417940

ф 1 ентфео. т,еоиелвот:,-;д ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ 47940 Союз Советских Социалистических РеспубликЗависимый от патента М Ч, Кл. С 07 с 103/52Гасударственный комитет Совета Министров СССР аа делам иэааретений и открытийУ,К 547.964 Л.07(088.8 публиковано 28.02.74, Бюллетень М ата опубликования описания 06.08.74 вторызобрстения Иностранцы рнер Риттел, Макс Бруггер, Бруно Камбер, Бернхард Риникер,Петер ЗиберЗаявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПОКАЛЪЦЕМИЧЕСКИХ ПЕПТИДО Изооретение относится новых пептидов, которые пение в качестве эффек гиперкальцемиях и забо предлагаемому спосородственными либоитонину человека.получения гипокальей формулы Получаемые согласнобу пептиды являютсяидентичными тиреокальПредлагаемый способ5 цемических пептидов общ к области получения могут найти примеивных средств при еваниях костей. 1 - н,В 9 10с-мет-лей-тлиВ 19 О1 з- фал - тис - твеЗО 31 Ьтли ала ПРО 11 Н т тей - сер-т 11 е - циили ацил - КН, или соответений, в которых остатки астамина могут быть заменены рагиновой или глутаминовой аток аспарагиновой кислоты нен остатком аспарагина, затом, что пептид из не менее нокислотных остатков, содеридный мостик, конденсируют м с применением защитных групп для всгрупп, с пептзащитных грглутаминовой0 парагином и гПример710 мг Н-глцис (три) -ОН5 рила и к охл ех илп части Х идом с послед пп. Остаткикислот могут лутамином со 1. БОК-ци и-асн-лей-О -растворяютжденному д Ме и 1,36 г БОК мл ацетонит С раствору пригде К - Н, ИН, ствующих соедин парагина или гл остатками аспа кислот, или ост может быть заме ключающийся в семи первых ами жащий дисульф обычным методо Нь ОН и СООНующим удалением аспарагиновой и быть заменены астветственно. (три) -гли-асн-лейбавляот 820 мг дициклогексилкарбодиимида.После 30 мин при ОС и 60 час при 28 С отсасывают дициклогексилмочевину и фильтрат упаривают. К остатку прибавля;от петролейный эфир, растирают, петролейный эфир слива 1 от и остаток растворяют в этилацст:те, Раствор промывают при 0 С разбавленным раствором лимонной кислоты, водой, раствором бикарбоната натрия и водой, сушат сульфатом натрия и упаривают, Получашое в виде бесцветной смолы тетрапептидпроизводпое для очистки неоднократно осаждают из ацетона эфиром. Получают порошок с выходом 1,2 г, который однороден при хроматографии в тонком слое силикагсля; Я; 0,39 в системс хлороформ - метанол (9: 1).988 мг БОК-цис(три) -тли-асн-лей-О - Ме растворяют в 20 мл метанола и к охлажденному до 0 С раствору прибавляют 2 мл гидразингидрата, После 14 час при 2 С прибавляют 200 мл холодной 0,5 н, уксусной кислоты, осадок основательно растирают, отсасывают, промывают до нейтральной реакции ледяной водой и сушат в течение ночи в вакуум-эксикаторе. Сырой БОК-цис (три) -гли-асн-лейгидразид очищают двукратным переосажением из метанола водой. При хроматографии в тонком слое на силикагеле К 0,2 в системе хлороформ - метанол (9: 1),П р и м е р 2. Н-сер (тбу) -тре(тбу) -цис(три) - мет-лей-гли-ОН-ХСНзСООН,К 857 г ДПК-сер (тбу) -тре (тбу) -КНКН 2 в 8,0 мл диметилформамида приоавляют при - 10 С 1,87 мл 2,0 и, 1-1 С 1 в этилацетате и 0,19 мл трет-бутилнитрита.,После 15 мин прибавляют по каплям ии пропускании азота раствор 665 мг 1-1-цис(три)-мет-лей.гли-1 в 0,665 мл триэтиламипа в 7 мл диметилформамида. Перемешивают в течение 1 час при - 10 С и оставляют стоя 1 ь в течение 24 час при ОС. Упаривание реакционной смеси до 3 мл (глубокий вакуум, 30 Г) и осажденне 50 мл воды дает хлопьевидный продукт, который очфильтровывают, промьвают водой и сушат над К:.ОН в глубоком вакууме. Очистка переосаждением из бензола гексаном; Е 0,36 в системе хлороформ - метанол (7: 3).870 мг защищенного гексапептида растворяют в 15 мл 80%-ной уксусной кислоты, и раствор оставляют в течение 6 час при 30 С. После этого упаривают в глубоком вакууме при 30 С досуха, остаток сушат в течение 1 час при 30 С, после чего прибавляют свободный от перекиси эфир и полученный порошок основазельно рас",ирают. Отфильтровывают, дополнительно промывают большим количеством эфира и сушат.