Способ получения препарата для определения моноаминов на основе иммобилизованной моноаминооксидазы

СОЮЗ СОВЕТСОЦИАЛ ИСТИЧРЕСПУБЛИК 12 С 01 М 33/50 14 С 12 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ в химическом, клиническом и токсилогическом анализе. Цель изобретенияулучшение характеристик препаратадпя определения моноаминов за счетповышения активности моноаминооксидазы, механической прочности и антимикробных свойств пленки. Способзаключается во введении ферментногопрепарата с моноаминооксидазной активностью (гомогенат митохондрий печени) в водный раствор желатина споследующим добавлением террилитинав количестве 1-10 протеолитическихединиц на 1 мл суспензии, немедленном нанесении суспензии на нерастворимую подложку, высушивании суспензиина воздухе и обработке полученнойпленки в течение 3-5 мин глутаровымальдегидом. Полученный препарат обладает повышенными механической прочностью и антимикробными свойствами,а также в 1,5 раза более высокой активностью моноаминооксидазы. 1 з,п.ф-лы, 2 табл. дственно твийский и су им. П. Стучки А. Гринберг Никольская, В, Ягодина Б ССР983.е 1 есйидетельство 211/12,Ап епкуше осЬдш АсйаАТА ДЛЯ НОВЕ ИМДАЗЫбиотехию иммоки и фер ение при а также Способ заключ ферментного преп митохондрий пече желатина с после террилитина в ко олитических един суспензии, неме лученной суспенз подложку, высуши воздухе и обрабо ки глутаровым ал тельно в течение тке полученнои пленьдегидом (предпочти-5 мин)Введение одит к частичному террилитина п ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ НА ОМОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОАМИНООКСИ(57) Изобретение относитсянологии, а именно к полученбипизованных органоидов клементов, и может найти примеполучении биокатализаторов,Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области получения иммобилизованных органоидов клетки и ферментов, и может найти применение при получении биокатализаторов, а также в химическом, клиническом и токсикологическом анализе.Целью изобретения является улучшение характеристик препарата дпя определения моноаминов за счет повьг шения активности моноаминооксидазы (МАО), механической прочности и антимикробных свойств пленки. ается во введенииарата (гомогенатани) в водный раствор дующим добавлениемличестве 1-10 протеиц на 1 мл объемадленном нанесении по- ф ии на нерастворимую дфоп ванин суспензии на3 149537разрушению митохондриальных мембран,что увеличивает активность моноаминооксидазы. Кратковременность воздействия террилитина на моноаминооксидазу(до высушивания пленки) позволяет избежать ее инактивации за счет протеолиза. Способ позволяет получить целевой продукт с улучшенными характеристиками: активность иммобилизованноймоноаминооксидазы возрастает в 1,5 раза, увеличивается также прочностьпленки и ее бактериостатическое действие,П р и м е р 1. 0,2 г желатина 5помещают в стаканчик с 4 мл дистиллированной воды для набуханияЗатемтуда же добавляют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают приперемешивании дополного растворения 20желатина. Далее раствор охлаждают доо+25 С и вносят в него 2 г гомогенатамитохондрий печени свиньи в 0,05 Мфосфатном буфере, рН 7,4 и перемешивают. К полученной суспензии добавляют 1 мл раствора террилитина в водес суммарной активностью 10 протеолитических единиц (ПЕ), т,е. 1 ПЕ/1 млсостава. Смесь немедленно порциями по5 мл выпивают на ровную поверхность 30полиэтиленовой пластины и высушиваютв потоке воздуха в течение 1,5 ч. Су,хую пленку желатина обрабатывают1 О мл 2 Х-ного раствора глутаровогоальдегида (ГА) в течение 3 мин. После 35этого избыток раствора ГА сливают, апленку многократно промывают водой и0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4, иснова высушивают в потоке воздуха втечение 1 ч. Сухие препараты хранят 40ов холодильнике при 4-10 С. МАО активность диагностического препарата:6,83 10 Е/мг белка (по тирамину)-Ф5,60 10 Е/мг белка (по серотонину); 454,65 10 Е/мг белка (по бензиламину).Активность препарата сохраняется втечение года.Бактериостатическая активность.Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой полученногодиагностического препарата по сравнению с контролем 86,4 Е.Механическая сохранность в условиях многократного использования:препарат стабилен в 50 циклах работы.Один цикл работы - пять дней по пятьопределений в день. После каждого 8 4цикла работы препарат высушивается на воздухе и взвешивается.