Способ получения -галактозидазы

Н И ЕНИ ОП ИСАИЗОБРЕ оюз Советских Оциьлистимеских Республик(43) Спубликовано ееудвретваеьФ кенщСеавта Меевтрев СССРа деми езобрвтекейк ьтефтее(088,8) 1 2,7 лет Яо 4 ання описания 1001,78 бя 45) Дат 72) Авторы изобретен Иностранцы и, Харуми Ко и Акира Ка(54) СП ЛУЧЕНИЯ 4( -ГАЛАКТОЗИДА Способ осуществляется, следующимобразом.Продуценты из родаМЫаьаштаммы дЬмЮа с еНекс; ИФО 5874,ЗЬз 1 дааюф 11 етфе ИФО 8 9 84,3 В 5 ст 1 аЬуайозЕищИФО 8082, АЬМд 1 аа,мзоза ИФО 8083, АЬзЖа ВсИЬели"ИФО 4009 или; ЯЬзЖа стсЫФеил 3ИФО 4010 культивируют на питательнойсреде, содержащей источники углерода, азота, минеральные сбли и одрниэ сахаров: мелибиозу, рафиноэу Йлигалактозу в количестве 0,5-1,5 квесу питательной среды, получая прн Ь этом аС -галактозидазу повышенной д 0 активности.В качестве источника углерода дляста мицелия используют глюкозу, вчестве органического источника азокукурузный настой, солод, соловый экстракт, дрожжевой эк рисовую шелуху, рыбную муку и источники неорганического Источники минеральных вещест фат магнйя, фосфат наТрия ристый натрий,К указанным в м добавляют биотин или любой катализатор роста или добавл очник органического азота. устанавлиро ка та до стракт,и маисазота,в - сульи хлоещества другой яют истрН среды эу, рафиночестве О,среды Изобретение относится к тех ке олучения. Ж -галактозидазы, проуцируемой микроорганизмами, и может быть использовано в микробиологической промышленности для получени энзимного препарата, разлагающего ра финозу, содержащуюся в свекловичной мелассе, на галактозу и сахарозу.Известен способ полученя сС галактозидаэы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные солиЕ 1 . Получаемая известным способом 4 -галактозидаза обладает недостаточно высокой активностью. С целью повышения активности е 6-га лактозидаэы согласно предлагаемому способу из продуцентов используют штаммы ,азию ееейвюаИФО 5874, юсиа ееЯЫее(е Ж 8084, ЯЫсЧаИща, ИФО 8082 МеМИа юаИФО 803.3. МЬз 1 ФЬз ЬсЬОеоп(09 или 3 Взййа ЬсМЬе 1 ай10, при этом в питательную среду вводят один из сахаров: мелибиозу или галактозу в коли 5-1, 5 к весу питательной ирмаСайенс энд Текнолоджи584802 Таблица 1 Углевод Единицы а-галактоэидазы ГалактозаЛактозаИелибиозаРафиноэа 14900 53800 14340 37240 П р и м е р 2, Спорами щтаммовдЬэЮо укаэанными вьпае, засеваютразличные порции культуральной среды,,содержащей следующие компоненты,вес.г лактоэа 1; глюкоза 1(ИН 4)уфкукурузный настой 1К НРО О Ъ3Ьц 04,тН,О О,й; 1 щ 0, и СаСО0,3. Культивируют согласно примеру 1. вают 4-8, предпочтительно 5-7. Температура культивирования и период зависят от рода микроорганизма и состава культуральной среды, в случаекультивирования при перемешиваниидостаточно 40-60 час при 30 С.По окончании культивирования мицелий отделяют фильтрованием, промывают водой и измельчают или обрабатываютазтолизом, Извлеченный иэ мицелия энзим моно применять как энэимный препарат.Отфильтрованный мицелий можно добавлять к свекловичной мелассе дляразложения содержащейся в ней рафиноэы. Кроме того, можно мицелий набивать в сосуд и пропускать черезнего свекловичную мелассу для разложения рафиноэы,П р и м е р 1, Сахариды (ксилоза,арабиноэа, рамноза, глюкоза, манноза,фруктоэа., галактоза, мальтоза, целлабиоза, лактоэа, мелибиоэа, сахароза,рафиноза, растворенный крахмал, декстрии) в количестве 1 добавляют кразличным порциям культуральной среды, содержащей компоненты (вес.):глюкоза 1 у кукурузный настой 1РЕ,),ЗО 1;ИНРО, 6,З; МАЗО 7 Н,О ОД;КЛ О,г; ЪСО О,З.Культуральную срему засевают спорами видаф ЯЬзйз 1 а ееЖеха ИФО 5874 икультивируют при взбалтывании 72 часпри 30 фС со скоростью 140 об/мин.Затем отделяют мицелий, промывают еговодой и растирают в ступке с морским Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что при продуцировании а 6 галактозидазы лактоза дает лучший: показатель. песком до получения пасты. После этого суспендируют в воде такого жеобъема, как культуральная жидкость.