Способ получения биологически активного вещества, обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкозную толерантность

Союз Советскик Социалистических Республик(23) Приоритет - (32) 0 1.0 2,7 7 (31) 10397/77 (33) Япония А 61 К 37/02ОС 12 В 1/04 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Иностранная фирма Какеньяку Како Кабусики Кайсяф )(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО СПОСОБНОСТЬЮ УСИЛИВАТЬ СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА И УЛУЧШАТЬ ГЛЮКОЗНУЮ ТОЛЕРАНТНОСТЬ 1 2Изобретение относится к микробио-логической промышленности и касаетсяполучения биологически активного вещества,Предлагаемый способ новый, в патентной и научно-технической литературе не описан,Целью изобретения является получение биологически активного вещест О ва, обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкоз йую толерантность .Это достигается тем, что патогенный штамм ВогдесеИа регсиззз.з вы- )5 ращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и стимуляторы роста с последующим выделением из культуральной жидкости белковой фракции с мо лекулярным весом 77000+6400, определяемым с помощью гель-фильтрации и очисткой целевого продукта.Способ осуществляют следующим образом. 25Патогенный штамм ВогдесеИа регспзз 1 з выращивают в твердой или жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минераль-.ные соли и стимуляторы роста. 30 Собирание и очистку биологически активного вещества от питательной среды производят любым из известных методов, например, осаждением 1 хроматографическим разделением, применением молекулярного сита, электрофоретическим методом и т.д., причем эти методы осуществляют отдельно, а также в соответствующих сочетанияхМетод хроматографического разделения в колонке является наиболее эффективным, в соответствии с ним верхний слой питательной среды пропускают через колонку, которая содержит наполнитель, например, продукт гидооксиапатиит, СМ-Сефароз С 1-6 В или Сопл - Сефароз - яь.Действующее вещество адсорбируется в этих колонках с высокой селективностью, после чего его вымывают подобранным элюентом, например, 0,1 М фосфатным буфером с величиной рН 7,0, содержащим 0,5 М хлорида натрия. После чего очищенный продукт подвергают диализу для освобождения ненужных солей, вследс:вие чего получают биологически активное вещество.Применяют также метод аммонитсульфатного осаждения. Для этого в верхний слой питательной среды добавляют,5-ный раствората меди, мл ьХлористый натрий 2,5 водят следующим образом. Глюкозу. вводят через рот (в дозировке 0,15 г/20 г живого веса) ьщшам в возрасте от 20 до 25 недель, после чего отбирают 5 животных,кагорые демонстрируют определенный недостаток глюкоэной толерантности по сравнению с животными нормальной группы (штамм ййу), Как показано в табл. 14, у этих мааей не наблюдалось снижения содержания глюкозы после ее введения в организм, вследствие чего этих живот- о ных можно было,с,определенностью считать больными диабетом. Животным этой группы ьышей КК вновь ввели через рот глюкозу на третий день после инъекции в хвостовую вену цредла" 5 гаемого вещества. В результате установили, что их глюкоэная толерантоность была в значительной степени улучшена в сравнении с тем, что имело место до введения предлагаемого ве) щества. Глюкозная толерантность таких иааей является более высокой, чем у мьааей нормальной группы. Таким образом, можно считать, что введение в организм БАВ приводит к удовлетворительному терапевтическому эффекту при лечении самопроизвольного диабета.Данные об улучшении глюкоэной толерантности у ьаааей КК путем введения в их организм БАБ приведены в табл.14,ЗОфармакологическая активность БАВ проявляется по истечении нескольких часов после его введения в организм, достигает максимального уровня в пе- Зз риод от 3 до 7 дней, а затем постепенно снижается. Ниже приведены результаты экспериментов по определению продолжительности действия в.организме крыс (0,5 мкг) и собак (1,0 мкг/кг)ЩУ собак исследования производились по определению глюкозной толе" рантности в ответ на введение в орТ а б л и ц а 1 Каэаминовая кислота Дрожжевой экстракт, Первичный кислый Фо калия, гРастворимый крахмал,г ганизм глюкозы путем внутривенной инъекции на 15-ый день после введения БАВ, а также по определению действия, вызывающего секрецию инсулина в ответ на введение эпинефрина и глюкагона на 29-ый и 42-ой дни (соответственно) после введения БАВ. В результате на 42-ой день наблюдают достаточную активность (табл. 15). У крыс приблизительно 50-ную активность по сравнению с максимальной активностью, (по истечении 3 дней после введения БАВ) отмечают на 28-ой день после введения.На основании этих результатов можно сделать вывод о том, что фармакологическое действие БАВ сохраняется в течение от нескольких недель дбнескольких месяцев, хотя сила такого действия вследствие дозировки является неопределенной.Данные об усилении инсулиновой секреции у собак, вызванном введением внутривенной инъекции 25 мкг/кг глюкагона на 42-ой день после введения в организм БАВ, приведены в табл. 15. ЭфФективная доза и способ введения в организм. Эффективная доза БАВ для лечения человека составляет от 10 мг/кг живого веса до 1 мкг/кг живого веса.в случае .очищенного образца вещества. Однако это вещество можно также единовременно вводить в дозах, которые достигают 2 мкг/кг живого веса и даже больше.Наиболее эффективным способом, введения в организм является внутривенная инъекция, однако предлагаемое вещество можно также вводить другими путями.Предлагаеьнй способ позволяет получить биологически активное вещество, обладающее способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкозную толерантность.