Способ отбора мутантов бактерий, неспособных к синтезу нуклеаз

(19) (11) 51) 4 С 12 И 15 1 - 13 абатян и толуидипри 37 С Спо культур ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТ:ТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) ЛеНг 1 ея С. О Но 1 гшап Э. Р.,Сове П. Т. Кардд ше 1)ой аког йеСегш 1 пдп 8 г 1)е асг 1 ч 1 гу ог ш 1 сгоогяап 1 яшяоп пцс 1 е 1 с асиля. - 3. Васег 1 о 1,1957, ч, 73, Р 4, р. 590-591,БсЬге 1 ег .). В, Мой 1 йсаг 1 оп оЕйеохугдЬопцс 1 еаяе геяг шей 1 цп) ЕоггарЫ 1 йепг 1 Е 1 саг 1 оп оЕ Беггог 1 ашагсеясепя. - Ашег 1 сап 3. С 1 дп 1 са 1раг 1)о 1 о 8 у, В.Я, МТ (АББР) 969,ч.51,У 6, р. 711-716.(54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ БАКТЕРИЙ,НЕ СПОСОБНЫХ К СИНТЕЗУ НУКЛЕАЗ(57) Изобретение относится к способамотбора мутантов микроорганизмов и моИзобретение относится к способам отбора мутантов микроорганизмов, не способных к синтезу биологически ак- тивных веществ, и может быть применено в микробиологии, генетике, биотехнологии, биохимии.Подобные мутанты могут быть продуцентами ценных ферментов, например, рестриктаз и не должны при этом обладать примесными нуклеазами.Цель изобретения - повьппение чувствительности способа отбора мутантов. заключается в том, чтактерий обрабатывают жет быть применено в микробиологии,генетике, биотехнологии и биохимии.С целью повышения чувствительностиспособа отбора мутантов бактерийЕясЬег).сЬ 1 а со 11 и Беггага шагсеясепя, не способных к синтезу нуклеазобработанные мутагеном культуры выращивают на индикаторной среде в течение 18-24 ч при 37 С, содержащей нуклеиновую кислоту и толуидиновый синий. После этого выросшие колонииобрабатывают хлороформом в течение3-5 мин, удаляют хлороформ и инкубируют культуры дополнительно в течение18-24 ч при той же температуре, затем регистрируют наличие розовых зонгидролиза ДНК под действием внутри -клеточных нуклеаз. Возможность определения секретируемых и внутриклеточных нуклеаз повышает чувствительностьспособа отбора мутантов, не способных ксинтезу этих ферментов. еном и культивируют на твердодикаторной среде, содержащей н овую кислоту и краситель овый синий, в течение 18 ч и регистрируют розовые зоны гидролиза ДНК под действием секретируемыхнуклеаз, после чего выросшие колонииобрабатывают хлороформом в течение 35 мин, удаляют хлороформ и инкубируютдополнительно в течение 18-24 ч притой же температуре, затем регистрируют наличие розовых зон гидролиза ДНКпод действием внутриклеточных нуклеаз.индикаторную среду, соответствующуюсреде в примере 1, и инкубируют 20 чпри 32 С, Поверхность твердой средызаливают хлороформом и инкубируют3 мин при комнатной температуре, Хлороформ сливают, чашки подсушивают иинкубируют дополнительно 18 ч при032 С. Регистрируют увеличение зонгидролиза ДНК вокруг колоний, клетокБеггага шагсезсепз, секретирувщихнуклеазы. Вокруг колоний мутантов,дефектных по синтезу секретируемыхнуклеаз, розовые зоны не регистрируются или они.значительно меньше поразмеру. Колонии мутантов отсевавтна полнув среду,Вокруг штрихов 4, 5, б клеток различных штаммов Е. со 11 (К 12 сР 63,К 12 НВ 101, В), синтезирующих нуклеазы, отсутствуют зоны гидролиза ДНК.,Обработка штрихов клеток хлороформомвызывает высвобождение нуклеаз в 3 1495379Используемый в предлагаемом способе мутаген . - Х-метил-И-нитро-М-нитрозогуанидин может быть заменен мутагеном любого типа.5Штаммы исходных культур Е. со 11 1312, 151, 1182, Е. со 11 К 12 сР 63, К 12 НВ 101 и Е. со 11 В, а также исходный штамм Б. шагсезсепз дикого типа хранятся в коллекции на кафедре гене тики и селекции Биологического факультета МГУ.