Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае, используемый для получения липополисахарида

//С 12 В 1;2 С 12 НТНОЕ ОСУДАРСТВЕННОЕ ПЕДОМСТВООСПАТЕНТ СССР)ПИСАНИ Б ТЕНИЯ ПАТЕНТ аучно-исследоваиологии, микро- и и гигиены и овательский инскробиологии им,.Алещуки на аучно-исследо миологии, мик и гигиены Й КЕВ ЬЗУЕМЫ САХАРИД ЯЕЙ ДЛА отехноло- микробипроцессе ипополи(21) 4921020/13(54) ШТАММ БАКТЕРИРИЕОМОИАЕ, ИСПОЛПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОПОЛИ Изобретение относится к бигии и может быть использовано вологической промышленности втехнологического производства лсахарида (ЛПС) как антигена.Штамм КеЬзеиа рпецпопае выделяют из клинического материала больного диареей, он депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им Л,А.Тарасевича под номером 211 и характеризуется следующими признаками,Морфологические признаки: грамотрицательные палочки, спор и жгутиков не имеют, неподвижньи.; при окраске в тушевом препарате по Бурой установлена продукция капсулы, размер которой достигает до 1/2 ание: биотехнология, диагноионных заболеваний. Сущтения: получение нового еа рпецщопае, стабильно го лимополисахарид (ЛПС).топае выделен из клиничеа больного диареей. Наибоной питательной средой для ия штамма служит мясопепс 0,25 О глюкозы и набором в. Урожайность штамма на тавляет 5,42 г сухой массы накультуры. Выход целевого ресчете на 1 л питательной яет 150 мг сухого вещества, ПС обладает стабильными анйствами. При иммунизации животных титр образующих- (Я авляет 1:16 - 1;32. 4 табл.(57) Использов стикаинфекц ность изобре штамма КеЬз продуцирующе Штамм К.рпео ского материал лее благоприят культивирован тонный бульон микроэлементо этой среде сос 5 л бульонной продукта в пе среды составл Полученный Л тигенными сво лабораторных ся антител сост диаметра тела бактериальной клетки. Злектронно-микроскопические признаки; палочки с закругленными концами, размер клетки - длина 2,01+ 0,21 мкм при в=950, ширина 1,24+ 0,08 мкм при п = 950/ При просмотре более 1000 клеток жгутики необнаружены.Культуральные признаки; на мясопептонном бульоне через 3 ч при +37 1 0,5 С наступает легкое диффузное помутнение среды, через 16 - 18 ч - помутнение с пленкой на поверхности среды с наслоением на стенки пробирки. На плотных питательных средах образуют через 18-24 ч при +37 ч,5 С колонии, которые выглядят следующим образом,Рост на среде Зндо: колонии темно-розового цвета с более темной окраской в центре, выпуклые с легким серо-металлическимблеском, маслянистые, диаметр колоний 1,0 - 1,5 мм, признаков диссоциации нет,Рост на среде К: колонии светло-желтого цвета, с более выраженной окраской в центре, куполообразные, маслянистые, диаметр колоний 1,0 - 1,5 мм. признаков диссоциации нет.Рост на среде Ворфеля-Фергюсона: колонии прозрачные, беловатого цвета, выпуклые. маслянистые, диаметр колоний 1,5 - 2,0 мм, признаков диссоциации нет.Рост на мясопептонном агаре: светлые полупрозрачные колонии, легко снимаются, диаметр 1,0 - 1.5 мм. признаков диссоциации нет.Факультативный анаэроб, оптимальные условия роста - аэробные; рост в диапазоне температур 12-43 С, оптимум +37 С.Оптимум рН питательной среды 6,8-7,0.Биохимические признаки;Штамм К,рпеивопае 211 ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, мальтозу, дульцит, адонит, инозит, сорбит и глицерин; до кислоты в ксилозу и рамнозу. Неподвижный. Утилизирует малонат натрия, цитрат Козера и Симонса. Не образует сероводород и индол. Обладает положительной уреазной активностью. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэр и отрицательную с метиловым красным, что свидетельствует о ферментации глюкозы с образованием ацетилметилкарбинола (ацетоина). Обладает лизиндекарбоксилазой и не обладает орнитиндекарбоксилазой, аргининдегидролазой и фенилаланиндеэаминазой.Антигенная структура: серотипирование проводят с использованием набора сывороток по капсульному К) антигену ВНИИ ВС им. С.Мечникова.Штамм КеЬзеа рпецгпопае 211 серотипирован по Е-антигену, как К.рпеогпопа К 16.5, Чувствительность к антибиотикам;По результатам исследования методом стандартных дисков штамм чувствителен к неомицину, канамицину, гентамицину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину; устойчив: к мономицину. стрептомицину, эритромицину, метилиллину, левомицетину, ристомицину, полимиксину, бензлипенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандомицину; ампициллину, линкомицину, фузидину,"Способ, условия и состав питательных сред для хранения штамма,Способы хранения могут быть следующие, Лифоильно высушенные штаммы в ампулах на сахароэожелатиновой спеде хранят в холодильнике при+4 С.На полужидком голодном агаре следующего состава:Бульон питательный, содержащий 0,6- 0,9 общего азота,рН 72 - 74 1000 мл;Агар 2 - 4 г.