г Продолжение табл. 1871721 21 22 Количествораствора,Стадии Верхний слойпитательнойсреды 100 0,318 22000 10000 2000 607 55 193,0 19,9 159 125 СМ-Сефарознаяколоночнаяхроматография 52 1009 22110 11,3 251 45 Таблица 3Удельная активность,ед/мкг 57,1 Образец Образец 25В 93,0127,2 81,0 ЗО д Таблица 5 35 Порощкообразный агар,тиллированная вода,мл 10 Казаминовая кислота,гДрожжевой экстракт,г блица зировка, кг/животное Единица сфат Первичный кислыкалия, г 62 53 54 16 32 ал,5 1,5 Растворимый к 0,5-ный расфата меди, мл сул 10 ри 250 12 липептон, г 5 1000 5 раст 57 2000 су ата 1 2,0Среднее значение иля 5 животных,г Гидроксиапатитная колоночная хроматография+ м л 16 В д Х 3 с дхаих 66 х 5 ццфх 11оо 1 к 1 аойоши 1 ЭОанвх333 оад 111.11 йл1 Ю о с с о о ЮсО лсо Чоссч о 1 х ал 1 Вх1 Хо3 Э1х1о1 цаоохн1 ЯХ1 ХВев1 о х о Б х И х а э ха ан н ВВ 3 х х Ю О 3 1 Ц о 1 Я1 Э1 а1 Ф1 Р11 Юйо1 Х1 Я1 ЦОа хх а в во х х хи хо 333 Х ц е во 1 1 3 91 161 Ю 1 1 1 1 Ю Х 3 1еВ 1 в1 Е 3Ц оо(Ч 1 1 1 1 1 ох 1 ха ас х . йх э ф ьа 1 ое ан ха 1 це ох Гф Е 1 Ю871721 25 26 Таблица Дозировка, мкг/кг онтрольная група 1 32 б 1 группд животных получивших БАВ.0,05 3 1 17 3 73 37 9 3 196 100 24 5 360 230 10 13 320 60 19 б Ш щфщщ щщщщще значение мкед/мл для 3 животсоответствующих случаях.Таблица 9 ание: ср ным После введениястимулято Вещество Группа испытуемыхживотных юков 20 7+ 89+36 Контрольнаягруппа.101 одержание глюкозы крови, мг/мл:. у контрольной группы у жив от ных р которым ввели ВАВ871721 28 Таблица 11 каз оэы,ая группа 681 102; 108+4 11414 120+ ивотны ие БАВ олучи 2 4.8+ 1 72+ 6216 69 Содержание инсулинав плазме, мкед/мп:контрольная группа 471 5+ 1+ животныешие БАВ и т 4 126 104 10 61 и ц Показ ател тные контрольной гр люкозыд/мп 94+3 375+2 60+16 3558 3 одержание плазме м нсулиед/мл е, кот ы 8:2 358119 0+35 19941 145122 на держание инсу плазме,мкед/млВ б 5 69 т м е ч а н и е: среднее эначение 1 СП для 5 живот в соответствукщих случаях. Таблица 1 уппа испытуемыживотных 5 3 Животные контрольнойгруппы 327123 264(18+2 (2215) 173 отные, котли БАВ 2+б .,159+16 177142)" (49+2) 14113 Животы группы ормальной 138+7 13 13011 1617+1 (424)5)кед/ люкоэы в крови (мг инсулина в плазме Содержани Концентра нцентрация крови, мг/ контрольн Жи Содержание в крови мкЖивот Содержание в крови, м 203 303 264ым предварительно ввели Б рактеристики показателей через определенное время, минГ 1Содержание глюкозы в крови, мг/мл, послеее введения через определенное время, мин.1 Т ." 1".(". Группа испытуеьнх животных 0 30 Животные нормальнойгруппы Ьвши штаммаййу) 9817 214116 339113 192+9 144114 Животные, бопьныедкабетом, (иажштаиаа дну) до введения в организмВАВ 1176 300+33 308121 32640 31039 После введения в организм БАВ 723 15011 118 Я.9 9018 63111ЕЮЕЮ тЮЮЮпВЕю,Т а б ппа испытуежхживотных Животны ной гру контрольрганкзмБАВ 8 1411 тные, в о рых ввели и о 61 формула об получе вещества ью усилив ать глю ю ч а ю щ огенный Вз выращиточнкк ные соли оследуюобретенияя биологически акобладающего спо" ь секрецию инсулиозную толерантность ийся в том, тамм ВогдеСе й и ерал РВа тельв в Составитель С Малютин Техред Л.Пекарь рррктор Н. Шв Павлов Редакт оноеССР Тираж 690 ВНИИПИ Государствен .по делам изобрете13035, Москва, Ж-Э 5, Р Заказ 8764/3 ого комитета ий и открыти ушская наб. 4 илиал ППП фПатентфф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Спостивногособностна к улучшз а к лчто патрегйива ной среде, содержаще углерода, азота, мин и стимуляторы роста, щим выделением из культ кости белковой фракции ным весом 7700016400, о с помощью гель-.фильтрац целевого продукта. Ъ алькой жид- олекуляределяемыми;очисткойтвердый сульфат аммония до достижения.такой точки, которая приближается кточке насыщения растворенной солью,а величину рН доводят до 6-.7 добавлением разбавленного водного растворааммиака, Затем осадок промывают водой, а биологически активное вещество экстрагируют иэ него 0,1 М раствором трис-буфера с величиной рН 8,0,содержащим 0,5 М хлорида натрия.Полученное биологически активноевещество представляет собой не расплывающийся белый или светло-коричневый продукт, который растворяетсяв воде при комнатной температурев концентрации от 3 до 5 мг/мл. Припопадании в 6 н.раствор соляной кислоты он образует нерастворимый белыйосадок. Он растворим в пиридине, додецилсульфате натрия, 2-меркаптоэта"йоле и цистиновом растворе. Добавление смеси сухого льда с ацетономили этанолом, трифторуксусной кислоты или раствора-хлористого цинка,или раствора, содержащего металлические ионы некоторых металлов враствор очищенного биологиЧески активного вещества на холоду(при 4 С)приводит к образованию мутно-белогоосадка. При попадании в смешанныйраствор воды и хлороформа или н-бутанола биологически активное веществоне растворяется и в таком растворесобирается вокруг поверхности раздела между двумя жидкостямиПри нагревании водного растворавещества до 80 С или выше оно становится мутно-белым. При растворениивещества в 0,1 М фосфатном буФере(при рН 7,0), содержащем 0,5 М хлористый натрий при проведении диалиэас использованием дистиллированнойводы в качестве внешней жидкости,вещество временно становится мутнобелым, а если диализ продолжать дальше, то вещество вновь полностью растворяется. Если высококонцентрированный раствор подвергают тщательномудиалиэу с использованием 0,01 Мацетатного буфера (рН,5.), то этовещество приобретает светло-коричневую окраску и растворяется, Молекулярный вес вещества 7700016400определен фильтрованием геля черезколонку с Биогелем Р, уравновешенным 0,1 М фосфатным буфером, ко"торый содержит 0,5 М хлористый натрий,Содержание белка превышает95 вес,Ъ,а содержание сахарина составляет 1 вес.Ъ,Концентрация липиданиже минимально определяемого предела.