Способ получения бактериального пирогена

ную мембрану с размером пор 10-20 А,удельной поверхностью пор 10001200 м /г и толщиной 016-0,20 мм,предварительно промытую хлороформ 5метанольной смесью (2:1) для обезжиривания, упаривания при 308 с использованием жидкого азота, ультрацентрифугированием в режиме: 108000 я, 1 ч,три раза, с последующей лиофильнойсушкой полученных продуктов.П р и м е р. Проводят генетическую рекомбинацию бактерий с использованием донора Е.со 11 НггН (Я ),(зг,г"., шоп", пео"), реципиента .зЬ.Е 1 ехпег 1 У 737 тип 2 а (зг , шопф,пео), Получают половые гибриды (генетические рекомбинаты) шигелл Флекснера и зшерихий НХгН ), три штамма:В;737-2, К-4 и К-,737-6, которые 20обладают одинаковыми биологическимихарактеристиками; грамотрицательным, неподвижны, устойчивы как к стрептоьицину, так и к антибиотикам резерва (зсг, шоп, пео ), активны в отношении к лактозе, что используют вместе со стрептомицинрезистентностью какважный селективный признак для отбо 1 ра рекомбинантов. По вирулентности половые рекомбинаты следуют за реципи-уентной культурой ЯЬ, Л.ехпегх В 737серотин 2 а (Жзо составляет 133"47 млн.микробных тел), Так как все три штамма рекомбинантов имеют близкие биологические характеристики,то для дальнейших исследований отьирают К-4, отличаншийся наиболее высокой стабильностью морфотинкториальных н биохимических показателей.Биомассу бактериальных культурвыращивают на стандартных плотныхсредах МПА одной серии изготовления.Отмыв культур от остатков среды производят раствором натрия хлорида смассовой долей 0,5 ОЖ до отрицательной реакции с нингидрином. Чистотувыросших колоний проверяют микроскопическим путем. Биомассу бактерийвысушивают на воздухе, удаляют клеточные липиды.50Остаток биомассы лиофильно высушивают, делят на три равные части и1суспендируют каждую в дистиллированной воде при 370 С, затем каждую пор цию обрабатывают фенолводной смесью55 (1:2 7/7)с использованием свежеперегф фйнанного фенола при 65-70 С(5 раз),полу" ченные экстракты объединяют и центрифу гируют (3000 о б/мин) диализ уют че ре з пергаментную бумажнр мембрану сразмером пор 10-20 А, удельной поверхностью пор 1000-1200 м/г и толщиной 0,16-0,2 С мм, предварительнообезжиренную хлороформ-метанольнойсмесью (21) в течение 3 сут, меняяводу через каждые 6 ч, упаривают наротЬрном испарителе с использованиемжидкого азота (Т=ЗО С), полученныеэкстракты центрифугируют в следующемрежиме: 108000 з, 1 ч, 3 раза. Полученные продукты лиофилизуют, Выходрассчитывают по данным весового анализа.Общая характеристика состава АПС иих выхода у генетических рекомбинангов и исходных культур донора и редсципиента дано в табл.Выход ЛПС наибольший у половыхгибридов (табл. 1). ЛПС каждой изкультур гидролизуют 17.-ной уксуснойкислотой (50 мл, 2 ч. 100 С) в запаянных ампулах. Переосаждение липида А производят пятикратным объемомацетона.Липид А (10 мг) гидролизуют соляной кислотой (С (1/1 НС 1)=4 моль/л;12 ч; 100 С) в запаянных стеклянных ампулах, Жирные кислоты экстрагируют хлороформом с последующим упариванием и метилированием диазометаном. Проводят контроль чистоты фракции метиловых эфиров. Газожидкостную хроматографию проводят, используя хроматограф с пламенно-ионизационным детектором при условиях: колонка 0,5 см х 35 м., температура колонны 180 С, Фаза Яр. Хроматомасс"спектрометрию метиловых эфировЖК ведут на приборе (колонка та же).Осуществляют интерпретацию массспектров, Определяют общее содержание белка в ЛПС, нуклеиновых кислот,нейтральных моносахаридов Фенолсернокислым методом, находят содержание, кетодезоксиоктоновой кислоты (КДО);рассчйтывают массовую долю суммарного Фосфора в ЛПС. Фенола в препаратах не обнаруживают.Полученные данные статистическиобрабатывают с учетом распределенияСтьюдента-Фишера,После выхода пирогенной кривой на режим пирогенала производят сравнительное изучение действия ЛПС в зависимости от источника и дозы препарата. Данные статистически обра1640165 6 Формула изо бре тения"Способ получения бактериальногопиро гена р предусматрив зющий э к с тракцию пирогена из бактерий с последующим диализом в течение 3 сут,. ультрацентрифугированием и лиофилизациейцелевого продукта, о т л и ч а ю - 10 щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, пироген экстрагируют из генетических рекомбинантов шигелл Флекснера н ЕзЬегхсЫа со 1 х НггНИ ) 33-ной воднофенольной смесью при 70 С послепредварительного суспендирования вдистиллированной воде, а диализ осуществляют через обезжиренную пергаментную бумагу с размером пор 10- 20 20 А, удельной поверхностью пор 10001200 м 9 г и толщиной 0,16-0,20 ммсо сменой диализной воды через 6 ч. Та блиц а 1 компонентов (М + в), Ж Компонент Содержание Реципиент ЗЬ.Еехпегь В 737 тип 2 а Донор з. НйгНф не тискийкомЕ. инант 1,49+0,2121,001,62 1,82+0,1036,0031,49,70+0,50 37,800,45 21,2 Щ 0,40 ,8010,25 61,70 т 0,38 72,20+1,73 ,04+2,48 45,96+1,58 48,66+2,33 5батывают с учетом распределения Стьюдента-Фишера.Полученные результаты свидетельствуют о том, что половые гибриды являются более лучшими зндопродуцентами ЛПС, чем исходные зшерихии (в 2 раза) Е.со 1 НЕгН(3 ) и шигеллы. Средняя температура режима пирогенного эффекта у ЛПС гибридов составляет 40,5 фС при 40,0 С у пирогенала.Содержание жирных кислот и углеводов в липиде А генетических реком,бинантов и исходных культур-донора и реципиента приведено в табл. 2.Таким образом, предлагаемый способ получения бактериального пирогена является новым и на основании биотестирования обладает температурой и временной компонентой пирогенного эффекта, свидетельствующей о его усилении в сравнении с пироге налом. стическая достоверност О 05 (0,05О 05 0,05 с 0,05 0,05 0,001 с.0,001 с 0,001