Характеристики препаратов приведены в табл, 1,За единицу протелитической активности террилитина принято такое количество фермента, которое расщепляет 1 1 моль субстрата за 1 мин при +25 С и рН 7,0.П р и м е р 2. 0,7 г желатина обливают 4 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 1 г гомогената митохондрий печени свиньи в 0,07 М фосфатном буфере, рН 7,4. К полученной суспензии добавляют 1 мл раствора террилитина в воде с активностью 100 ПЕ, т.е. 10 ПЕ/1 мл. Немедленно из полученной смеси 5 мл выливают на алюминиевую фольгу, 5 мл - на кафель, на котором натянута капроновая сетка, и сушат в потоке воздуха в течение 2 ч. Сухую пленку в обоих случаях обрабатывают 5 мл 87,-ного раствора ГА в течение 5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленки многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5. Капроновую сетку с желатиновой пленкой осторожно снимают с поверхности кафеля. Обе пленки высушивают в потоке воздуха при +25 С в течение 1 ч.МАО активность диагностического препарата:6,8510 Е/мг белка (по тирамину);5,501 О Е/мг белка (по серото-Онину);4,52 10 Е/мг белка (по бензипамину).Бактериостатическая активность. Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 86, ОХ, Препарат стабилен в 50 циклах работы.П риме р 3. 0,5 г желатина обливают 4 мп дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 5 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина, Дао лее раствор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 г го 1495378могената митохондрий печени крысы(40 мг белка) в 0,07 М Фосфатном буФере, рН 7,4. К полученному растворудобавляют 1 мл раствора террилитинав воде с суммарной активностью 50 ПЕ,т.е. 5 ПЕ/1 мл. Смесь перемешиваюти по 5 мл выливают на полимернуюмембрану и капроновую сетку, натянутую на кафель, и высушивают в потокеовоздуха при 20 С в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают 5 мл 87"ногораствора ГА в течение 4 мин, Послеэтого избыток ГА сливают, а пленкумногократно промывают водой и 0,05 МФосфатным буфером, рН 7,5. Капроновую сетку с желатиновой пленкой снимают с поверхности кафеля. Пленкиовысушивают в потоке воздуха при +25 Св течение 1 ч.МАО активность полученного диагностического препарата:6,76 1 О Е/мг белка (по тирамину);-45,62 АЙ 0 Е/мг белка (по серотонину);4,71 10 Е/мг белка (по бензиламину)Бактериостатическая активность.Задержка роста культуры кишечной палочки в пробах с пленкой диагностического препарата по сравнению с контролем без пленки 85,9 Е,Препарат стабилен в 50 циклах работы,П р и м е р 4. 0,8 г желатина обливают 9 мл воды для набухания. Затем добавляют 10 мл Фосфатного буфера с рН 7,4 и нагревают при перемешивании до растворения. Далее растовор охлаждают до +20 С и вносят в него при перемешивании 2 г суспензии митохондрий в фосфатном буфере, рН 7,4. К полученному раствору до-. бавляют 1 мл раствора террилитина в воде с суммарной концентрацией 10 ПЕ, т.е. 0,5 ПЕ/1 мл, Смесь перемешивают, и выливают на полимерной мембране. Высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч. Сухую пленку обрабатывают раствором ГА в течение 2 мин и промывают аналогично примеру 3.МАО активность диагностического препарата.4,55 1 О Е/мг белка (по тирамину);3,7 10 Е/мг белка (по серотонину);3,1 10 Е/мг белка (по бензиламину)Бактериостатическая активность.Задержка роста культуры в пробах спленкой по сравнению с контролем74,2 Х.. Препарат пригоден для 20 цикловработы,П р и м е р 5. ,6 г желатинаобливают 15,6 мл воды для набухания.Затем добавляют 20 мл О, 05 М Фосфатного буфера, рН 7,4 и нагревают приперемешивании до растворения. Далееораствор охлаждают до +20 С и вносятв него при перемешивании 4 г суспензии митохондрий в Фосфатном буфере,рН 7,4. К полученному раствору добавляют 4,4 мл раствора террилитина вводе с суммарной протеолитической активностью, равной 440 единиц, т,е.20 11 ПЕ/1 мл. Смесь перемешивают и выливают на нерастворимую подложку.Высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч, Сухую пленку обрабатывают8 -ным раствором ГА в течение 6 мин25 и промывают.МАО активность диагностическогопрепарата:4,50 1 О Е/мг белка (по тирамину);3,7210 Е/мг белка (по серото нину);3,210 Е/мг белка (по бензиламинУ).Бактериостатическая активность.