Способ количественного определения активности каталазы

(5 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ И РЕТЕН ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. БюлМ 22радский госмаков и О.Е.8 (088.8)т 6.0, Нап апаузз, 19 рственныи ун лагова ЬооМ о 1 Епгупасс 76, Магсе Оейсег,Б КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕАКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ .тение относится к медицине иможет быть широко использоваческой медицине и диагностикевания.функциональной активноИзобретение относится к медицине и биохимии, в частности может быть широко использовано в клинической медицине и диагностике для тестирования функциональной активности фагоцитов периферической крови человека при определении иммунного статуса организма,Целью изобретения является повышение чувствительности способа,Способ заключается в том, что инкубацию каталазы осуществляют с ферментативной пероксидгенерирующей системой, которая содержит глюкозу в количестве 3 - 40 мкг; в пероксидгенерирующую систему (глюкозооксидазную систему - ГОС) добавляют в качестве индикаторного вещества люминол в насыщающей концентрации 5 10 М, определяют величины хемилюминесценции эталонных проб, по которым строят калибровочную(57) Изобребиохимии ино в клинидля тестиро ША М 3926732, кл. С 12.Я 2 1655990 А 1 сти фагоцитов периферическои крови человека при определении иммунного статуса организма. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для определения активности каталазы используют пероксидгенерирующую систему, состоящую из глюкозы и глюкозооксидаэы, и пероксидрегистрирующую систему, состоящую из люминола и пероксидазы. Образующиеся в ходе пероксидазной реакции кванты света регистрируют при помощи люминометра или сцинтилляционного счетчика. В присутствии каталазы снижается стационарная концентрация пероксида, причем снижение пропорционально активности каталаэы. Чувствительность способа 0,42 - 0,65 ед,активности в пробе, 4 фиг,кривую зависимости величины хемилюминесценции от активности каталазы в эталонных пробах, после чего измеряют хемилюминесценцию искомой пробы и по калибровочной кривой эталонных проб определяют активность каталазы. Способ заКл ючается в использовании пероксидгенерирующей ферментативной системы ГОС и в регистрации люминолзависимой хемилюминесценции, уменьшение значений которой характеризует разложение перекиси водорода каталазой, В используемой биферментной системе происходят следующие реакции: 1) пероксидгенерирующая система (глюкозооксидазная система) в присутствии л юминола: глюкоза+ Н 20202 глюкозооксидаза глюконат+ Н 2022) Н 202 + аюмииоа пероксидааа амиНОфталат+ Н 20+ Й 2, 1655990Образующиеся в ходе реакции кванты света регистрируются при помощи люминометра или сцинтилляционного счетчика,Люминол (5-амино,3-дигидрофталазиндион) при окислении пероксидом в водных основных растворах дает яркую хемилюминесценцию, Структурная формула люминола приведена ниже; ОН ОСООН 1ООИН СООНИН 2 О ф 2 О, ИН 2 люминол диазохинон аминофталат (конечный продукт реакции)Показано, что в процессе его окисления образуются такие продукты, как диазохинон и 3-аминофталевая кислота. Последняя является конечным продуктом окисления, По-видимому, 3-аминофталат является эмиттером света.При добавлении к пероксидгенерирующей системе с люминолом каталазы эффективная концентрация (Н 202) снижается в результате ферментной реакции: 3) Н 20 каталаза Н 2 О 2+ О 2.,Это вызывает снижение квантового выхода в реакции (2) и, следовательно, уменьшение величины хемилюминесценции,Таким образом, уменьшение величины хемилюминесценции системы 1.+2. при добавлении каталазы за определенный интервал времени соответствует количеству перекиси водорода, разложенного каталазой эа данный интервал времени.На фиг,1 представлены кривые кинетики хемилюминесценции пероксидгенерирующей системы с люминолом в отсутствие и в присутствие каталазы представлены, Во всех случаях инкубационная смесь содержит 0,5 мл раствора ГОС, 40 мкг глюкозы, Конечный объем проб 0,6 мл, Кривая 1 соответствует кинетике хемилюминесценции в отсутствие каталазы, а кривые 2 - 6 - в присутствии каталазы соответственно с активностью 3,9; 3,9 х 2; 3,9 х 4; 3,9 х 8; 3,9 х 16 ед,активности фермента,На фиг.2 представлена кривая зависимости величины максимальной интенсивности хемилюминесценции от концентрации каталаэы в пробе,п 1 макс Отношениеблизко к 1, что сви 1 пСдетельствует в пользу первого порядка каталээной реакции, Данная кривая построена на основе кривых фиг,1, т,е. при концентрации глюкозы в системе, равной 40 мкг. Средний участок кривой 2 соответствует значениям активности каталазы 0,78 х 4 0,78 х 70 ед, ферментативной активности (т.