П р и м е р 3, БОК-цис-гли-асн-лей-сер (тбу)- тре (тбу) -цис-мет-лей-гли-ОН,1,0 г БОК-цис(три)-гли-асн-лей-КНКН, растворяют в 20 мл диметилформамида и к охлажденному до - 10 С раствору прибавляют при перемешивании 1,5 мл 2,0 н, НС 1 в этилацетате и 143 мг трет-бутилнитрита, После 15 мин при - 10 С прибавляют еще 10 мл 5 10 15 го 25 30 35 40 4550 55 60 65 охлажденного до - 10 С диметилформамида, 1,0 г мелкоразмельченного Н-сер (тбу) -тре ( гбу) -цис (три) -мет-лей-гли-ОНХСОО 1-1и 400 мг К-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают под азотом в течение 1 час при - 10 С и в течение 48 час при 28 С.11 осле этого упаривают в глубоком вакууме до объема 6 мл и декапептидпроизводное осаждают приливанием 100 мл ледяной воды. Образующийся осадок растирают, отсасывают и сушат в вакуум-эксикаторе над едким натром. Продукт показывает при хроматографии на силикагеле Е 0,60 в хлороформе - метаноле (7: 3).300 мг БОК-цис(три) -гли-асн-лей-сер(тбу)- тре(тбу) -цис- (три) -мет-лей-гли-ОН растворяют в 100 мл метанола и в течение 1 час прибавляют по каплям к хорошо перемешиваемому раствору 400 мг йода в 120 мл метанола, После окончания приливания перемешивают еще в течение 45 мин и обесцвечивают потом охлажденный до 0 С раствор 1 н. водным раствором тиосульфата натрия. После этого упаривают в вакууме до 10 мл и осаждают декапептидпроиз водное прил ив анием 100 мл холодного 1%-ного водного раствора уксусной кислоты. После растирания, фильтрования и промывания ледяной водой сушат продукт в эксикаторе над едким натром. Продукт для очистки подвергают противоточному распределенио в системе метанол в буфе хлороформ - тетрахлорметан (10; 3: 5: 4) (буфер 29 мл ледяной уксусной кислоты и 19 г ацетата аммония, доведено водой до 1 л); содержащие производное декапептида фракции объединяют и раствор упаривают. Для удаления ацетата аммония растворяют продукт в хлороформе и раствор три раза промывают разбавленным раствором лимонной кислоты и три раза водой, после этого упаривают досуха.П р и м е р 4. Кбз-тре(тбу) -тир(тбу) -тре (тбу) -гли-асп (Отбу) -фел-асн - лиз (БОК) -фалгли-тре(тбу) -фал-про-глн - тре(тбу) -ала-нлегли-ОН,2,30 г Кбз-тре (тбу) -тир (тбу) -тре (тбу) -глнасп(Отбу)-фал-КНКН 2 растворяют в 35 мл диметилформамида и к охлажденному до - 20 С раствору прибавляют 3,5 мл 3 н, водной соляной кислоты по каплям. После этого прибавляют 2,7 мл 0,9 н, раствора нитрита натрия и оставляют реакционную смесь стоять в течение 20 мин при - 10 С, После этого прибавляют по каплям охлажденный до - 10 С раствор 1,72 г Н-асн-лиз(БОК)-фалгис-тре(тбу) -фал-про-глн - тре(тбу) - ала-илегли-ОНХСООН в 30 мл 90%-ного диметилформамида и 1,0 г К-метилморфолина. Оставляют смесь стоять в течение 18 час при 0 С, потом упаривают в глубоком вакууме и осаждают продукт добавлением 100 мл холодной 2%-ной лимонной кислоты. Осадок основательно растирают, отделяют центрифугированием, четыре раза дополнительно промывают маленькими порциями ледяной воды и сушат417940 50 ГСН, 5Ъ ч 5 6 т 6 9 10 ".1 - СН-СО - тли- асн-лей - сед-тге - цис-мет-лей-тли 1 12 16 19 15 16 Л 16 19 С 2СО 21 в тле в -тре в т-асп-фал-асн-лиз- фал в тис в тге - фал-про-тлн-т 1 е-ала-иле-.ди-вал-г 1;-а та-пг ", . 5в вакуум-эксикаторе цад едким натром. Для очистки многократно переосаждают из диметилформамцда - этилацетатом.П р и м е р 5, 11-тре(тбу) -тир (тбу) -тре (тбу) -гли-асп (Отбу) - фал - асн-лиз (БОК)- фал-гис-тре(тбу)-фал-про-глн - тре(тбу)-алаиле-гли-вал-гли-ала-про-КН.800 мг Кбз-тре(тбу) -тир(тбу) -тре(тоу) -глнасп(Отбу) -фал-асн-лиз(БОК) -фал - гис - тре (тбу) -фал-про-глн-тре (тбу) -ала-иле - гли-ОН, 50 мг Н-вал-гли-ала-про-МН, и 120 мг Х-гидроксисукципимида растворяют в 9 мл диметилформамида перемешивацием при 45 С и затем прибавляют 120 мг дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при 45 С в течение 12 час, причем через 3 и 7 час после начала реакции еще приоавляют по 20 мл дициклогексилкарбодиимида и 20 мг Х-гидроксисукцинимида. Потом выливают смесь в 200 мл этилацетата и