Биологически активное вещество усиливает секрецию инсулина и оказывает улучшающее действие на поддержание уровня глюкозы, причем эти действия сохраняются в течение от нескольких недель до нескольких месяцев после принятые одинаковойдозы. Острая токсичность ( Руо- 200 мг/кг живого веса.П р и м е р 1. Получение биологически активного вещества. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм ВогйеСеИ а рег 1 цзз 1 з подвергают культивированию в чашкахс использованием среды Борде-Жангупри температуре 37 фС в течение 2дней, а затем с помощью платиновойпетли осуществляют инокулированиеуказанными бактериями в 500-миллилитровой колбе для встряхивания, содержащей 200 мл ионообменной смолы,модифицированной средой Коен-Веелера 5 (среда КВ), состав которой приведенв табл, 1, добавленной с помощьюпипетки, после чего проводят процесскультивирования встряхиванием в те"чение от 20 до 24 ч при температуре щ 37 С. Концентрацию бактерий в питательном растворе измеряют с помощьюспектрофотометра (с длиной волны650 пв) 1 этот раствор добавляют вдвухлитровую колбу для культивирования встряхиванием, в которую добавляют с помощью пипетки 1 л ионообменной смолы совместно с введеннойв нее средой КВ, вследствие чего конечная концентрация бактерий равнаприблизительно 0,1 х 10 ф клеенок/мл, ЗО а затем проводят процесс культивирования встряхиванием в течение 48 ч(частота встряхивания составляла97 циклов/мин при температуре 37 С)При использовании этой жидкойсреды ее добавляют совместно с дистиллированной водой, взятой в количестве, достаточном для доведенияобщего объема до 1000 мл, а последоведения величины рН до 7,2 до О бавления 20-ного раствора гидратаокиси натрия в раствор среды дополнительно добавляют 3 г анионообменной смолы, а затем всю смесь подвер"гают обработке в автоклаве при тем пературе 121 С в течение 15 мин.Приготовленный после 48-часовоговстряхивания раствор с культуройподвергают выдержке при температере56 ОС в течение 30 мин, а затемцентрифугированию (при скоростивращения 15000 об/мин) при температуре 4 С с целью отделения верхнегослоя и бактериальной клеточной массы, после чего полученный такимобразом верхний слой раствора средыиспользуют в качестве исходного материала для очистки и выделения целевого активно действующего вещества.10 л этого верхнего слоя последоведения рН до 6,0 добавлением 1 н.60 раствора соляной кислоты вводят вгидроксилапатитную колонку (2,5 х 4 см)При расходе потока 200 мл/ч на первой стадии очистки.Большая часть белка проходит че рез колонку беэ адсорбции в ней, и871721 Степень чистоты вещества определяют в соответствии с методом дискового электрофореза с использованием полиакриламидного геля (полиакриламидная концентрация - 7,5, буфер 1 н. гидрат окиси калия - ледяная уксусная кислота с рН 4,3).Количество образца на гель составляет 30 мкг (в пересчете на белок), причем эксперимент проводят с приложением тока величиной 4 мА в течение 2 ч, с образованием пятен амидной черни 10 В и удалением пятен с использованием 7-ного раствора уксусной кислоты. Образец, полученный на этой последней стадии, представляет собой единственное вещество, которое совершенно свободно от примесей, а активность в отношении ускорения секреции инсулина, которую определяют в ходе проведения эксперимента, соответствует активности выделенного вещества. Для установления подробного строения биологически активного вещества его подвергают последующему НДС (натрийдодецилсульфатному) полиакриламидному гелевому электрофорезу.Образец биологически активного вещества в количестве 50 мкг/пробирку (в пересчете на белок) добавляют в смесь 1 НДС, 1 2-меркаптоэтанола и 4 моль мочевины, а после двухчасовой инкубации при температуре 37" С эту смесь помещают в 10-ный полиакриламидный гель, который содержит 1 НДС. Затем, после четырехчасового пропускания тока 8 мА/гель, получают пятна с использованием Сооваяя гоЛу. бого с последующим удалением пятен 7,5-ной уксусной кислотой. целевую секреторную инсулиновую активность определяют с трудом. Концентрацию белка измеряют по методуЛоури.Для определения адсорбированныхвеществ колонку вначале промывают0,01 М фосфатным буфером (при рН 56,0), а затем (после повышениямолярной концентрации фосфатногобуфера до 0,1 и рН до 7,0) элюируютадсорбированные Млки, Однако вэтих условиях не элюируют целевое 10биологически активное вещество. Дополнительное элюирование осуществляют с использованием фосфатногобуфера того же самого состава, носодержащего 0,5 М хлорида натрия, 15В этих условиях целевое вещество может быть выделено с высокой эффективностью в соответствии с элюированнымбелком.Полученное биологически активное 20вещество концентрируют и после егопомещения в диализную мембрану с максимальным молекулярным весом для проникающих молекул 8000 дважды проводят диализ (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием дистиллированной воды и дважды (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием 0,01 М Фосфатного буфера (срН 6,0). Для дальнейшей очистки раст- ЗОвор, содержащий диализированное биологически активное вещество, пропускают через колонку (1,5 х 10 см) с карбоксиметилсефарозой С),-6 В, уравновешенной 0,01 М Фосфатным буФером(с рН 6,0), Продукты, которые не были35адсорбированы в этой колонке, непроявляют никакой активности, Затем,после повышения молярной концентрациии рН фосфатного буфера соответственно до 0,1 и 7,0, аналогичное элюированне осуществляют добавлением 0,5 Мсоли, в результате чего получают целевое биологически активное вещество,которое согласовывалось с элюированным белком. 