е. диапазон измеряемых активностей каталазы около 1 порядка). Причем возможность определения предельно низкой активности фермента 10 достигается использованием в пероксидгетельности данного метода, Использование глюкозы в концентрации ниже 3 мкг на пробу невозможно для данного метода, так как для построения калибровочной кривой за 25 висимости хемилюминесценции от активности каталазы необходим диапазон изменений интенсивности (величины) хемилюминесценции как минимум на 1 порядок,30 35 а именно, использование 3 мкг глюкозы в пробе позволяет получить уровень хемилюминесценции, превышающий фоновый на порядок.С другой стороны, концентрация глюкозы 40 мкг на пробу является верхним предельным значением, позволяющим сохранить высокую чувствительность метода, так как при повышении концентрации глюкозы 40 мкг возрастает интенсивность хемилюминесценции и активность каталазы, способная эаингибировать реакцию и снизить хемилюминесценцию, возрастает до значений не менее 2 - 3 ед. активности,На фиг,4 представлена кривая зависимости интенсивности хемилюминесценции от концентрации люминала в инкубационной среде,Реакция протекает в условиях насыщения по люминолу, что следует иэ графика зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминола в инкубационной среде (концентрация глюкозы в пероксидгенерирующей системе неизменна - 40 мкг ). Квантовый выход реакции достигает максимума при концентрации люминола 2 - 5 х 10 М и остается неизменным-5при дальнейшем ее увеличении, Таким образом, рабочей концентрацией выбрана 5,10 М. Использование более высоких концентраций люминола не приводит к,улучше 40 4550 55 нерирующей системе глюкозы в количестве 3 мкг, в то время как стандартная система ГОС содержит 40 мкг, Кривая зависимости величины хемилюминесценции ) от активности каталаэы, вносимой в пробу (фиг.3), построена при концентрации глюкозы в системе 3 мкг/пробу. Активность каталазы 0,42 - 0,65 ед, активности дает снижение величины хемилюминесценции на 10 О, что является достбверным изменением и может служить нижней границвй оценки чувстви 1655990нию условий протекания реакции, однако сопровождается повышенным расходом дефицитного компонента инкубационной среды.П р и м е р. В качестве эталонной используют каталазу фирмы "Яегчз" вв 2 ИЮО из печени быка с удельной активностью 39000 ед. тамг, Суспензию фермента в воде, насыщенной тимолом, 20 мгмл предварительно разбавляют в 1000 раз 9 мкл,78 ед. активности). В качестве искомой используют каталазу фирмы "Реахим" из печени крупного рогатого скота марки "Б" с щедполагаемой удельной активностью 41660 ед./мг.Глюкозооксидззную систему ГОС состзвлявт по Ллойду. Проба содержит 3 или 40. мкг глюкозы. Конентрация ламинола - нзсыщающая 5 10 М. Конечный объем пробы 0,6 мл, Каталазу вносят в объеме 100 мкл, Конечное объемное соотношение компонентов в смеси - проба. ферментативная система: индикаторное вещество - 0,5;1 О.:0,05.Во всех случаях инкубационная смесь содержит 0,5 мл раствора ГОС. Инкубационную смесь, содержащую все компоненты, . включая катзлвзу. прединкубируют в темноте в течение 1,5 мин, чтобы исключить эндогенный пероксид, Реакцию инициируют добавлением глюкозы, Измеряют хемилюминесценцию эталонных проб в течение 10 - 12 мин на жидкостном сцинтилляционном счетчике "Б ЕТА", термостатиро ванном при 37 С, и получают кинетические кривые хемилюминесценции для эталонных проб. На основе полученных кривых кинетики изменения величины хемилюминесценции эталонных проб в отсутствие и в присутствие каталазы (фиг.1) строят калибровочную кривую зависимости максимальной величины (интенсивности) хемилюминесценции отактивности каталазы в пробе (фиг.2,3).Затем аналогичным образом получаюткинетические кривые хемилюминесценции5 для искомой пробы, в двух разведениях.Каталазу "Реахим" с предполагаемойактивностью 41650 ед./мг разводят до получения предполагаемых концентраций 80 и160 ед., а именно каталазу разводят до пол 10 учения расчетной:концентрзции ФО ед/мг идалее берут по 2 и 4 мкл.По графику калибровки оказалось, чтовнесение в п робу 2 мкл суспензии кзталазыс искомой активностью дает максимальную15 величину хемилюминесценции иа пределечувствительности, что соответствует 2,7 ед,активности, а 4 мкл соответствует 5,5 ед.активности, т,е, активность кзталазы "Реахим" упала в 30 раз по.сравнению с марки 20 ровочными данными, т,е. удельная2,7 едактивность искомого препаратах2 мкл1000-1350 ед./мг вместо маркировочных41650 ед, /мг.25Формула изобретенияСпособ количественного определениюактивности каталззы, включающий инкубацию анализируемого образца в ггрисутствии30 пероксидгенерирующей системы, состоящей из глюкозооксидазы и углеводного субстрата, и пероксид регистрирующейсистемы, состоящей из пероксидззы и субстрата пероксидазы, о т лиц е ю щи й с я35 тем, что, с целью повышения чуествительности способа, в качестве углеводиогь субстрата глюкозооксидазы используютглюкозу в количестве 3 - 40 мкг, а в качестве1655990 ГО Ее мИ Ру 3 Составитель Т. СеменовРедактор Т, Лазоренко Техред М.Моргентал Корректо ск аказ 2030 Тираж 368 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 и ГКНТ СС Производствен