Далее суспензию, принимаемую эараствор энэима, испытывают на бС-галактозную активность, которая представляет собой энзиматическую активность мицелия, полученного иэ 1 лкультуральной среды, Энзиматическюактивность суспенэии мицелия определяют путем добавления,1 мл суспензиии смеси 0,06 И,мелибиоэы и 0,5 мл0,1 И фосфатного буФерного растворапри рН 5,2 и реагирования в течение2 час при 40 С, последующего нагревания смеси в кипящей водяной банедля инактивирования энзима, добавления к реакционному раствору 1 мл1,8-ного На(он), Ен,о и 1 мп 2-ногоЕвЬО 7 Н О для"удаления протеина, Ю центрифугирования раствора и испытания его верхнего слоя на содержаниеглюкозы, С учетом пропорциональной зависимости содержания глюкозы, освобождаемой иэ мелибиоэы, и концентрация ЯБ энэима от содержания 1000 мкг глюкозы сусгензию заранее разбавляют дляпопадания в предел измерения, удовлетворяющий этой зависимости. Количество свободной глюкозы умножаютна число разбавления, Ф -галактозидаэную активность, освобождающую1 мкг глюкозы в указанных условиях,принимают за единицу.Данные определения продуцирования4 -галактозидазы приведены в табл,1 Полученные культуральные растворыиспытывают на а(,-галактозидазную и яя инвертазную активность мицелия, Инвертазную активность определяют путем смешивания 1 мл суспенэии мицелияс 0,5 мл 0,06 И сахарозы и 0,5 млфосфатного буфера при рН 5 и реагирования при тех же условиях, как приопределении цС -галактозидаэной активности. Затем раствор центрифугируютдля удаления протеина и в верхнемслое определяют содержание инверторного сахара по методу Сомолжи-Нельсобф на.,40 6571 4 х 10 9000 514 х 10ЗООх 104 207 х 10 1,40 642 72 646 000 9000 1,40 21 150 аблнца Единицы о -галактозидктивностн рН культуральногораствора 80 20 1990 3120 456 6,1 54500 59300 Зб 5,8 40 42 2700 63000 5,8 Инвертазную активность, продуцирующую 1 мкг сахара в указанных условиях, принимают за единицу,Сухой вес мицелия определяют послесушки при 105 С количества мицелия,Для сравнения культивировали споры МоеОвееИа чИюсса и полученный раствор испытывали, при этом установили, что штамм рода МЬМд 1 а обладает большей еС -галактоэидазной активностью и более низкой инвертазной активностью. 38Для штамма Майа ю-галактоэидазная активность, которой обладает 1 г сухого мицелия, больше инвертаэной активности, адля штаммаАЬвйееейа мйюссе - инвертазная активность 40 больше ОС -галактозидаэной.П р и м е р 3, В 10 л воды растворяют (г) 120 глюкозы 1 3 20 (ЙЙ 411 ф 04 ю ремя культивирования,выросшего в 100 мл культуральной сре-.ды,Данные определения приведены втабл, 2,Таблица 2 120 кукурузного настоя 1 36 Н РО ,24 МЯ 0 ЧН О,;24 ЙаСЕ и 36 СаСО Раствор помещают в ферментатор и стернлиэуют 30 мин при 120 С, затем охлаждают до 30 С и разбавляют стерилизованной дистиллированной водой до общего объема 12 л. В растворе культивируют штамм ЗЬяс 6 а юИеха Ифо 5874 при перемешивании со скоростью ЗОР об/мин и пропускании воздуха 3 л/мин, Затем отбирают образцы проб и испытывают на 4(, -галактозидаэную активность и рН культурального раствора.Данные испытаний приведены в табл,ЗТ а б л и ц а 4 рВ культуральногораствора Время культивирования, мин 5 в 80 5,50 5,20 134 6,40 1240 6,50 4030 6,60 19360 51360 68500 69000 Из результатов табл. 3 видно, что для штамма ЯЬейо 1 фИЕехб ИФО 5874 достаточно 42 час культивирования, Яо окончании 42 час культивирования вес сухого мицелия, полученного иэ 100 мл культуральной среды, составляет 1,36 г. 4 э данных табл. 4 видно, чтс для щтавиа, ЯЬм Иа ЬЬэрой ИФО 8082 достаточно 54 час культивирования, при этом вес .сухого мицелия, полученного иэ 100 мл культуральной среды, сос я тавляет 1,35 г.Следующие далее примеры характе риэуют применение знэима для разложения раФинозы.П р и м е р 5, Мелассу (СтеФфена) 80 разбавляют водой до 30 Врикса и добавкой серной кислоты рН доводятдо 5 е 2В 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафйноэы, добавляют мицелий ЯЬМдаз Ф%КзкаИФО 5874 с сухим весом 2,9 г и 17410 ед галактозидазной активности, полученный согласно примеру 2, дают реагировать при 50"С и перемещивании в течение 2 час 30 мин. По окончании реакции ф мнцелий отделяют ФильтРованием и промывают водой, Фильтрат и промывные воды объединяют.