45Так как этот продукт все еще содержит небольшое количество примесейв дисковом электрофоретическом на" правлении, это вещество подвергают дальнейшему концентрированию, а после помещения в диализную мембрану дважды диализируют (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием дистиллированной воды и дважды(в общей сложности в течение 12 ч) с использованием 0,01 М фосфатного буФера (срН 7,0), а затем диализированный образец пропускают через колонку (1,5 х 8 см) с КонА- сефароэой 4 В, которую уравновешивают 0,01 М Фосфатным буфером (с рН 7,0). 60В результате проявления тем жесаьым буфером элюируют незначительные следы белка, однако этот белко" вый компонент не обладает никакой активностью, Дальнейшее элюирование; 65 0,1 М фосфатным буфером (с рн 7,0), содержащим 0,5 М хлористого натрия, позволяет получить вещество, кото-рое соответствует элюированному белку.Поскольку эта часть все еще содержит незначительное количество примесей в дисковом электрофоретическом направлении, такой белковый компонент собирают, конденсируют и подвергают диалиэу с использованием 0,1 М фосфатного буфера (с рН 7,0), который содержит 0,5 И хлористого натрия, после чего диализированный образец подвергают гелевому фильтрованию пропусканием через колонку (2,8 х 60 см) с Виогелем Р, уравновешенным тем же самим буфером.В результате этого получают чистое биологически активное вещество, которое соответствует белковому компоненту, характеризовавшемуся наличием пика на уровне молекулярного веса приблизительно 80000.В табл. 2 представлены данные, характеризующие степень очистки препарата.П р и м е р 2. Лиофилизованныйи консервированный микроорганизмВогс 1 е 1 еИа рег 1 цзз 3.э (штамм 9 1 Н114/3779 В/) подвергают культивированию встряхиванием с лоследующимвыделением по аналогии примера 1,в результате чего получают 10 лповерхностного слоя культуры в жидкой среде.Полученный таким образом поверхностный слой далее разделяют на двечасти, одну из которых пропускаютчерез колонку с гидроксиапатитом(2,5 х 4 см) с расходом потока 200 мл/чпосле доведения величины РН поверхностного слоя до 6,0 добавлением 1 н, соляной кислоты. Эту колонку промывают водой, а затем адсорбированное вещество элюируют 0,1 Мфосфатным буфером, который содержит0,5 М хлористого натрия (с величинойРН 7,0),Полученный таким образом элюатпомещают в диализную мембрану спроницаемостью для веществ максимального молекулярного веса 8000 и трижды проводят диализ с использованиемдистиллированной воды (в общей сложности в течение 18 ч), в результатечего получают биологически активноевещество. После этого полученное вещества подвергают обработке сушкойс вымораживанием, вследствие чегополучают тонкодисперсный порошкооб-разный белок коричневато-белого цве"та, который ускоряет секрецию инсулина.В другие 5 л поверхностного слоякультуры в жидкой среде добавляютдо 90-ной степени насыщения сульфатаммония (доведя РН до 6,5 добавлением слабого водного раствора аммиака),"в результате чего все белковыевещества выпадают в осадок. Затемосадок полностью промывают водой иподвергают выщелачиванию буфером0,1 М трио,5 хлористого натрия (свеличиной РН 9) с получением экстрактного раствора. Этот приготовленныйэкстрактный раствор вначале нейтрализуют 1 н. раствором соляной кислоты, а затем подвергают трехкратномудиализу (в общей сложности в течение,18 ч) с использованием дистиллированной воды и вышеупомянутой диализной мембраны для получения биологически активного вещества, в результатечего получили 11,2 мг высушенноговымораживанием порошка (образец В). П р и м е р 3. С использованием лиофилизованного и консервированного микроорганизма Вогйе 1 еИа рег 1 цзз 1 з (штамм Маепо, фаза 1) повторяют эксперимент, описанный в примере 1, в результате чего получают 23,6 мг и 10,8 мг каждого иэ лиофилизованных порошкообразных образцов биологическ активных веществ (образцы С и Д),Удельная активность каждого образца приведена в табл. 3.Острая токсичностьР 0 ) длякаждого образца при внутривенном введении мышам приведена в табл. 4.Таким образом, порошкообраэныеобразцы биологически активных веществмогут быть использованы в качествелекарственных или профилактическихсредств при диабетах, причем их эффективная дозировка находится винтервале 1-100 мкг/кг живого веса.П р и м е р 4. МикроорганизмВогде 1 еИ а реггизз 1 з (штамм Тояма,фаза 1) подвергают культивированиюпо.аналогии примера 1, а верхний 15 слой культуры в жидкой среде, приготовленный выделением иэ микроорганизма, используют в качестве исходногоматериала. Ацетон, который предвари"тельно охлаждают сухим льдом, по кап- Щ.лям добавляют в 100 л встряхиваемогоповерхностного слоя с охлаждениемсухим льдом до конечной концентрации60. После этого осадок собирают спомощью сепараторной центрифуги непрерывного действия (скорость вращения - 5000 об/мия, температура 4 С),.Полученный таким образом остатоквысушивают с получением продукта,который растворяют в 500 мл 0,01 М о фосфатного буФера (с РН 6,%) а затем пропускают через колонку (5 х 4 см)с гидроксилапатитом. Биологическиактивное вещество накоплено в компоненте, который элюируют 0,1 МФосфатным буфером (с РН 7,0), содержащим 0,5 М хлористого натрия.Элюированное.вещество собирают, конденсируют и подвергают диалиэу с использованием 0,01 М фосфатного буфеРа (с РН 6,0), а затем пропускают 40 через колонку с СМ- Сефарозой СЬВ(2,5 х 25 см), которую уравновешиваюттем жесамым буфером, а биологически активное вещество элюяруют 0,1 МФосфатяым буфером, содержащим 0,5 М -45 хлористого натрия, В дальнейшембиологически активное вещество,элюированное таким образом, собирают,конденсируют и подвергают диализу сиспользованием 0,1 М фосфатного буфе О Ра (с РН 7,0),содержавшего 0,5 М,хлористого натрия. После этого вещество помещают в колонку с БиогелемР(2 х 105 см), который уравновешивают 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 0,5 М хлористого натрия и4 М мочевины. Это биологически активное вещество представляет собойбелок, который характеризуется нали-.