Задержка роста культуры в пробах спленкой по сравнению с контролем35 67 УПленка имеет жесткую структуру,что проявляется как повышенная хрупкость, Препарат расслаивается после40 18-20 циклов работы.П р и м е р 6. 0,2 г желатинапомещают в пробирку с 2 мл дистиллированной воды для набухания. Затемтуда же добавляют 1 мл стандартного45 фосфатного буфера, рН 6,86, нагрева. ют, перемешивая до кипения, при котором происходит полное растворениежелатина, Далее раствор охлаждаютодо +35 С и вносят в него при переме 50 шивании 0,4 мл гомогената митохондрий печени крыс (таких же, как впримере 3). Добавляют 1,6 мл раствора террилитина с активностью 50 ПЕ,Затем в пробирку со смесью опускают55чувствительную головку электрода,слегка подсушивают (1 мин) его воструе воздуха при +20 С и снопа опускают в раствор, Операцию повторяют5 раз, после чего высушивают пленкуна поверхности электрода в струе воздуха в течение 15 мин при +20 С. Далее электрод с сухой пленкой опускают на 4 мин в 5%-ный раствор глутарового альдегида, Затем вынимают электрод и тщательно промывают его водой и фосфатным буфером. Йоверхность электрода с планкой высушивают воструе воздуха при +20 С в течение 15 мин и хранят в холодипьнике при 4-10 С. Для градуировки и в период работы электрод вымачивают в фосфатном буфере при рН 7,4 и хранят в нем в холодильнике.МАО активность электрода:6,7 10 Е/мг белка (по триамину);5,45 10 Е/мг белка (по серото - Фнину);4,0, 10 Е/мг белка (но бензиламину).МАО активность электрода сохраняется в течение года. Желатиновая пленка на электроде механически стабильна в условиях использования и может применяться для определения моноаминов в течение года. Предел обнаружения 4,5510моль/л.Бактериостатическая характеристика пленки на электроде аналогична примерам 1, 2, 3.МАО активность диагностического препарата в Е/мг, т.е. смоль/мг белка по всем субстратам определяют электрохимическим методом с помощью электрода с газовым затвором по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции - аммиака,Бактериостатическую активность определяют и рассчитывают по задеркке роста культуры кишечной палочки . в присутствии желатиновых пленок без добавок, с. добавкой МАО и с добавкой МАО и террилитина. Для этих проб по сравнению с контролем задержка составляет соответственно 57, 75 и 86 . Предел обнаружения моноаминов спомощью полученных препаратов МАОсоставляет 4,4 10- 4,5510 М.Значительно возрастает активностьцелевого продукта по всем субстратамза счет добавления террилитина прииммобилизации (табл. 1), Улучшаютсятакже механические свойства пленок,что позволяет длительно использоватьих для проведения анализа.Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получитьпрепараты пленок для определения мо-.ноаминов с улучшенными характеристиками за .счет повышения активностиМАО в 1,5 раза, увеличения механической прочности пленок и их антимикробного действия (от 75 до 86 ).20 формула изобретений1. Способ получения препарата дляопределения моноаминов на основе.иммобилизованной моноаминооксидазы,включающий введение гомогената мито хондрий, обладаюцих активностью моноаминооксидазы, в водный раствор желатина получение желатиновой пленкипутем высушивания нанесенного на нерастворимую подложку раствора желати на и обработку полученной пленки глутаровым альдегидом, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью улучшения характеристик препарата засчет повышения активности моноаминооксидазы, механической прочности иантимикробных свойств пленки, послевведения гомогената митохондрий вводный раствор желатина к полученнойсуспензии добавляют террилитин в ко личестве 1-10 протеолитических единицна 1 мл обьема и полученную смесь немедленно наносят на нерастворимуюподложку.2. Способ по п. 1, о т ли чав 45 ю щ н й с я тем, что обработкупленки глутаровым альдегидом ведут втечение 3-5 мин.по тирамину по серото- нину Препарат с МАО активностью (без террилитина)Предлагаемый диагностический препарат с МАОактивностью (содержацийтеррилитин) 3,7 ю 1 О 3,1 10" 4,5510 1600 5,61 Ь 4,6 1 О 6,810 2400 Т а блица 2 Образец 4 0 0 0 чальный Препарат с МАО активностью (без террилитина)Подпи Тираж 50 аказ 4217 открытиям при ГКНТ СССР НИИПИ осударственного комитета по изобретениям и 113035, Москва, Ж, Раушская наб ельский комбинат "Патент", г.ужгород,гарина,1 Производственно Предлагаеностическрат с МАОстью: Активность, смоль/мг Активность по бензиламину белка с воздушносухого препарата, мг после количествациклов