мелкий осадок отфильтровывают. Для очистки подвергают продукт противоточному распределению в системе метанол в буфер в хлороформ в тетра- хлор - метан (10: 3; 5: 6); приготовляют буфер по примеру 3.227 мг полученного защищенного докозапептидамида растворяют в 10 мл 90%-ной уксусной кислоты и раствор гидрируют в присутствии 100 мг палладиевой черни при интенсивном псремешивании,После окончания поглощения водорода отфильтровывают катализатор и фильтрат упаривают досуха. Остаток растворяют в насыщенном водой бутаполе и раствор три раза промывают в делительцой воронке небольшими порцпя 1 ц 5%-ного раствора карбоцата натрия и два раза незначительным количеством воды. Затем упаривают раствор бутанола в высоком вакууме при 35 С и сушат остаток в высоком вакууме. Таким образом получают 185 м; декарбобензоксилированцого докозапептида.П р и м е р б, БОК-цис-гли-асн-лей-сер (тбу)- 1тре(тбу) -цис-мет-лей-гли-тре(тбу) - тир (тбу)- тре(тбу) -глц-асп (Отбу) -фал-асц - лиз (БОК)- фал-гис-тре (тбу) -фал-про-гли - тре (тбу) -алаиле-гли-вал-гли-ала-про-КН.1181 г БОК-цис-гли-асн-лей-сер (тбу) -тре (тбу)-цис-мет-лей-гли-ОН, 288 мг Н-тре(тбу)где К - Н, ИН или ацил - 1 чН, или соответствующих соединений, в которых остатки аспарагина или глутамица могут быть заменены остатками аспарагиновой или глутаминовой кислот, или остаток аспарагиновой кислоты может быть заменен остатком аспараги 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 6тир(тбу) -тре(тоу) -глн - асп(Отбу) - фал-аснлиз(БОК) -фал-гис-тре(тбу) - фал-про-глу-трс (тоу) -ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-ХН 2 и 23 мг И-гидроксисукцинимида растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида при нагревании и после охлаждения до комнатной температуры прибавляют 31 мг дцциклогексилкарбодиимида. Пробирку затем заполняют азотом, закрывают ее и оставляют стоять в течение 15 час при 45 С. Отфильтровывают образовавшуюся кристаллическую дцццклогексилмочевину, промывают два раза 0,5 мл диметилформамида, фильтрат упаривают до половины его объема в высоком вакууме и продукт-сырец выделяют прибавлением 20 мл бензола и 120 мл петролейного эфира. Для очистки переосаждают из метанола бензолом и гексаном, отфильтровывают и сушат при 45 С до получения постоянного веса. Таким образом, получают защищенный дотриаконтапептидамид в виде аморфного порошка.П р и м е р 7. Н-цис-гли-асц-лей-сер-тре-цисмет-лей-гли-тре-тпр-тре-глн-асп-фал-асц - лизфал-гис-тре-фал-про-глн-тре-ала-иле-гли - валгли-ала-про-КН. .(кальццтоциц М).1150 мг БОК-цис-глп-асц-лей-сер (тбу) -тре(тбу) -цис-мет-лей-гли-тре (тбу) - тцр (тбу) -тре (тбу) -глн-асп(Отбу) -фал-асн-лцз(БОК) - фалгис-тре(тбу) -фал-про-глн-тре(тбу) - ала - илегли-вал-гли-ала-про-ХН. растворяют в 3 мл 95%-ной трифторуксусной кислоты, продувают азотом и оставляют стоять в течение 90 мин прц 25 С. Трпфторацетат освобожденного дотриаконтапептидамида после этого осаждают как аморфный порошок прибавлением 60 мл абсолютного эфира, отделяют центрифугированием, снова суспендируют в0 мл эфира, еще раз центрифугируют, ц остаток сушат при 30 С.Аналогично получают асн 5-кальцитонин М, И"-ацетил-кальцитонцц М, дезамино-кальцитонин М, дезамидо-про-кальцитонин М, И- ацетил-кальцптониц М, М- -пальмитоил-кальпитонин М, Хф -лаурил-кальцитонин-М. Предмет цзобрете ни я Способ получения гипокальцемическпх пептидов общей формулы ца, отличающийся тем, что пептид из це менее семи первых амицокислотцых остатков, содержащий днсульфидцый мостик, коцденсируют с 1 бы гцым методом с применением защисцых групп для всех или части МН - , ОН - и СООН-групп, с пептидом, содержащим417940 Составитель В. Кривцов Техред Г. Васильева Корректор О, Тюрина Редактор Л. Герасимова Заказ 1563/14 Изд.1327 Тираж 506 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раугпская паб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 осГальные аминокислоты до аминокислоть 32, с последующим удалением защитных групп под действием кислоты, например трифторуксусной, и целевой продукт выделяют известными методами.