чием пика для молекулярного весаприблизительно 80000, причем полу 6 чают 38 мг его лиофялизованногопорошка. Полученный таким образомпродукт характеризуется нижеследующимхимическим составом: 95 вес.Ф и боль- и ше белка, 1-2 вес.% углеводов, при 65 чем не обнаружено никакого липида.Удельная активность продукта составляет 930 ед/мкг,П р и м е р 5. Лиофилизованныйи консервированный микроорганизмВогс)е 1 еИ а рег 1 изз 1 з (штамм Тояма,фаза 1) подвергают культивированиювстряхиванием по аналогии с изложенным в примере 4, а выделением бактериальной клеточной массы из культурыв жидкой среде получают 100 л поверхностного слоя. В полученный поверхностный слой добавляют 50-ного водного раствора хлористого цинка совстряхиванием при комнатной температуре до доведения величины рН до6,0 (конечная концентрация 1). Этотосадок растворяют в 10-ном вторичном фосфате натрия, а затем помещают в диализную мембрану, подвергаютдиализу с использованием воды с последующим уравновешиванием 0,01 МФосфатным буфером. Затем этот раствор пропускают через колонку (10 х 5 см)с гидроксилапатитом, после чего промывают 0,1 М фосфатным буфером (срН 7,0) с последующим элюированием0,1 М фосфатным буФером, содержавшим 250,5 М хлористого натрия. Полученныйэлюат конденсируют и пропускают черезколонку (2,5 х 100 см) с Сефакрилом8-200, а затем элюируют 0,1 М с фосфатным буфером (с рН 7,0), который у)содержит 0,5 М хлористого натрия и4 М мочевины. После этого проводятгелевое фильтрование с получениембиологически активного вещества.Молекулярный вес полученного вещества равен приблизительно 7200(с помощью гелевого фильтрования),причем получают 40 мг сухого порошка. Полученный продукт характеризуется нижеследующим химическим составом:приблизительно 95 вес. или больше 4 Обелка, 1-2 вес. углеводов, причемне было обнаружено никакого липида.Удельная активность составляла890 ед/мкг.П р и м е р б, Микроорганизм 45Вогйе 1 еИа рег 1 изз 1 з (штамм Тояма,фаза 1) подвергают культивированиюв среде БордЕ-Жангу при температуре37 фС в течение 2 дней, а затем в скошенной среде Борде-Жангу при темпера Отуре 37 С в течение 20-24 С, послечего с помощью платиновой петли указанными бактериями инокулируют модифицированную твердую среду Коен-Веелера с добавленным в нее древесногоугля (среда КВ), состав которой приведен в табл. 5, с последующим культивированием в течение 48 ч при температуре 37 ОС, 5 кг полученной влажнойбактериальной клеточной массы суспендируют в 5 л дистиллированной воды 60и выдерживают в ней при температуре5 бфС в течение 1 ч.После охлаждения в суспензию добавляют йдвегоза 6 до достижения ееконечной концентрации 0,01 и ее 65 подвергают центрифугированию (скорость вращения 15000 об/мин) в тече"ние 30 мин для отделения бактериальной клеточной массы. Собранную клеточную массу суспендируют в дистиллированной воде, которая содержит 4 мольмочевины и 1 моль хлористого натрия,а затем подвергают обработке в ультразвуковом оборудовании при низкойтемпературе (4 фС) для уничтожения.живых клеток бактерий.Полученную суспензию подвергают.центрифугированию (при скорости вращения 15000 об/мин) в течение 30 мин,а не содержащий осадка поверхностныйслой подвергают диализу с использованием воды с последующим уравновешиванием 0,1 М фосфатным буфером (срН 0,6), после чего пропускают черезколонку (10 х 5 см) с гидроксилапатитом. После выьывания адсорбированныхпримесей 0,01 М фосфатным буфером(с рН 7,0) целевое вещество элюируют0,1 М фосфатным буфером (с рН 7,0),который содержит 0,5 М хлористогонатрия.Полученное таким образом биологически активное вещество уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером (срН 6,0), а затем пропускают черезколонку (2,5 х 30 см) с СМ-СефарозойСЬВ. Эту колонку вначале промывают0,05 М фосфатным буфером с рН 6,0,а затем элюируют 0,1 М фосфатнымбуФером (с рН 7,0), который содержит 0,5 М хлористого натрия, с элюированием биологически активного вещества. Затем это элюированное вещество конденсирузт и растворяютв 0,1 М Фосфатном буфере (с рН 7,1),который содержит 4 М мочевины и0,5 М хлористого натрия, после чегопропускают через колонку (2,5 х 115 см)с Сефакрилом Я,После этой операции проводятэлюирование растворителем с получением 40 мг целевого вещества.На основании результатоз из:,: рений путем гелевого Фильтрования вычисляют, что молекулярный вес равен 74000, причем продукт характеризуется нижеследующим химическим составом: свыше 95 вес. белка, 2 вес.углеводов, причем не было обнаруженоникакого липида. Удельная активностьсоставляет 920 ед/мкг.Состав среды КВ приведен в табл.5.(При использовании. этой твердойсреды ее растворяют нагреванием последоведения величины рН до 7,2, а затем в среду добавляют 5 г порошкообразного древесного угля и подвергают ее обработке в автоклаве притемпературе 121 С в т",чение 20 мин).В качестве эффективного получениябиологически активного вещества могут быть различные хроматографические обработки. Осуществление такогометода при его соответствующем включении в последовательный ряд операций процесса получения, как это описано в примере 1, позволяет частично исключить стадии получения. В дальнейшем как очистку, так и получение при осуществлении такого метода проводят по аналогии с тем, как это изложено в примере 1. Этот метод изложен более подробно ниже.П р и м е р 7Лиофилизованный и консервированный микроорганизм Вогде 1 еИа рэг 1 иээ 1 з (штамм Тояма, фаза 1) подвергают культивированию (как описано в примере 1). 10 л полученного поверхностного слоя культуры в жидкой среде пропускают через 15 колонку ( размеры колонки 5 х 2 см, расход потока материала 60 мл/ч) с .