги челотиреокальцитонина, представляющиновые, ранее неизвестные пептиды.емый способ получения новых пепключается в том, что пептиды общейСН, - Я1 2 3 4 7 8 68 9 К-СН-СО-ГЛи-Асн-Лей-Сер-Тре-Цис-Х - Лей 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 Гли-Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Аон-Лиз - Фен 21 22 23 24 26 26 27 28 29 Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре - Ала-Иле-Гли-Вал 31 32Гли-Ала-Про-МН 2 получают конденсацией фрагментов 1 - 10 и 11 - 32 с последующим удалением защитных групИ и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитивных солей или комплексов известными приемами.При этом Я - Н, МН 2 или ацил-МН, Х - остаток 1.-метионина, 1.-валина, 1.-норвалина, 1.- лейцина, 1.-изолейнина,1.-норлейцина или 1.=а аминомасляной кислоты, а В полоокениях 11, 12,16, 17, 19, 20, 22 и 24 по меньшей мере одна из аминокислот замещена другой, а 2именно 1.-треонил"-.-лизином, 1-тирозин 12- 1.-лейцином, 1.-фенила-ланин"-1 -лейкином, 1.- аспарагиновая кислота 7-1.-гистидином, 1.-фенилаланин"-лейцином, 1-гистидин"-1. - глютамином, Е.-феггилаланин 22-1.-тирозином и 1.-глютамин"-1.-аргинином,Пример 1. У, - Тре(ТБу) - Тир(ТБу)Про-ОН.Н-Тир(тБу)-Про-ОН, полученный из 11,75 г О 2-Тир (тБу) -Про-ОН, растворяют в 39 лг,г диметилформамида, прозрачный раствор охлаждают в ледяной ванне, после чего добавляют 2,81 мл М-метилморфолина и 12,2 г твердого Х-Тре (тБУ) -ОСУ. Полученный раствор на 23 час оставляют при комнатной температуре упаривают, полученное желтокоричневое масло растворяют в этилацетате, и трижды промывают разбавленным раствором лимонной кислоты, затем водой до нейтральной реакции, После высушивания сульфатом натрия этилацетатную фазу упаривают. Образуется белая пена, которую подвергают противоточному распределению.Т. пл. 90 - 94 С а 1 = - 23 (с= 1 метаноле)П р и м е р 2. Х-Тре-(тБу) -Про-Глн-Тре3бавляют 3,95 г Н-Глн-Тре(тБу) -Ала-Иле-ГлиОМе и 1,07 г 1 М-гидроксисукцинимида, полученный раствор охлаждают в ледяной ванне до 0 С, после чего добавляют 2,07 г твердого дициклогексилкарбодиимида. Раствор на 15 час оставляют при комнатной температуре, отфильровывают от выделившейся дициклогексилмочевины, в фильтрат добавляют воду, отфильтровывают осевший осадок, Его промывают простым эфиром и переосаждают из этилацетата, - петролейного эфира. Образуется порошок с т. пл 187 - 188 С,П р и м е р 3, Н-Асн-Лиз(БОК) -Фен-Гис-Тре (тБу) - Тир (тБу) -Про-Глн-Тре(тБу) -Ала-ИлеГли-ОН,1,34 г Х-Асн-Лиз(БОК) - Фен - Гис -КНМН растворяют в 6,2 мл диметилформамида, раствор охлаждают до - 20 С, затем добавляют 1,40 мл 3,0-н. НС 1 в диоксане и 0,252 мл, третбутилнитрита. Раствор на 15 мин оставляют при - 15", затем,добавляот 0,724 мл К-этилдиизопропиламина, охлаждают до - 20 С и добавляют раствор в 24 мл диметилформамида 1,12 г Н-Тре(тБу)-Тир(тБу) - Про-Глн-Тре(тБу)-Ала-Иле-Гли-ОН, полученного из защищенного октапептида (ом. Пример 2), Раствор оставляют на 16 час при +5 С, потом упаривают и добавляют простой эфир. Образовавшийся осадок дважды обрабатывают простым эфиром, Полученный порошок отфильтровывают, промывают водой до удаления хлорида, растворяют в 70 о яном ацетонитриле и добавлением абсолютного ацетонитрила снова осаждают. Для дальнейшей очистки его подвергают протьвоточному распределению. 