П р и м е р 1, Обработанные/мутагеном И-метил-И-нитро-М-нитроз огуанидином клетки Е. со 11. высевают на индикаторнув среду, содержащую, г/л: толуидиновый синий 0,16; МаС 1 5,0; ДНК 0,3; трис,05; бактотриптон 5,0; дрожжевой экстракт 3,0; МЯЯ 04 х НО 2, 46", глюкоз а 4, 0; агар 20 "Дифко" (Боо 1 е) 15,0, рН 7,6-7,8, и инкубируют 18 ч при 37 С, Поверхность твердой среды заливают хлороформом и инкубируют 3 мин, Хлороформы сливают, чашки подсушивают до полного удаления 25 хлороформа в приоткрытом виде 5 мин и и затем инкубирувт дополнительно 18 ч при 37 С. Регистрируют вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, розовые зоны на темно синем фоне индикаторной среды, Вокруг колоний клеток мутантов, дефектных по синтезу этих ферментов, розовые зоны не регистрируются или значительно меньше по размеру. Колонии мутантов отсевавт на полную среду.П р и м е р 2. Обработанные .мутагеном, указанным в примере 1, клетки Е. со 11 высевают на индикаторную среду, соответствувщую среде, описан ной в примере 1, Поверхность твердой среды заливают хлороформом и инкубирувт 5 мин. Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа, затем инкубируют 24 ч при 45 370 С, Регистрируют вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, розовые зоны на темно-синем фоне индикаторной среды, Вокруг колоний клеток мутантов, дефектных по ,синтезу этих ферментов, розовые зоны .не регистрируются или значительно меньше по размеру. Колонии мутантов отсевают на полную среду.П р и м е р 3, Обработанные мутагеном, указанным в примере 1, клетки Е. со 11 высевавт на индикаторную среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируит 428 ч при 37 С, Колонии обрабатывают хлороформом и инкубируит 8 мин, Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа и инкубируют 28 ч при 3 С. Регистрируют розовые зоны вокруг колоний микроорганизмов, однако отбор жизнеспособных клеток колоний невозможен из-за гибеЛи клеток.П р и м е р 4. Обработанные мутагеном, указанным в примере 1, клетки Е, со 1 высевают на индикаторную среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируют 16 чопри 37 С. Колонии обрабатывавт хлороформом и инкубируит 1 мин. Хлороформ сливают, чашки подсушивают до полного удаления хлороформа и инкубирувт 16 ч при 37 С, Розовые зоны вокруг колоний клеток, синтезирующих дезоксирибонуклеазы, практически отсутствуют, что делает невозможным отбор мутантов, неспособных к синтезу дезоксирибонуклеаз.П р и м е р 5. Обработанные названным в примере 1 мутагеном клетки Е. со 1 высевают на индикаторную среду, соответствующую среде, приведенной в примере 1, и инкубируит 18 ч при 29 С,.Рост бактерий практически отсутствует, вследствие этого последующая обработка хлороформа невозможна.П р и м е р б, Обработанные мутагеном, указанным в примере 1, клетки Яеггаг 1 а шагсезсепз высевают наЗаказ 4217/2 б Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 1495379 6среду и образование зон гидролиза, тем обработки исходных культур мутаЗоны гидролиза отсутствуют вокруг . геном и последующего культивирования штрихов 1, 2, 3 клеток мутантов Е. со- клеток на индикаторной среде в тече К 12 (1312, 1511, 1182), дефектныхние 18-24 ч при 37 С, содержащей испо эндонуклеазе 1, независимо от об- точники роста, нуклеиновую кислоту и работки хлороформом. толуидиновый сииии и регистрациейИспользование хлороформа для об- розовых зон гидролиза нуклеиновой работки клеток, выращенных на инди- кислоты вокруг колоний, о т л и - каторной среде, позволяет одновремен ч а ю щ и й с я тем, что, с целью но определять внутриклеточные и сек- .повышения чувствительности способа, ретируемые бактериями нуклеазы, что выросшие на индикаторной среде колоповышает чувствительность способа от- нии обрабатывают хлороформом в тече- бора мутантов, не способных к синтезу ние от 3 до 5 мин с поспедующим его нуклеаз. удалением и дополнительно инкубируют ф о р м у л а и з о б р е т е н и я колонии до появления эон гидролизаСпособ отбора мутантов бактерий, нуклеиновой кислоты под действием .не способных к синтезу нуклеаз, пу" внутриклеточных нуклеаз.