гидроксилапатитом, а затем промывают 300 мл 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0). После этого через нее про пускают 0,1 М фосфатный буфер (с рН 7,0), который содержит 0,5 М хлористого натрия, с расходом потока 15 мл/ч, с целью элюировать биологически активное вещество. Полученное вещество конденсируют до объема примерно 15 мп с использованием продукта Фиколс последующим его четырехкратным диализом в общей сложности. в течение 24-часового промежут- З ка времени с использованием 2 л дистиллированной воды, а затем его под вергают вновь четырехкратному диализу в течение в общей сложности 24-часового промежутка времени с использованием 1 л 0,01 М ацетатного буфера (с рН 4,5), который содержит 0,1 М хлорида натрия или 0,1 М хлорида лития-хлористого водорода (с рН 4,5) для уравновешиванияЭтот продукт пропускают через колонку с и -ацеток сиртутьанилин-Сефароэой 6 МВ (размеры колонки 1,2 х 8 см), которую уравновешивают тем же самым буфером, что упомянут выше, с расходом потока 5 мл/ч, а после тщательной промывки тем же самым буфером адсорбированное вещест" во элюируют тем же самым буфером, к которому добавляют 0,01 М Ь -цистеина. Полученное вещество собирают, а затем кондвнсируют до объема приблизительно 0 5 мл с помощью продукта Фиколс пОследующим трехкратным диализом в общей сложности в течение 12-часового периода с использованием 0,1 М фосфатного буфера (с рН 7,0) в количестве 2 л, который содержит 4 моль 55 мочевины и 0,5 моль хлористого натрия для уравновешивания, после чего его подвергают дальнейшему уравновешиванию с использованием того же самого буфера. Гелевое фильтрова О ние осуществляют в колонке с Сефакрилом 8-200 (2,8 х 95 см).Биологически активное вещество получают в виде продукта с одним пиком молекулярного веса 650007000 65(как это в дальнейшем определяют по истечению эталонного белка), совпадающим с пиком активности, Это вещество подвергают диализу (с использованием 2 л дистиллированной воды, 5 раз в течение в общей сложности 48 ч), а затем лиофилизируют с получением 2,1 мг белого порошка.Этот продукт характеризуется единственной полосой при полиакриламидном гелевом электрофорезе (с рН геля 4,8) и нижеследующим химическим составом; свыше 98 вес.Ъ белка, причем не было обнаружено ни углеводов, ни липида.П р и м е р 8. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм Вогде 1 еИ а регСизз 1 з (штамм Тояма, фаза 1), подвергают культивированию (как в примере 1), а затем 10 л полученного таким образом поверхностного слоя культуры в жидкой среде пропускают через колонку (колонка с размерами 5 х 2 см, расход потока 60 мл/ч с гидроксилапатитом с последующей промывкой 300 мл 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0), после чего через колонку пропускают 0,1 М фосфатный буфер (с рН 7,0) при расходе потока 15 мл/ч.Полученное активнодействующее вещество конденсируют до объема 15 мл с помощью продукта Фикол, а затем подвергают четырехкратному диализу в течение 24-часового периода с использованием 2 л дистиллированной воды с последующим четырехкратным диализом в течение в общем 24-часового промежутка времени с использованием 1 л 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0) для уравновешивания. Биологически активное вещество пропускают через колонку с анти-БАО- -антитело-Сефароэой 4 В (колонка с размерами 1,8 х 13 см), а затем тщательно промывают приблизительно 20 мл 0,01 М фосфатного буфера (с величиной рН 7,0), который содержит 0,1 М хлористого натрия, с последующим элюированием 0,1 М глицин-хлористого водорода (с рН 3,0), который содержит 2 ммоль ЭДТК и 0,15 М хлористого натрия, с расходом потока 60 мл/чЭлюат сразу нейтрализуют 1 М глициновым буфером (с рН 11,5) .Биологически активное вещество собирают и подвергают трехкратному диализу в общей сложности в течение 48 ч с использованием 5 л дистиллированной воды с получением 1,9 мг белого порошка.Молекулярный вес этого вещества составляет 70000+5000 с получением единственной полосы при полиакриламидном гелевом электрофорезе гель с рН 4,3), Продукт характеризуется следующим химическим составом: 97 вес.Ъ или больше белка, 1 или13 871721 14 менее углеводов, причем не обнаружено никакого липида.П р и м е р 9. Фармакологическое действие белкового биологически активного вещества.Определение способности ускорять секрецию инсулина.Способность повышать скорость секреции инсулина у биологически активного вещества можно определить по реакции животного на стимуляторы секреции инсулина различных типов, причем обычно в качестве стимулятора для этой цели используют глюкозу.Подопытные животные.Самцы крыс И 1 в 1 аг .(с весом от 130 до 140 г).Ррубо очищенные или очищенные биологически активные вещества различной силы растворяют в физиологическом солевом растворе и внутривенно вводят по 0,2 мп каждого из этих растворов под эфирной анестезией в бедренную вену подопытной крысы, после чего по истечении трех дней измеряют для каждого вещества секреторную инсулиновую активность. За 18-20 ч до начала эксперимента крыс привязывают. Для измерения активности извконцентрация инсулина вплазме после введенияглюкозы (мкед/мп)1 /СШШШ Ш ш ае ШШ (мкед/мг) Концентрация глюкозы вкрови после введенияглюкозы (мг/мл) 40 Средняя величинасоотношения 61/ЬСдля животных, ворганизм которыхвводят экспериментальныевещества Средняя величинасоотношения Ь 1/В 6для животных контрольной группы Единица х .100 Средняя величина д 1/дб для контрольной группы Это вещество позволяет ускорятьсекрецию инсулина, однако оно обладаеттакже другими фармакологнчески полезными свойствами, в частности улучшенной глюкозной толерантностью, улучшенной реакцией, состоящей в секреции инсулина, ускоренным лечениемдиабета, вызываемого стрептозотоциноми улучшенной глюкозной толерантностьюпри наследственном диабете. Это действие сохраняется в течение от нес- Щ кольких недель до нескольких месяцевпри единовременном введении в организм такого вещества. Это наблюдалиу всех подопытных животных, включая .