930 г полученного продукта растворяют в 110 мл 80 -ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 100 лг Рд/С. Затем фильтруют, фильтрат упаривают, добавляют ледяную уксусную кислоту и лиофильно высушивают.П р и м е р 4, Х-Тре - (тБу) - Тир(тБу) - Тре (тБу) - Глн-Асп (ОтБу) -Фен-Асн-Лиз (БОК) Фен - Гис - Тре(тБу) -Тир(тБу)-Про-Глн-Тре (тБу) -Ала;Иле-Гли-ОН.770 мг Х-Тре(тБу) -Тир (тБу) -Тре (тБу) -ГлнАсп (ОтЬу), Фен-МНКН, растворяют в 3,2 мл диметилформамида, слепка мутный раствор охлаждают до - 20 С и добавляют 588 мкл 3,0 - н, НС 1 в диоксане н 98 мкл трет-бутилнитрита. Раствор оставляют на 15 мин при - 15 С, затем добавляют раствор 778 мг описанного в примере 3 продукта в 14 мл диметилформамида и 0,303 мл К-этилдиизопропиламина, размешивают полученный раствор 5,5 час при охлаждении льдом. В течение этого времени добавляют 0,076 мл И-этилдиизопропиламина. Раствор на 15 час оставляют при +5 С, затем медленно выливаютв простой эфир, полученный белый осадок растворяют в диметилформамиде и снова выливают в охлажденную до 0 С 0,02-н-соляную кислоту (в которую на 100 мл объема добавляют 1 О мл насыщенного раствора поваренной со 4ли). Полученный при этом продукт растворяют в 80 о-ном ацетонитр иле, затем осаждают водой при 50 С. В целях дальнейшей очистки продукт переосаждают из диметилформамида простым эфиром, а также из ацетонитрила водой. Пример 5. Н - Тре (тБу) -Тир (тБу)-Тре (тБу) - Глн-Асп(ОтБу) -Фен-Аон - Лиз(БОК)- Фен-Гис - Тре(тБу) - Тир(тБу) -Про-Глн-Тре (тБу) -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-КН,755 мг описанного в примере 4 продукта растворяют в 8 мл диметилформамида, в раствор при комнатной температуре добавляют 139 мг Н-Вал-Гли-Ала-Про-ХНь 47 лг И- гидроксисукцинимида и 84 мг дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 18 час при 45 С. Затем раствор медленно выливают в простой эфир, осаждепный белый порошок подвергают противоточному распределению.233 мг полученного продукта растворяют в 80 о-ной уксусной кислоте и гидрируют в,присутствии 40 мг Р 4 С в течение 18 час при комнатной температуре. Затем фильтруют, упарпвают почти досуха, растворяют в ледяной уксусной кислоте и лиофально высушивают. 10 15 20 25 Пример 6.БОК-Цис-Гли-Асн-Лей-Сер (тБу) .Тре (тБу) Цис - Мет - Лей - Гли - Тре (тБу) Тир(тБу) - Тре(тБу) - Глн-Асп(ОтБу)-Фен-АснЛиз (БОК) - Фен-Гис-Тре(тБу) -Тир (тБу) -Про лн - Тре(тБу) - Ала-Иле - Гли-Вал-Гли-АлаПро-МН,. 30 35 40 45 50 Пример 7.Н - Цис - Гли - Асн - Лей - Сер - Тре-Цис Мет-Лей-Гли-Тре-Тир-Тре - Глн - Асп - ФенАсн - Лиз - Фен-Гис-Тре-ТирПро-Глн-Тре-АлаИле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-КН Тир"-кальцитонин М.50 мг БОК - Цис-Гли-Асн-Лей-Сер (тБу) -Тре (тБу) -Цис - Мет-Лей-Гли-Тре (тБу) -Тир (тБу)- Трет(тБу) - Глн - Асп-(ОтБу) - Фен-Асн-Лиз (БОК) - Фен - Гис-Тре(тБу)-Тир(тБу)-,ПроГлн - Тре(тБу) - Ала-Иле-Гли-Вал.