Способ приготовления среды: агар расплавляют в горячем бульоне, фильтруют, разливают по 8 - 10 мл в пробирки, стерилиэуют при 121 С 30 мин,Культуру засевают 2 - 3 уколами в столбик среды, помещают в термостат (37 С) и 51015 ды 3 сут, Диализат центрифугируют (6000 об/мин 30 мин), В супернатанте содержится ЛПС и нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты(НК) осаждают цетавлоном,2;-ный водный раствор цетавлона прибавляют к су 55 после 18 - 20 часового инкубирования заливают 1,0 мл стерильного вазелинового масла, Хранят при +4 С в течение 2-3 мес.П р и м е р 1. Штамм" КеЬзеа 20 рпентопае находится в ампулах в лиофильно высушенном состоянии, Для производственного процесса производят оживление культуры. С этой целью ампулу вскрывают, содержимое разводят в 2,0 мл мясопептон ного бульона, Затем культуру инкубируют втермостате при 37 С - 3 ч, Живая культура дает диффуэно-мутящий рост.В качестве инокулятаиспользуют смывсуточной агаровой культуры плотностью 5 - 6 30 млрд м.т./мл. Культивирование проводятпри 37,1:" 0,1 С на стационарной установке с емкостью реактора 10 л в течение 4-6 ч, Скорость вращения мешалки 400 об/мин, скорость подачи воздуха 0,2 л/мин. Исполь зуют четыре среды; мясопептонный бульонс различными добавками (МПБ) (3 варианта) - среды с белковой основной, среду Ворфеля-Фергюсона - с углеводной основой. Объем питател ьн ых сред - 5 л, р Н 7,2 + 0,1.40 Результаты культивирования штаммапредставлены в табл.1.Стабильная урожайность штамма всреднем составляет 4,5 г сухой массы на 5 л бульонной культуры.45 Бактериальную массу ресуспендируютв дистиллированной воде (1 = 65 - 68 С) в 2,5-кратном объеме к весу осадка, затем приливают эквивалентный объем 90 водного раствора фенола, подогретого до 65- 50 68 С, Водно-фенольную эмульсиюбактериальной массы выдерживают на водяной бане йри той же температуре в течение 30 мин, после чего охлаждают до 4 С и диализуют против проточной холодной во1788965 Выход ЛПС Основасреды Среда для культивирования Урожай"ность ее ее г сухого Ф выхода вещества штаммаг сухоймассы Белковаяоснова 16,45 4,56 0,750 3,71 0,448 12,1 Углеводная основа Среда Ворфеля"Фергюсона 2,22 0,3 13,5 пернатанту, содержащему ЛПС и НК, в соотношении 1:1, Суспензию выдерживают30-40 мин при+4 С и затем осаждают центрифугированием (6000 об/мин - 30 мин).В полученном супернатанте содержится ЛПС, в осадке - НК,Лиофильно высушенный препарат ЛПСвзвешивают и определяют процент выходалипополисахарида от исходного количествасухой бактериальной массы. 10Выход целевого продукта в пересчетена 1 л питательной среды составляет 150 мгсухого вещества. Наибольший выход ЛПСотмечен на среде МПБ с 0,25 ОД глюкозы инабором микроэлементов. 15П р и м е р 2. В полученных сериях ЛПС(см, пример 1) определяют общее содержание липидов сульфованилиновым методомиуглеводов феноловым методом,Результаты представлены в табл,2. 20Как видно из данных табл.2 количественное соотношение общих липидов и углеводов в 1 г сухого вещества целевогопродукта различных серий стабильно. Этосоотношение находится в пределах 1:0,02- 251:0,04.,П р и м е р 3, Отбирают серию ЛПС.полученную из биомассы бактерий, накопленной на мясопептонном бульоне с 250глюкозы и набором микроэлементов. Отобранным препаратом ЛПС иммунизируют Мясопептонный бульон 5,0 лрН - 72+0,1 Мясопептониый бульон с 025глакоэы с комплексом микроэлементовМПБ с добавками;КН 1 РО - 0,021, 11 а Н 1 О, 0,2 ЖИВБО, - 0021 К БО. - 002Ы 1,С 1 - 0081 СаС 1 - 0013ГеБО - 001 Ф 11 пБО - 023СцБО - ООИ 11 ас 1 - 05 ФЭДТА-Иа - О, 08 ь Нас 1 - 0,23, К БО, - 01 ФМАМБО, УНро - 0025 сахароэа " 2 ь дрожжевой экстракт - 02 Фсухой лабораторных животных (кроликов породы Шиншилла, белых крыс) с полным адъювактом Фрейнда. Затем определяют титр антител к ЛПС по Ухтерлони.Результаты представлены в табл.3.Как свидетельствуют данные в табл.3, отобранная серия ЛПС обладает стабильными антигенными свойствами с колебаниями титров антител в пределах не ниже 1:16.П р и м е р 4. Проводят контрольные серии культивирования штамма на мясопептонном бульоне с 0,25 О глюкозы и набором микроэлементов, Результаты представлены в табл,4.Как следует из данных, представленных в табл.4, проведенные исследования в 1987, г. и в 1988 г. позволяют сделать вывод о том, что штамм К.рпецп 1 опае ЬЬ 211 при культивировании на мясопептонном бульоне с 0,25 оь глюкозы и набором микроэлементов характеризуется стабильным выходом биомассы, при этом образующийся ЛПС обладает стабильными биологическими свойствами. Таким образом, полученный штамм может быть эффективно использован в производственном процессе для получения ЛПС.Формула изобретения Штамм бактерий КеЬБеПа рпеитопае ГИСК М 211, используемый для получения липополисахарида.Таблица 5,42 0,562 10,41788965 Таблица 2 Таблица 3 а оставитель М,Сероваехред М,Моргентал орректор С,Пекарь Редак Заказ 82 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, )К, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужго агарина,