мышей, крыс и собак, фармакологи ческое действие такого вещества не Использование содержания глюкозы в крови для расчета активности обусловлено той причиной, что количество. секретируемого инсулина в значительной степени определяется содержанием в крови сахара. Удельную активность для каждоговещества получают делением единицына количество белка (метод Лоурии др,).Единица и дозировка (в пересчетена белок) биологически .активноговещества, полученного по примеру1, указаны в табл, б,Образец очищенного биологически активного вещества показывает сигмоидную.связь между реакцией и дозировкой, однако для расчета в единице и стадии очистки как для вещества, так и для его эквивалента был выбран максимально возможно линейный участокхвостовой вены каждой крысы отбираютпо 0,1 мл крови, непосредственнопосле чего внутрибрюшинно вводят 30 ный глюкозный раствор в количестве1 мл на каждые 100 г веса тела иточно по истечении,15 мин после этого по аналогии с вышеизложенным вновьотбирают по 0,1 мл крови. Секреторную инсулиновую активность определяютпо разнице содержания глюкозы в кровии по концентрации в крови инсулинаперед введением глюкозы и после введения глюкозы. Концентрацию глюкозыв крови измеряют согласно глюкозоксидазному методу, а концентрацию инсулина измеряют по двойному методу ан тител.Парентеральный раствор для внутривенного введения, используеьий дляпоследующего фармакологического эксперимента, готовят в соответствии 20 с вышеприведенным составом.Методика расчета инсулиновой секреторной активности. Вначале величинысоотношений й 1/д 6 активнодействующего вещества для группы животных, в 5 организм которых его вводят, и дляконтрольной группы животных получаютс помощью следующего уравнения:Концентрация инсулина вплазме перед введениемглюкозы (мкед/мл) Концентрация глюкозы вкрови перед введениемглюкозы (мг/мл)Единицу для каждого активнодействующего вещества можно получить с помощью нижеследующего уровнения:изменяется в сколько-нибудь сущест.венной степени в зависимбсти от различий видов животных. Вещество находит применение в качестве средства для лечения диабе тов. В настоящее время процесс лечения диабетов зависит от инъекции инсулина или введения через рот анти, диабетических лекарственных препаратов, однако при этом лечение является просто симптоматическим, и (как считается в настоящее время) диабеты можно назвать неизлечимым заболеванием. Более того, пациент вынужден ежедневно приходить в больницу для инъекции инсулина, причем в 15 этих случаях введение антидиабетических лекарственных препаратов всегда сопряжено с опасностью вызвать ненормальное отклонение содержания глюкозы в крови от необходимого 20 уровня. Достоинство этого вещества состоит в том, что оно не только само по себе обладает исключительно ценным действием, вызывающим секрецию инсулина, но также характеризу- ,25 ется действием, вызывающим повышение концентрации инсулина в крови . только тогда, когда содержание глюкозы в крови в определенных условиях повышаетая (гипергликемическое состояние, З 0 в особенности при попадании в организм глюкозы, в частности, при приеме пищи), вследствие чего содержание глюкозы в крови быстро возвращается от повышенного к нормальному уровню, кроме того, его действиесохраняется в течение промежуткавремени от нескольких недель до нескольких месяцев после единовременного введения в организм. Таким образом, в том случае, когда секреторная 40 инсулиновая реакция на уровень глюкозы в крови отклоняется, введение этого вещества в организм приводит кнормальной инсулиновой секреторнойактивности, Благодаря таким свойствам это вещество находит более широкое применение, т.е. оно являетсяполезным не только в качестве лекарственного средства для лечениядиабета, его осложнений и старческих заболеваний, порожденных диабетами, но также оказывается эффективным в применении на преддиабетическихстадиях заболевания илйв качествепрофилактического средства, лечеб"ного или диагностического средствана начальной стадии диабета, для которой все еще отсутствуют лекарственные средства.Действие ускоряющее инсулиновую секрецию, предлагаемого биологически 60активного вещества быЛо испытано накрысах-(самцы крыс штамаа И 1 з 1 ат) исобаках (как на самцах, так и самках собак породы ищейка илй коротконогаягончая собака)65 При введении крысам глюкозы, которая является наиболее физиологйЧеским фактором, наблюдали заметное повышение концентрации инсулина в крови по сравнению с тем, что имеет место в контрольной группе животных не" зависимо от пути введения глюкозы в организм. Было также отмечено заметное повышение реакционной способности в отношении стимуляторов гор монав частности глюкогона (1 мг/кг) и эпинефрина (200 мкг/кг). Наблюдали также повышение инсулиновой секреторной активности толбутамида (20 мг/кг) и глибенкламида (мг/кг), которые в настоящее время используют в качестве клинических антидиабетических средств. На основании этих результатов было установлено, что ввецение в организм предлагаемого вещества позволяет заметно улучшить реакционную способность организма на попадание в него стимуляторов инсулиновой секреции.Данные стимулирования реакционнойспособности в отношении различныхстимуляторов инсулиновой секрециив организме крыс, которым предварительно ввели биологически активноевещество, приведены в табл. 7,1 мкг вещества вводят внутривенноза 3 дня до начала эксперимента.