Гли-Ала 55 60 65 171 лг описанного в примере 5 докозапептидамида и 83,5 мг защищенного декапептидаБОК - Цис - Гли-Асн-Лей-Сер(тЬу) -Тре(тБу)-Цс-Мет-Лей-Гли-ОН растворяют в 1,16 мл диметплформамида при нагревании, после чего при комнатной температуре добавляют 15,9 юг твердого К-гидроксисукцинимида и 21,4 мг дициклогексилкарбодиимида, затем 3,5 час перемешивают при 45 С, Потом раствор по каплям добавляют в 23 мл свободного от перекиси простого эфира, а полученный в виде осадка белый порошок подвергают для очистки противоточному распределению.396308 Предмет изобретения Составитель В. Кривцов Техред Л. Грачева Редактор Л. Новожилова Корректор Е. Миронова Заказ 331203 Изд.1610 Тираж 523 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Типография, пр, Сапунова, 2 Про-МН 2 растворяют при 0 С в 1,2 мл концентрированной соляной кислоты, помещают в атмосферу азота и на 10 мин оставляют при 0 С.Затем замораокивают сухим льдом и при медленном повь 1 шении температуры до 0 С раствор концентрируют в глубоком вакууме. После добавления 2 мл воды лиофильно высушивают, остаток растворяют в 1 мл воды и, чтобы превратить в ацетат, медленно фильтруют через уравновешенную 0,02-н уксусной кислотой колонку (диаметр=7,5 мм; Н мм) слабо основного ионообменника (Мерк хо 11). Затем промывают 0,02-н уксусной кислотой до отрицательной реакции на реактив Фолина, концентрируют элюат до 2 мл и лиофильно выл шивают. Полученный таким образом ацстат Тпр 22 - кальцитонина М представляет собой аморфный, белый пороАналогично получают Лей 2" "-кальцитонин М, Лиз" - Арг" - кальцитонин М, Гпс"- Лей 19-Глн 20 - кальпитонин М, Вал-Тир"-кальцитонин М, Вал"-Лей 19-кальцитонин М, Дезамино-Лей 9-кальцитоиин М, Дезами- но-Тир" - кальцитонин М, Дезамино - Вал- Лей " - кальцитонин М, Лей" " "-Три"- кальцитонин М, Вал-Лей - Тираа - кальцитонин М, Дезамино - Вала-Лей" 16 "-Тираакальцитонин М, Лей" - кальцитонин М, Лей 10- кальцитонин М, Лей"-кальцитонин М. Способ получения новых пептидов формулыСН, - 31 2 3 4 6 67 8 9К - СН - СО-Гли-Асн-Лей-Сер-Три-Цис-Х-лей 10 11 12 13 14 16 16 17 18 19 Гли - Тре-Тир-Тре-Глн-Асп-Фен-Асн-Лиз-Фен 20 21 22 23 24 26 26 27 28 29Гис-Тре-Фен-Про-Глн-Тре-Ала - Иле-Гли,-Вал 30 31 32Гли-Ала-Про-хН 2 где К - Н, хН 2 или ацил-хН, Х - остаток .-метвонина, 1.-валина, 1.чнорвалина, 1.-лейцина, 1.-изолейцина, 1.-норлейцпна ИЛИ 1 -С 7,-ЭМИНОМаСЛяНОй киСлоты и гДЕ пО 15 меньшей мере одна пз аминокислот замешенав положениях 11, 12, 16, 17, 19, 20, 22 и 24 другой аминокислотой, а именно 1.-треонин"- 1.-лизином, .-тирозин 2-.-лейцином, 1.-фенилаланин"-1.-лейцином, .-аспарагиновая кисло та"-.-ГИСтпдИНОМ, 1.нфЕНИЛаЛаНИН 19-.-ЛЕйццном, .-гистидин 20-.-глютам 1 и 1 ом, 1.-фенилаланин"-1.-тирозином и 1.-глютамин" - 1. - аргиньпом, отл 11 ча 7 ощпйся тем, что указанные пептиды получают конденсацией известным 25 методом, например карбодиимидным, фраг.ментов 1 - 10 и 11 - 32 с последующим удалением защитных групп и выделением целевых продуктов в свободном виде, в виде кислотно-аддитпвных солей или комплексов извест ными приемами.