Определенный объем этой смеси испытывают хроматографией на бумаге на 66 П р и м е р 4. Штамм МЬМсйо Ьцо йоэроа ИФО 8082 культивируют соглас- но примеру 3, затем определяют зависимость между длительностью культивирования и количеством образовавшейся о(, -галактозидазы.Данные опытов приведены в табл.4. Единицы А-галактозидазы содержание остаточной рафинозы и сахаровы, для чего образцы проявляют врастворителе, содержащем,(ч,) б н-бу.тайола, 4 пиридина и 3 воды. ФракциираФиноэы и сахарозы промывают и испытывают по цистеинкарбазольному про,.цессу, при этом устанавливают, что78 от первоначального содержания рафинозы разлагается, а содержание сахарозы увеличивается на 2,41 г..П р и м е р б. Иицелию ЯЬвйЖа уеЮеха ИФО 5874 с 174 10 фед оС-галактозидазной активности, полученному согласно примеру 5, дают реагировать с 200 г мелассы, разбавленной до 30 Брикса и приготовленной согласно примеру 5. После реакции мицелий проваювают водой н добавляют к новой порции мелассы. Таким образом мицелий используют для пяти обработок. Полученные разложенные растворы испытывают на содержание остаточной рафинозы и на содержание сахарозы.Данные испытаний приведены в табл. 5.584802 Таблица 5 Номеррастворапослеобработки Степеньразложениярафиноэы, Ъ Увеличениеколичествасахарозы, г 90 78,5 2,48 79,0 2 у 58 86 77,8 2,41 86 76,0 2,37 75,1 2,41 Таблица б Оптическая плотнопри длине волны,0,4 0,0,43 48 280,30 чи обеспего препарата -галактоэииженной инединицу веса разложения свекловичнойсахароэу, и эы. 6 ледует, что в родов мицелия актоэидазнойия рафиноэы ыделяемого е ЭЪьыйо анных табприменениковой Сстью длятво компо случаес одинаактивноколичесмицелие1 еЮехсПредгалакт У разложеннента, вменьше в случаИФО 5874.агаемый способзидазы по сравн получения ов ению с иэвестП р и м е р 7. Мелассу Стеффенаразбавляют до 50 Брикса и Доводятсерной кислотой рН до 5,2.В 200 г этого раствора, содержащего 9,66 г рафинозы, добавляют мицелийМЬис 6 о жйеха ИФО 5874 с сухим весом 6,5 г и 289810"ед юС-галактозидазной активности, полученныйсогласно примеру 2. По окончании реакции определяют степень разложениярафиноэы и увеличение содержания сахароэы, которые равны соответственно56,2 и 3,03 г,П р и м е р 8. В 100 мл мелассы,содержащей 3 87 г рафинозы и разбавленной до 50 Брикса, с рН 5,2 добавляют мицелий ЛЫсйа таею ИФО 5874 Остающаяся сС-галактоэидаэная активность, % с сухим весом 1,74 г и 775 10 федф -галактоэидаэной активности при50 фС в течение 10 час.По окончании разложения компонент, ф 8 выделенный мицелием, разбавляют водой1:1000 и испытывают при длине волн260 и 280 нм на оптическую плотность.В таком же растворе мелассы прианалогичных условиях подвергают реак- ЗО ции мицелий МоейеоеОа вессисухимвесом 3,730 г и 77410 фед 4 С -галактозидаэной активности, Разложенныйраствор испытывают на оптическую плотность при 260 и 280 нм. Контрольным 36 образцов служит меласса с неизменными свойствамиДанные испытаний приведены в табл.б ныл решением той же эадчивает получение энзимнс достаточно высокой р,дазной активностью и повертаэной активностью нэнэимного препарата длярафиноэы, содержащейсямелассе, на галактоэу и65 увеличение выхода сахар584802 12 формула изобретения Составитель Т, СеребренниковаТехред М.Келемеш Корректор Е. Папп,Редактор Е. Корина Заказ 4628/721 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ получения -галактозндазы путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повыаения .активности 4,-,галактоэидаэы, иэ продуцентов используют штаммы . ЗЬеЬМа вейвса ИФО 5874 МЬЗЬИа жфюеючв- ИФО 8084, ЗЬв 1 сИа, ЪЫврщфаИФО 8082,ЗЬЫМа ффсипоза .ИФО 8083, Юъ 1 сИаБсЖЬеип 1 ИФО 4009 или АЬыда ЙаИ 1 Нещ ИФО 4010, при этом в питательную среду вводят один из сахаров:мелибиозу, рафиноэу или галактозу вколичестве 0,5-1,5 В к весу питательной среды. Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:1. Патент США В 3647625, кл,195-11, 07.0372