В вышеприведенной таблице представлены средние величины и стандартные погрешности (СП) для 5 животных.Биологически активные веществабыли введены внутривенно собакам испустя 3 дня для проверки способности стимулировать инсулиновую секрециюв их организм вводили глюкагон (внутривенной инъекцией в дозировке25 мкг/кг живого веса). За 18 ч доначала эксперимента подопытных животных привязали.Экспериментальные результаты длявведения глюкагона приведены в табл.8.Ускорение, хотя и незначительное,инсулиновой секреции отметили посравнению с контрольными животнымив течение 5 мин после введения глюкагона в дозировке 50 пг (в пересчете на белок)у то же самое во всехостальных случаях, на килограмм живого веса, причем инсулинавая секреция ускорялась пропорциональноувеличению дозировки, достигая практически максимальной степени реакциипри дозировке 1 мкг/кг. Аналогичнуюспособность усиливать инсулиновуюсекреторную активность отметили при.,введении глюкозы (через рот или внутривенной ииъекцией), а также привведении эпйиефрина (см. табл, 9) .Эти результаты показывают, что привведении вещества у собак также на-,блюдается заметное повнаение реакционной способности в отношении стимуляторов инсулиновой секреции.Данные об усилении инсулиновой секреции после введения глюкагона в организм собак, которым предварительно ввели биологически активное вещество БАВ, приведены в табл. 8.Данные об усилении инсулиновой секреции после введения глюкозы и эпинефрина через 5 мин после внутри- венного введения инъекцией в организм собак, которым предварительно ввели ВАВ, приведены в табл. 9.Действие в отношении улучшенияглюкозной толерантности,Глюкозу вводили через рот крысам ,и собакам и производили измерения снижения содержания глюкозы и концентрации инсулина в крови животных для определения глюкоэной толерантности. Глюкозу крысам давали в дозировке 0,5 г/100 г живого веса (крысы). и собакам в дозировке 15 г/животное, причем животных предварительно за 18"20 ч до начала эксперимента привязали.В организме крыс и собак, которым предварительно ввели БАВ, рост концентрации глюкозы в крови заметно подавлялся при одновременном повышении содержания инсулина в крови, однако эта концентрация инсулина быстро вернулась до того уровня, на котором она находилась до введения в организм глюкозы, в соответствии с нормализацией концентрации в крови глюкозы, вследствие чего благодаря усилению секреции инсулина не было отмечено никакого отклонения концентрации глюкозы в крови от нормального уровня(см. табл. 10 и 11). Этн результаты продемонстрировали заметное улучше-. ние глюкозной толерантности у животных, которым ввели БАВ.Йзменения концентрации глюкозы в крови и инсулина в плазме собак после введения в их организм глюкозы .приведены в табл. 10.Животным, которым дали БАВ, в организм вводили внутривенно в дозировке 1 мкг (в пересчете на белок) БАВ/кг за 3 дня до начала эксперимента.Изменения концентрации глюкозы в крови и инсулина в плазме в организме крыс после введения в него глюкозы приведены в табл. 11.Животным,. получившим БАВ, ввели его в организм внутривенно в дозировке 0,5 мкг БАВ эа 3 дня до начала этого эксперимента.Предотвращение диабета, который вызывается стрептоэотоцином, предварительным введением БАВ. Известно, что введение стрептозотоцина в дальнейшем сокращенно называемого СТЗ, вызывает .у экспериментальных .животных диабет за счет заметного разрушения В-клетки:островка Лангерганса. Однако було установлено,что у крыс,которым ввели БАВ, диабет, выэваннййСТЗ, быстро излечивался, а в беспривязном состоянии содержание .глюкозыв крови и глюкозная толерантностьприходили в норму.Эксперимент проводят по такомуметоду, согласно которому в организмкрыс вначале вводят 1 мкг БАВ,а затемспустя 3-5 дней, им вводили СТЗ (идозировке 5 мг/100 г живого веса(ф внутривенной инъекцией). По истечении 24 ч после введения СТЗ гипергликемию наблюдали у животных какконтрольной группы, так и той группы, которой вводили БАВ, однако у)5 животных, которым вводили БАВ, со"держание-глюкозы в крови постепенно достигало нормального уровня напятый и седьмой дни после введенияСТЗ, а кднцентрация инсулина в крови20 была также значительно более высокой,чем у животных контрольной группы(табл. 12).Более того, на седьмой день послевведения СТЗ повторили эксперимент5 с введением в организм животных глю-,козы и исследовали глюкоэную толерантность (табл.13). В этом случае, когдакрысы были привязаны, концентрацияглюкозы в крови становилась, такой жекак для животных контрольной группы(которым вводили только СТЗ), таки для той группы, которым вводилиБАВ, однако у животных контрольнойгруппы наблюдали четко заметное ухудшение глюкоэной толерантности поЗ 5 сравнению с животными нормальнойгруппы.С другой стороны, у животных, ко"торым ввели БАВ, глюкозная. толерантность была улучшена до такой40 степени, что ее можно было сопоставить с глюкоэной толерантностью животных нормальной группы, а содержание инсулина в плазме в ответ навведение в организм глюкозы превыша 45 ло его содержание у -животных нормальной группы. Животные, которым предварительно ввели БАВ,были извлеченыот диабета вызываемого введеннымСТЗВ табл. 12 приведенц данные опредотвращении диабета, вызываемогострептоэотоцином, предварительнымвведением БАВ,Данные об улучшении глюкознойтолерантности при диабете, которыйвызван стрептоэотоцином, предвари"тельным введением БАВ, приведены втабл. 13.улучшение глюкозной толерантностипосредством введения БАВ при само 60 произвольном диабете У ьышей (маньКК), аналогичном диабегу человека.Проводят следующий эксперимент.В качестве подопытных животных дЛяпроведения такого эксперимента ис-65 пользуют мышей КК. Эксперимент про